Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

doi: 10.3791/3937 Published: May 29, 2012

Summary

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.

Abstract

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. ובלבד חלבון אחד יכול להיות מתויג חלבון אחר הנקרא, שיטה זו יכולה להיות מיושמת לחקירת אינטראקציות בין חלבונים. היא מבוססת מצד אחד על ההכרה של חלבון מסומן על ידי קובלט חרוזים מגנטיים מצופה ומצד שני על יחסי הגומלין בין חלבון מתויג חלבון מסוים 2, כי הוא מסומן. ראשית, חלבונים שכותרתו מתויג מעורבבים ו מודגרות בטמפרטורת החדר. חרוזים המגנטי, המזהים את תג מתווספות ואת חלק כפות של חלבון הנקרא מופרד חלק מאוגד באמצעות מגנטים. כמות של חלבון הנקרא, כי הוא נתפס ניתן לקבוע באופן עקיף על ידי מדידת אותות של חלבון הנקרא נשאר חלק לא מאוגד. בשלב תיאר נוזל assay זיקה מאוד שימושי כאשר חלבונים המרה קונפורמציה רגישים בתחתעאייד. פיתוח ויישום של assay באה לידי ביטוי לאינטראקציה בין poliovirus ו poliovirus הכרה Nanobodies 1. מאחר שנגיף הפוליו רגיש המרה קונפורמציה 2 כאשר מצורף משטח יציב (תוצאות שלא פורסמו), שימוש ELISA מוגבלת ומערכת שלב נוזלי מבוסס לפיכך יש להעדיף. דוגמה של מערכת השלב נוזלי מבוסס בדרך כלל משתמשים בו polioresearch 3,4 הוא חלבון מיקרו-immunoprecipitation הבדיקה 5. אף על פי בדיקה זו הוכיחה את ישימותה, זה דורש FC-מבנה, אשר נעדרת את Nanobodies 6,7. עם זאת, הזדמנות נוספת, מעניינת ויציבה האלה יחיד תחום נוגדנים 8 יכול להיות מהונדסים בקלות עם תגים שונים. בשימוש נרחב (שלו) 6 תג מראה זיקה יונים דו ערכי, כגון ניקל או קובלט, אשר יכול על לתורם להיות מצופה בקלות על חרוזים מגנטיים. לפיכך, אנו פיתחו את זה כמותית פשוטהלכידת assay זיקה על בסיס קובלט חרוזים מצופים מגנטיים. Poliovirus סומן עם S 35 כדי לאפשר אינטראקציה עם Nanobodies באין מפריע ולעשות גילוי כמותי ריאלי. השיטה קלה לביצוע, ניתן להקים עם עלות נמוכה, אשר נתמך גם על ידי האפשרות של התחדשות ביעילות את החרוזים מגנטיים.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העיקרון (A) סקירה של השיטה (ב ') מתוארים באיור 1.

1. הכנת מאגר

  1. הכן את עקידת / Wash חיץ ידי המסת סודיום פוספט dihydrogen (50 מ"מ), סודיום כלוריד (300 מ"מ) במים ולהתאים את ה-pH ל 8.0. בנוסף להוסיף Tween 20 (0.01% (מ '/ V) הריכוז הסופי), מתיונין (2% (m / v) ריכוז סופי) ו אלבומין (0.1% (ז / נ) הריכוז הסופי) ולהתאים את עוצמת הקול הנדרשת.

2. הכנת החרוזים מגנטיים

הכינו את החרוזים מגנטי על פי להוראות במדריך. בקצרה:

  1. Resuspend את החרוזים מגנטי באמצעות מערבולת.
  2. העברה, עבור מדגם זה, 10 μl של חרוזים מגנטיים resuspended (40 מ"ג / מ"ל) לתוך צינור.
  3. לאסוף את החרוזים מגנטי באמצעות מגנט, עד supernatant ברור (+ / - 30 שניות) ולהסיר supernatant בזהירות.
  4. לשטוף אתחרוזים מגנטיים פעמיים: resuspend את החרוזים ב μl 150 של המאגר המאוחד / Wash. להעביר את החרוזים מגנטי לצד אחד של הצינור באמצעות מגנט עד supernatant ברור ובזהירות להסיר את supernatant.
  5. השתמש 40 μl של המאגר המאוחד / Wash, עבור מדגם זה, כדי resuspend את החרוזים (10 מ"ג / מ"ל).

3. זיקה Assay לכידת

הערה: כדי למדוד את הקרינה (הקוסמית) הרקע (0% רדיואקטיביות), אין וירוסים radiolabeled נוסף מדגם שליטה 1. במקום זאת, נפח אותו איגוד / Wash חיץ נוסף.

הערה: רדיואקטיביות 100% מוגדר על ידי 2 השליטה מדגם שבו כל הרכיבים פרט נוסף Nanobody. במקום זאת, נפח אותו איגוד / Wash חיץ נוסף.

  1. להביא 2000 עותקים לדקה של 35 שכותרתו S (β-קרינה) poliovirus סבין זן מסוג 1, 9, מדולל המאגר המאוחד / רחצה μl 80 לתוך צלחת 96-גם microtiter.
  2. הוסף 10 & MU, L של דילול Nanobody על וולס.
  3. מערבבים במשך 10 שניות באמצעות שאכר.
  4. אפשר דגימות כדי לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  5. הוסף 40 μl של ההשעיה חרוזים שטף מגנטי דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, תחת ברציפות רועד.
  6. הפרד את חרוזים supernatant באמצעות מגנט ולהעביר supernatant פינה לתוך הצינור.

4. מדידה של רדיואקטיביות

  1. העברת 50 μl של supernatant משלב 3.6 לתוך הבקבוק לספור.
  2. הוסף 3 מ"ל של נוזל נצנץ ומערבבים. מדוד את הרדיואקטיביות ב counter-β נצנץ.

5. מיחזור החרוזים

  1. לאסוף את החרוזים מגנטיים המשמשים בתוך צינור ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 2 דקות או עד supernatant ברור מתקבל.
  2. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 6 מ"ל 0.5 M NaOH.
  3. מעבירים את ההשעיה כדי multiplדואר צינורות דגירה באמבטיה קולי במשך 5 דקות.
  4. השתמש מגנטים לאסוף את החרוזים מגנטיים ולהסיר supernatant.
  5. הוסף 1 מ"ל 2% SDS-פתרון צינור כל resuspend באמצעות מערבולת. מרתיחים במשך 5 דקות.
  6. לאסוף את החרוזים ולהסיר supernatant. Resuspend החרוזים של 1 מ"ל 0.2 M EDTA (pH = 7).
  7. דגירה צינורות באמבטיה קולי במשך 5 דקות ושוב, להסיר את supernatant.
  8. הוסף 1 מ"ל של מים בצינור כל resuspend את החרוזים. לאסוף את החרוזים ולהסיר supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים בכביסה.
  9. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 1 מ"ל 10 הפתרון CoCl 2 מ"מ. לשים על שייקר במשך 10 דקות.
  10. הסר את supernatant באמצעות מגנט לאסוף את החרוזים ואת resuspend מ"ל 1 מתוך המאגר המאוחד / Wash.
  11. הסר את supernatant ולשטוף את החרוזים פעמיים באמצעות 1 מ"ל של 20% (V / V) אתנול
  12. Resuspend את החרוזים בכמות המקורית של 20% (V / V) ethanol להשיג חרוזים שהתחדשו בריכוז של 40 מ"ג / מ"ל.

6. הפרשנות של התוצאות

  1. דגימת בקרה 1, בו לא וירוס radiolabeled נוסף, ישמש לתיקון רדיואקטיביות רקע כדי לקבוע את ערך רדיואקטיביות 0%. דגימת בקרה 2, אשר אינו מכיל Nanobody והיכן ולכן כל וירוס radiolabeled נשאר supernatant, מוגדר כערך רדיואקטיביות 100%.
  2. שיעור הרדיואקטיביות ב supernatant (=%) הוא מדד של כמות המשקעים הכוללת (= 100 -%) של הנגיף radiolabeled ידי Nanobody.

7. נציג תוצאות

התוצאות מייצגות עבור assay זה לכידת זיקה מוצגים איורים 2, 3 ו -4. באיור 2, הזיקה של PVSS38C, ספציפית עבור Nanobody poliovirus, יוצג. הזיקה של PVSS38C נבדק במשך שלושה אנטיגנים שונים של poliovאירוס הארגמן: אנטיגן Native-(N-אנטיגן), אנטיגן מחוממת-(H-antigen) ו יחידות משנה 14S. N-האנטיגן הוא וירוס ללא פגע, כי הוא מדבק. כאשר הנגיף מחומם (20 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) או מצורף משטח יציב (תוצאות שלא פורסמו), קונפורמציה השינויים קפסיד, וכתוצאה מכך אובדן (חלקי) של RNA נגיפיים חלבון capsid VP4, וריק capsids נוצרים אשר נקראים כך H-אנטיגנים. יחידות משנה 14S הם ביניים הרכבה. אנטיגנים אלה מוכרים על ידי קבוצות שונות של נוגדנים לאחר חיסון 10 ובעלי אפיטופים שונים ולכן ואתרי אנטיגני. באיור אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nanobody. ניתן לראות כי בשנת supernatant הרדיואקטיביות של דגימות המכילות יחידות משנה 14S radiolabeled יורדת עם ריכוזים עולים של PVSS38C Nanobody. זה יכול להיות מתורגם כ גידול בסך של poliovirus 14S קון יחידות משנהnected כדי PVSS38C Nanobody ובעקיפין על חרוזים מגנטיים. Titer לכידת (= ריכוז Nanobody צורך ללכוד 50% של הנגיף radiolabeled) ניתן לחשב באופן גרפי כפי 0.099 ננומטר. אין זיקה של PVSS38C עבור אנטיגני-N ו-H-אנטיגני צורה של poliovirus הוא ציין. מנתונים אלה הוא מפורש כי PVSS38C מקיימת יחסי גומלין עם epitope כי קיים אך ורק על למקטע 14S ולא על שתי צורות אחרות של אנטיגני poliovirus.

על מנת להוכיח כי אובדן הרדיואקטיביות supernatant רק בשל זיקה מסוימת של Nanobody כלפי אנטיגנים שלו, אותו assay בוצע Nb1, Nanobody שנוצר נגד הרגולטור תעתיק lrpB של sulfataricus Sulfolobus וידוע אין אינטראקציה עם כל אנטיגן poliovirus. התוצאה של assay זה מוצגת באיור 3. כל וירוס radiolabeled נשאר את supernatants מראה כי אין תגובתיות שלNb1 נגד שלוש צורות אנטיגני של poliovirus.

שחזור של התוצאות נבדק על ידי חזרה על הניסוי עבור סכום כולל של פי שמונה על 1 Nanobody נתון (כלומר, PVSP29F) בשעה בימים שונים ועל ידי אנשים שונים. התוצאות מוצגות באיור 4. הערך הממוצע של רדיואקטיביות אחוז supernatant חושב על ריכוז כל Nanobody והיא מיוצגת התכתבות עם סטיית התקן שלה.

באיור 1.
באיור 1. סקירה כללית של עקרון (א ') והשיטה (ב) assay. א 'שלו מתויג Nanobodies ספציפית לזהות אנטיגן poliovirus מסוימת יוכלו לתקשר עם קובלט מצופים חרוזים מגנטיים יהיה להאיץ את הנגיף שכותרתו רדיואקטיבית. Nanobodies ב 'שלו מתוייגים נוספים poliovirus מסומן רדיואקטיבית ו מודגרות. קובלט מצופים חרוזים מגנטיים הםנוסף והפרדה המגנטי של אנטיגן / מאוגד מאוגד מתבצע. הרדיואקטיביות של supernatant נמדד כמות האנטיגן בשבי ניתן לגזור.

איור 2
איור 2. זיקה חרוזים מגנטי לכידתו של אנטיגנים שונים poliovirus ידי Nanobody PVSS38C. אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של PVSS38C. עבור 14S יחסים ריכוז התגובה ניתן למצוא, מראה את האינטראקציה של PVSS38C עם epitope כיום באופן בלעדי על 14S. ללא אינטראקציה משמעותית עם N-ולא H-אנטיגן ניתן להבחין, אם כי זניח שאינו ספציפי לכידת בריכוזים גבוהים מאוד, הוא הבחין.

איור 3
איור 3. זיקה חרוזים מגנטי לכידתו של אנטיגנים שונים poliovirus ידי Nanobody Nb1 באיור 2 ולכן רק בשל זיקה מסוימת של Nanobody כלפי אנטיגנים שלה.

באיור 4.
באיור 4. שחזור של assay. הערך הממוצע של רדיואקטיביות אחוז supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nanobody. הניסוי חזר על עצמו שמונה פעמים בימים שונים ועל ידי אנשים שונים. סטיית התקן מיוצג קווים אנכיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בפרוטוקול, רדיואקטיביות של אנטיגן אינטראקציה עם Nanobody מוגדר כאובדן של וירוס radiolabeled מ supernatant. לכן כמות רדיואקטיביות זירז (= 100 -%) (חייב את החרוזים מגנטיים) ניתן להעריך בצורה עקיפה על ידי רדיואקטיביות ב supernatant (=%). מצד שני, אפשר גם למדוד את הרדיואקטיביות של חלק כרוך זירז של האנטיגן באופן ישיר על ידי משחררי את immunocomplexes מן חרוזים מגנטיים עם 500 מ"מ imidazole. זה הודגם בעבר 11 כי יש התאמה מושלמת בין הסכום הכולל של רדיואקטיביות, וסכום של קרינה רדיואקטיבית נמצאו שברים supernatant ו גלולה. לכן מקובל חוסך זמן למדוד את הרדיואקטיביות של supernatant. שיטה עבור elution של immunocomplexes מן חרוזים מגנטיים מתואר על ידי זה העולם et al., 2011 11.

APART מ poliovirus, picornaviruses אחרים ידועים להיות רגישים משטח מוצק המושרה המרה קונפורמציה, כמו רגל חשובה מבחינה כלכלית מחלת וירוס הפה (FMDV) 2. שינוי הצורה ואת צמצום זיקה מחייבת של חלבונים בכלל לאחר קשירה פלסטיק מתואר בספרות 12. Assay ולכן יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבונים אחרים הרגישים לשינויי קונפורמציה, למיפוי epitope, להגדיר את כמות חלבונים מקופלים כראוי, למסך של זיהומים מבנה הקשורות במהלך תהליכי הייצור, לסינון מהיר של קבוצות במהלך ייצור, לטיהור של דוגמאות כי הם תערובות של חלבונים הקשורים קשר הדוק ויישומים רבים אחרים ניתן לחשוב. הזמינות של חרוזים מגנטיים שונים בעלי זיקה תגים שונים תומך את האפשרויות הללו. למרות תוויות רדיואקטיביים ששימשו בניסויים אלה, אותות אחרים יכוליםליישם כדי לזהות ולכמת את האינטראקציות, כמו צבעי ניאון 13,14. דוגמאות רבות ניתן לנתח במהלך הניסוי אחד אפשר להפוך את השיטה. החרוזים מגנטיים המשמשים assay זה יכול בקלות להיות שימוש חוזר רק על ידי צעד, רותחים להפשיט התחדשות, אשר הופך את זה שיטה זולה. עד כה, חמישה מחזורים אלה התחדשות של החרוזים לא השפיע על שחזור של התוצאות (מידע לא מוצג).

בנוסף, זה יכול להיחשב כאמצעי מסוים, שכן Nanobodies מסוימים משמשים רק להכיר אנטיגן שלהם, כפי שהם היו מסוגלים לתקשר באופן שונה עם poliovirus ו n-H-אנטיגנים ו למקטע 14S.

ניתן להסיק כי לכידת זיקה assay באמצעות חרוזים מגנטיים הוא assay עם מגוון רחב של יישומים אפשריים כי הוא אמין, פשוט, כמותי מסוים, חוסך זמן ולא יקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו מה למסור.

Acknowledgments

המחברים מודים לצוות המחלקה לביוטכנולוגיה התרופות לביולוגיה מולקולרית ובמיוחד מוניק דה Pelsmacker להכנת וירוס מסומן רדיואקטיבית. אנו מודים אלן Merckx ו Hadewych Halewyck על דבריו המעניינים שלהם ודיונים וכדי חריט דה Bleeser על עזרתו במעבדה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק של OZR מהאוניברסיטה Vrije בריסל (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (G.0168.10N) ואת ארגון הבריאות העולמי (ה-TSA 200410791). ליזה Schotte הוא עמית predoctoral של Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (FWO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown Invitrogen 101.03D Magnetic beads
Optiphase ’HiSafe’ 2 PerkinElmer, Inc. 1200 - 436 Scintillation fluid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
  2. Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
  3. Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
  4. Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
  5. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
  6. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  7. Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
  8. Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
  9. Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
  10. Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
  11. Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
  12. Wild, D. The Immunoassay Handbook. Third edition, Elsevier. (2005).
  13. Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
  14. Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).More

Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter