Summary
Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. C'est une technique fiable, basé sur l'interaction entre les billes magnétiques et les protéines marquées (par exemple nanocorps) d'une part et l'affinité entre la protéine marqué et une seconde, protéine marquée (poliovirus, par exemple) sur l'autre.
Abstract
Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. Pourvu que d'une protéine peut être marqué et une autre protéine marquée, cette méthode peut être mis en œuvre pour l'enquête sur les interactions entre protéines. Il est basé sur une main sur la reconnaissance de la protéine marquée par des billes magnétiques revêtues de cobalt et d'autre part sur l'interaction entre la protéine marqué et une seconde protéine spécifique qui est marquée. Tout d'abord, les protéines marquées et étiquetées sont mélangés et incubés à température ambiante. Les billes magnétiques, qui reconnaissent la balise, sont ajoutées et la fraction liée de la protéine marquée est séparée de la fraction non liée en utilisant des aimants. La quantité de protéine marqué qui est capturée peut être déterminée de manière indirecte par mesure du signal de la protéine marquée est resté dans la fraction non liée. Le dosage de liquide décrit la phase d'affinité est extrêmement utile lorsque les protéines de conversion de conformation sont sensibles culAyed. Le développement et l'application de l'essai est démontrée pour l'interaction entre les poliovirus et du poliovirus en reconnaissant nanocorps 1. Depuis poliovirus est sensible à la conversion conformationnelle 2 lorsqu'il est attaché à une surface solide (résultats non publiés), l'utilisation de la méthode ELISA est limitée et d'un système en phase liquide à base doit donc être préféré. Un exemple d'un système en phase liquide à base souvent utilisé dans les polioresearch 3,4 est la protéine micro-immunoprécipitation Un test de 5. Même si ce test a prouvé son applicabilité, il faut un Fc-structure, qui est absente dans les nanocorps 6,7. Toutefois, comme une autre occasion, ces intéressants et stables anticorps à domaine unique 8 peut être facilement conçu avec des étiquettes différentes. Le couramment utilisé (His) 6-étiquette indique l'affinité pour les ions bivalents tels que le nickel ou le cobalt, qui à leur tour peuvent être facilement appliqué sur des billes magnétiques. Nous avons donc développé cette quantitative simpledosage de capture par affinité sur la base de cobalt revêtues billes magnétiques. Poliovirus a été marqué au 35 S pour permettre une interaction sans entrave avec les nanocorps et de faire une détection quantitative possible. La méthode est facile à réaliser et ne peut être établie avec un faible coût, qui est encore étayée par la possibilité de régénérer efficacement les billes magnétiques.
Protocol
Le principe (A) et un aperçu de la méthode (B) sont représentés dans la figure 1.
1. Préparation de la mémoire tampon
- Préparer Reliure / tampon de lavage en dissolvant le dihydrogénophosphate de sodium (50 mM) et de chlorure de sodium (300 mM) dans de l'eau et ajuster le pH à 8,0. En outre ajouter Tween 20 (0,01% (m / v) concentration finale), la méthionine (2% (m / v) concentration finale) et l'albumine (0,1% (m / v) concentration finale) et ajuster le volume requis.
2. Préparation des billes magnétiques
Préparer les billes magnétiques, selon le manuel d'instruction. En bref:
- Remettre en suspension les perles magnétiques en utilisant un vortex.
- Transfert, pour chaque échantillon, 10 pl des billes en suspension magnétique (40 mg / ml) dans un tube.
- Recueillir les billes magnétiques en utilisant un aimant, jusqu'à ce que le surnageant est clair (+ / - 30 secondes) et retirer le surnageant avec précaution.
- Laver lebilles magnétiques à deux reprises: remettre en suspension les billes dans 150 pi de reliure / tampon de lavage. Migrer les billes magnétiques à un côté du tube à l'aide d'un aimant jusqu'à ce que le surnageant est clair et retirez soigneusement le surnageant.
- Utilisez 40 pl de reliure / tampon de lavage, pour chaque échantillon, pour remettre en suspension les perles (10 mg / ml).
3. Essai de capture par affinité
Remarque: Pour mesurer la radioactivité naturelle (cosmique) (0% de la radioactivité), aucun virus radiomarqué est ajouté à un échantillon de contrôle 1. Au lieu de cela, le même volume reliure / tampon de lavage est ajouté.
Note: radioactivité de 100% est définie par une 2 échantillon de contrôle à laquelle tous les composants sont ajoutés à l'exception du Nanobody. Au lieu de cela, le même volume reliure / tampon de lavage est ajouté.
- Apportez 2000 cpm de 35 S étiquetés (β-rayonnement) du poliovirus Sabin souche de type 1 9, dilué avec de reliure / tampon de lavage à 80 ul dans une plaque de microtitrage à 96 puits.
- Ajouter 10 & mu; l de dilution Nanobodies dans les puits.
- Mélanger pendant environ 10 secondes en utilisant un agitateur.
- Laisser les échantillons à incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Ajouter 40 ul de la suspension lavée billes magnétiques et incuber pendant 10 minutes à température ambiante, sous agitation continue.
- Séparer les billes et le surnageant en utilisant un aimant et transférer le surnageant autorisés à pénétrer dans un tube.
4. Mesure de la radioactivité
- Transférer 50 ul du surnageant de l'étape 3.6 dans une fiole de comptage.
- Ajouter 3 ml de liquide de scintillation et mélanger. Mesurer la radioactivité dans un compteur à scintillation β-.
5. Le recyclage des Perles
- Collecter les perles utilisées magnétiques dans un tube et centrifuger à 500 xg pendant 2 minutes ou jusqu'à ce que d'un surnageant limpide est obtenue.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension les perles dans 6 ml de NaOH 0,5 M.
- Transférer la suspension dans Multipltubes électroniques et les incuber dans un bain à ultrasons pendant 5 minutes.
- Utilisez des aimants pour recueillir les billes magnétiques et retirer le surnageant.
- Ajouter 1 ml de 2% SDS-solution à chaque tube et remettre à l'aide d'un vortex. Faire bouillir pendant 5 minutes.
- Collecter les perles et retirer le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 1 ml d'EDTA 0,2 M (pH = 7).
- Incuber les tubes dans un bain à ultrasons pendant 5 minutes et une fois de plus, éliminer le surnageant.
- Ajouter 1 ml d'eau à chaque tube et remettre les billes. Collecter les perles et retirer le surnageant. Répétez cette étape de lavage à deux reprises.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 1 ml 10 mM CoCl 2 solution. Mettre sur un agitateur pendant 10 minutes.
- Eliminer le surnageant à l'aide d'un aimant pour recueillir les perles et remettre en suspension dans 1 ml de reliure / tampon de lavage.
- Retirer le surnageant et laver les billes deux fois en utilisant 1 ml de 20% (v / v) d'éthanol
- Remettre en suspension les perles dans leur volume initial de 20% (v / v) etHanol à obtenir des billes régénérées en une concentration de 40 mg / ml.
6. Interprétation des résultats
- L'échantillon de contrôle 1, dans lequel aucun virus radiomarqué a été ajouté, sera utilisé pour corriger la radioactivité de fond et de définir la valeur de radioactivité 0%. L'échantillon de contrôle 2, qui ne contient pas de Nanobodies et où par conséquent tous les virus radiomarqué reste dans le surnageant, est défini comme la valeur la radioactivité de 100%.
- Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant (= une%) est une mesure de la précipitation globale (= 100 - une%) du virus radiomarqué par le Nanobody.
7. Les résultats représentatifs
Les résultats représentatifs pour ce test de capture par affinité sont présentés dans les figures 2, 3 et 4. Dans la figure 2, l'affinité de PVSS38C, une spécifique pour le poliovirus Nanobodies, est montré. L'affinité de PVSS38C a été testé pendant trois antigènes différents de poliovirus: Native-antigène (N-antigène), Chauffée-antigène (H-antigène) et sous-unités 14S. N-antigène est le virus intact qui est infectieux. Lorsque le virus est chauffé (20 minutes à 56 ° C) ou fixé à une surface solide (résultats non publiés), la conformation des changements de capside, résultant en une perte (partielle) de l'ARN viral et la protéine de capside VP4, et vide capsides sont formées, qui sont alors appelés H-antigènes. Sous-unités 14S sont des intermédiaires d'assemblage. Ces antigènes sont reconnus par différents ensembles d'anticorps après la vaccination 10 et possèdent donc des épitopes différents et des sites antigéniques. Dans la figure le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nanobody. Il peut être vu que la radioactivité dans le surnageant des échantillons contenant des sous-unités 14S radiomarqués diminue avec des concentrations croissantes de la PVSS38C Nanobodies. Cela peut se traduire par une augmentation de la quantité de poliovirus 14S con sous-unitésconnecté à la PVSS38C Nanobodies et indirectement à des billes magnétiques. Le titre de capture (= la concentration de Nanobodies nécessaire pour capturer 50% du virus radiomarqué) peuvent être représentés graphiquement calculé comme 0,099 nM. Pas d'affinité de PVSS38C pour la N-antigénique et H-antigénique du poliovirus de forme est observée. A partir de ces données, il est interprété que PVSS38C est en interaction avec un épitope qui est exclusivement présent sur la sous-unité 14S et non pas sur les deux autres formes antigéniques de poliovirus.
Pour démontrer que la perte de la radioactivité dans le surnageant est uniquement due à l'affinité spécifique de la Nanobodies l'égard de ses antigènes, le même dosage a été réalisé avec Nb1, un Nanobodies généré contre le régulateur transcriptionnel de lrpB sulfataricus Sulfolobus et connu pour avoir aucune interaction avec n'importe quel antigène du poliovirus. Le résultat de ce test est représenté sur la figure 3. Tous les virus radiomarqué reste dans les surnageants montrant qu'il n'ya pas de réactivité desNb1 contre les trois formes antigéniques de poliovirus.
La reproductibilité des résultats a été testée en répétant l'expérience pour un total de huit fois pour une donnée Nanobodies (c.-à-PVSP29F) à des jours différents et par des personnes différentes. Les résultats sont présentés dans la figure 4. La valeur moyenne de la radioactivité dans le surnageant de pourcentage a été calculé pour chaque concentration Nanobodies et est représenté en correspondance avec son écart-type.
Figure 1. Un aperçu du principe (A) et le procédé (B) du dosage. A. étiquette His nanocorps qui reconnaissent spécifiquement un antigène du poliovirus certaine sera en mesure d'interagir avec les billes de cobalt-magnétiques revêtues et précipiter le virus de marqué radioactivement. Nanocorps B. Son-étiquette sont ajoutés à un poliovirus marqué radioactivement et incubé. Cobalt billes magnétiques revêtues sontajouté et la séparation magnétique de l'antigène lié / non lié est effectué. La radioactivité du surnageant est mesurée et la quantité d'antigène capturé peut être dérivée.
Figure 2. Magnétique de capture par affinité perles d'antigènes différents de poliovirus par Nanobodies PVSS38C. Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de PVSS38C. Pour 14S une relation dose-réponse peut être trouvée, montrant l'interaction de PVSS38C avec un épitope exclusivement présent sur 14S. Aucune interaction significative avec la N-, ni H-antigène peut être détecté, même si un risque négligeable non spécifique de capture à des concentrations très élevées est remarqué.
Figure 3. Magnétiques de capture par affinité billes d'antigènes différents poliovirus par Nanobody Nb1 la figure 2 est donc seulement en raison de l'affinité spécifique de la Nanobodies l'égard de ses antigènes.
Figure 4. Reproductibilité du dosage. La valeur moyenne de la radioactivité pourcentage dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nanobody. L'expérience a été répétée huit fois à des jours différents et par des personnes différentes. L'écart-type est représenté par des barres verticales.
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Discussion
Dans le protocole, la radioactivité de l'antigène interagissant avec le Nanobodies est définie comme la perte du virus radiomarqué à partir du surnageant. Par conséquent, la quantité de radioactivité précipitée (= 100 - en%) (lié à des billes magnétiques) peut être estimée de façon indirecte par la radioactivité dans le surnageant (= a%). D'autre part, il est également possible de mesurer la radioactivité de la fraction précipitée de l'antigène lié de manière directe par l'élution des immunocomplexes des billes magnétiques avec 500 mM d'imidazole. Il a été démontré précédemment 11 que il ya une correspondance parfaite entre le montant total de la radioactivité et la somme de la radioactivité dans les fractions surnageant et le culot. Il est donc acceptable et gain de temps pour mesurer la radioactivité du surnageant. Procédé pour l'élution des immunocomplexes des billes magnétiques est décrit par Thys et al., 2011 11.
Apart par le poliovirus, autres picornavirus sont connus pour être sensibles à la surface solide induit la conversion conformationnelle, comme le pied d'importance économique et le virus de la fièvre aphteuse (VFA) 2. L'altération de la forme et la réduction de l'affinité de liaison des protéines en général après la liaison à des matières plastiques est décrit dans la littérature 12. Le test pourrait donc être utilisée pour étudier l'interaction entre les protéines d'autres qui sont sensibles aux changements de conformation, pour la cartographie des épitopes, pour définir la quantité de protéines correctement repliées, à l'écran pour les impuretés liées au cours de la structure des processus de production, pour le dépistage rapide des lots au cours la production, pour la purification d'échantillons qui sont des mélanges de protéines étroitement liées et de nombreuses autres applications peuvent être imaginées. La disponibilité des différentes billes magnétiques ayant une affinité pour différentes balises prend en charge ces possibilités. Bien que les marqueurs radioactifs ont été utilisés dans ces expériences, d'autres signaux pourraientêtre mis en œuvre pour détecter et quantifier les interactions, comme les colorants fluorescents 13,14. De nombreux échantillons peuvent être analysés au cours d'une expérience et il est possible d'automatiser la méthode. Les billes magnétiques utilisés dans ce dosage peut être facilement ré-utilisé par seulement un point d'ébullition, étape d'extraction et de régénération, ce qui rend cette une méthode peu coûteuse. Jusqu'à ce jour, cinq de ces cycles de régénération des perles n'a pas d'incidence sur la reproductibilité des résultats (données non présentées).
En outre, il peut être considéré comme une méthode spécifique, puisque nanocorps spécifiques sont utilisés que seulement reconnaître leur antigène, selon qu'ils étaient capables d'interagir différemment avec le poliovirus N-et H-antigènes et la sous-unité 14S.
Il peut être conclu que ce test de capture par affinité en utilisant des billes magnétiques est un test avec un large éventail d'applications possibles qui est fiable, simple, quantitative, spécifique, gain de temps et peu coûteux.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le personnel du département de la biotechnologie pharmaceutique et biologie moléculaire et en particulier Monique De Pelsmacker pour la préparation du virus radioactifs étiquetés. Nous sommes reconnaissants à Ellen Merckx et Hadewijch Halewyck pour leurs remarques et discussions intéressantes et de Gerrit De Bleeser pour son aide dans le laboratoire. Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention de OZR la Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), le Fonds voor Onderzoek Vlaanderen Wetenschappelijk (G.0168.10N) et l'Organisation mondiale de la Santé (TSA 200 410 791). Lise Schotte est un garçon prédoctoral de la Fonds voor Onderzoek Vlaanderen Wetenschappelijk (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
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