Summary
Neste artigo, um simples, quantitativa, na fase líquida ensaio de captura de afinidade é apresentado. É uma técnica fiável baseada na interacção entre as esferas magnéticas e proteínas marcadas (por exemplo, nanocorpos), por um lado ea afinidade entre a proteína marcada e uma proteína, segundo rotulada (por exemplo, poliovírus) sobre o outro.
Abstract
Neste artigo, um simples, quantitativa, na fase líquida ensaio de captura de afinidade é apresentado. Desde que uma proteína pode ser marcado e uma outra proteína marcada, este método pode ser implementado para a investigação de interacções proteína-proteína. Baseia-se, por um lado, sobre o reconhecimento da proteína etiquetada por cobalto esferas magnéticas revestidas e, por outro lado sobre a interacção entre a proteína marcada e uma segunda proteína específica que é rotulado. Primeiro, as proteínas marcadas e marcou são misturados e incubados à temperatura ambiente. As esferas magnéticas, que reconhecem a etiqueta, são adicionados ea fracção ligada de proteína marcada é separada da fracção não ligada usando magnetos. A quantidade de proteína marcada que é capturada pode ser determinada de uma forma indirecta, medindo o sinal da proteína marcada permaneceu na fracção não ligada. O líquido descrito ensaio de afinidade de fase é extremamente útil quando as proteínas de conversão conformacionais sensíveis são assAyed. O desenvolvimento e aplicação do ensaio é demonstrado para a interacção entre o poliovírus e poliovírus reconhecendo nanocorpos 1. Uma vez que o poliovírus é sensível a conversão conformacional 2, quando ligado a uma superfície sólida (resultados não publicados), o uso de ELISA é limitada e um sistema de fase líquida baseada deve, portanto, ser preferido. Um exemplo de um sistema de fase líquida baseada em muitas vezes utilizado em polioresearch 3,4 é a proteína de micro-ensaio de imunoprecipitação Uma 5. Embora este teste demonstrou a sua aplicabilidade, requer uma Fc-estrutura, que está ausente nas nanocorpos 6,7. No entanto, como uma nova oportunidade, estes interessantes e estável anticorpos de domínio único 8 pode ser facilmente fabricado de acordo com marcas diferentes. O amplamente utilizado (His) 6-tag mostra afinidade para os iões bivalentes, tais como níquel ou cobalto, que pode por sua vez ser facilmente revestidos sobre as esferas magnéticas. Por isso, desenvolvemos este quantitativa simplesensaio de captura de afinidade com base em cobalto esferas magnéticas revestidas. Poliovírus foi marcada com 35 S, para permitir a interacção com as desimpedido nanocorpos e para fazer uma detecção quantitativa viável. O método é fácil de realizar e pode ser estabelecida com um baixo custo, que é ainda apoiada pela possibilidade de forma eficaz em regeneração das pérolas magnéticas.
Protocol
O princípio (A) e uma visão geral do método (B) estão representados na Figura 1.
1. Preparação do tampão
- Preparar Binding / tampão de lavagem por dissolução de dihidrogenofosfato de sódio (50 mM) e cloreto de sódio (300 mM) em água e ajustar o pH a 8,0. Além disso adicionar Tween 20 (0,01% (m / v) de concentração final), metionina (2% (m / v) de concentração final) e albumina (0,1% (m / v) de concentração final) e ajusta-se o volume requerido.
2. Preparação dos grânulos magnéticos
Preparar as esferas magnéticas de acordo com o manual de instruções. Resumidamente:
- Ressuspender as esferas magnéticas, utilizando um vórtice.
- De transferência, para cada amostra, 10 ul de os grânulos em suspensão magnéticos (40 mg / ml) para um tubo.
- Recolher as esferas magnéticas, utilizando um íman, até que o sobrenadante é claro (+ / - 30 seg) e remover o sobrenadante cuidadosamente.
- Lava-se aesferas magnéticas duas vezes: ressuspender as contas em 150 ul de Encadernação / lavagem. Migrar as esferas magnéticas para um lado do tubo utilizando um íman até que o sobrenadante é clara e cuidadosamente remover o sobrenadante.
- Use 40 uL de Binding / tampão de lavagem, para cada amostra, para ressuspender as esferas (10 mg / ml).
3. Ensaio de captura de afinidade
Nota: Para medir a radioactividade de fundo (cósmica) (0% da radioactividade), nenhum vírus radiomarcado é adicionado a uma amostra de controlo 1. Em vez disso, o mesmo volume de ligação / tampão de lavagem é adicionada.
Nota: radioactividade 100% é definida por uma amostra de controlo 2 ao qual todos os componentes são adicionados excepto o Nanobody. Em vez disso, o mesmo volume de ligação / tampão de lavagem é adicionada.
- Traga 2000 cpm de 35 S rotulados (β radiação-) poliovírus Sabin estirpe 1 9, diluiu-se com a ligação / tampão de lavagem a 80 uL em uma placa de microtitulação de 96 poços.
- Adicionar 10 & mu; l de Nanobody diluição aos poços.
- Misturar durante cerca de 10 segundos, utilizando um agitador.
- Permitir que as amostras a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Adicionar 40 ul da suspensão de pérolas lavadas magnético e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente, sob agitação contínua.
- Separa-se as pérolas eo sobrenadante utilizando um íman e transferir o sobrenadante para um tubo de apagada.
4. Medição da radioactividade
- Transferir 50 ul do sobrenadante do passo 3.6 em um balão de contagem.
- Adicionar 3 ml de fluido de cintilação e misturar. Medir a radioactividade num contador de cintilação β-.
5. A reciclagem dos grânulos
- Recolher as esferas utilizadas magnéticos em um tubo e centrifugar a 500 xg durante 2 minutos ou até um sobrenadante límpido é obtido.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 6 ml de 0,5 M de NaOH.
- Transferir a suspensão para multiplicavatubos electrónicos e incubar em um banho de ultra-sons durante 5 minutos.
- Use os magnetos para recolher as esferas magnéticas e remover o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de 2% de SDS-solução a cada tubo e ressuspender utilizando um vórtice. Ferva durante 5 minutos.
- Recolher os grânulos e remover o sobrenadante. Ressuspender as pérolas em 1 ml 0,2 M de EDTA (pH = 7).
- Incubar os tubos num banho de ultra-sons durante 5 minutos e mais uma vez, remover o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de água a cada tubo e ressuspender as esferas. Recolher os grânulos e remover o sobrenadante. Repetir este passo de lavagem duas vezes.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 1 10 mM ml CoCl solução 2. Colocar num agitador durante 10 minutos.
- Remover o sobrenadante utilizando um magneto para recolher os grânulos e ressuspender em 1 ml de Binding / tampão de lavagem.
- Remover o sobrenadante e lava-se as pérolas de duas vezes usando 1 ml de 20% (v / v) de etanol
- Ressuspender as pérolas em seu volume original de 20% (v / v) ethanol para se obter grânulos regeneradas em uma concentração de 40 mg / ml.
6. Interpretação dos Resultados
- Controlo amostra 1, na qual nenhum vírus radiomarcado foi adicionado, será usada para corrigir a radioactividade de fundo e para definir o valor radioactividade 0%. Controlo amostra 2, que não contém Nanobody e onde consequentemente todos os vírus radiomarcado permanece no sobrenadante, é definido como o valor radioactividade 100%.
- A percentagem de radioactividade no sobrenadante (=% a) é uma medida da precipitação geral (= 100 - uma%) do vírus radiomarcado pelo Nanobody.
7. Os resultados representativos
Os resultados representativos para este ensaio de captura de afinidade são mostrados nas Figuras 2, 3 e 4. Na Figura 2, a afinidade de PVSS38C, um específico para Nanobody poliovírus, é mostrado. A afinidade de PVSS38C foi testado para três antigénios diferentes de poliovIrus:-antigénio nativo (N-antigénio), antigénio-aquecida (H-antigénio) e subunidades 14S. N-antigénio é o vírus intacto, que é infecciosa. Quando o vírus é aquecida (20 minutos a 56 ° C) ou ligado a uma superfície sólida (resultados não publicados), a conformação das alterações da cápside, resultando numa perda (parcial) do RNA viral e da proteína da cápside VP4, e vazio cápsides são formados que são então chamado H-antigénios. Subunidades 14S são intermediários de montagem. Estes antigénios são reconhecidos por diferentes conjuntos de anticorpos após imunização 10 e, por conseguinte, possuem epitopos diferentes e locais antigénicos. Na figura a percentagem de radioactividade encontrada no sobrenadante é representada como uma função da concentração de Nanobody. Pode ser visto que a radioactividade no sobrenadante das amostras contendo radiomarcados subunidades 14S diminui com concentrações crescentes do PVSS38C Nanobody. Isto pode ser traduzido como um aumento na quantidade de poliovírus 14S con subunidadestado para o PVSS38C Nanobody e indirectamente às pérolas magnéticas. O título de captura (= concentração da Nanobody necessário para capturar 50% do vírus radiomarcado) pode ser calculado como graficamente 0,099 nM. Nenhuma afinidade de PVSS38C para o N-antigénica e H-antigénico forma de poliovírus é observada. A partir destes dados é interpretado que PVSS38C está interagindo com um epítopo que é exclusivamente presente na subunidade 14S e não sobre as duas formas antigénicos outros de poliovírus.
Para demonstrar que a perda de radioactividade a partir do sobrenadante é apenas devido à afinidade específica do Nanobody em relação aos seus antigénios, o mesmo ensaio foi realizado com NB1, um Nanobody gerado contra o regulador lrpB transcricional de sulfataricus Sulfolobus e conhecido por ter nenhuma interacção com qualquer antígeno de poliovírus. O resultado deste ensaio é mostrada na Figura 3. Todos os vírus radiomarcado permanece nos sobrenadantes que mostram que não há nenhuma reactividade dosNB1 contra as três formas antigênicas de poliovírus.
Reprodutibilidade dos resultados foi testada através da repetição da experiência para um total de oito vezes para um dado Nanobody (isto é, PVSP29F) em dias diferentes e por diferentes pessoas. Os resultados são mostrados na Figura 4. O valor médio da percentagem de radioactividade no sobrenadante foi calculada para cada concentração Nanobody e é representado em correspondência com o seu desvio padrão.
Figura 1. Uma visão geral do princípio (A) e do método (B) do ensaio. A. His-tag nanocorpos que reconhecem especificamente um antígeno de poliovírus determinado será capaz de interagir com os grânulos revestidos de cobalto-magnéticas e irá precipitar o vírus marcado radioactivamente. Nanocorpos B. His-tag são adicionados ao poliovírus marcado radioactivamente e incubadas. Cobalto-esferas magnéticas revestidas sãoadicionado e separação magnética do antigénio ligado / não ligado é realizada. A radioactividade do sobrenadante é medido e da quantidade de antigénio capturado podem ser derivados.
Figura 2. Captura afinidade magnética contas de antígenos de poliovírus diferentes por Nanobody PVSS38C. A percentagem de radioactividade encontrada no sobrenadante é representada como uma função da concentração de PVSS38C. Para 14S uma relação de concentração-resposta pode ser encontrada, mostrando a interacção de PVSS38C com um epítopo exclusivamente presentes no 14S. Sem interacção significativa com N-, nem H-antigénio pode ser detectada, embora uma insignificante não específica captura em concentrações muito elevadas é notado.
Figura 3. Captura afinidade magnética contas de antígenos de poliovírus diferentes por Nanobody NB1 figura 2 é, por conseguinte, apenas devido à afinidade específica do Nanobody em relação aos seus antigénios.
Figura 4. A reprodutibilidade do ensaio. O valor médio da percentagem de radioactividade no sobrenadante é representada como uma função da concentração de Nanobody. A experiência foi repetida oito vezes em dias diferentes e por diferentes pessoas. O desvio padrão é representado como barras verticais.
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Discussion
No protocolo, a radioactividade do antigénio interagir com o Nanobody é definida como a perda de vírus radiomarcado a partir do sobrenadante. Por conseguinte, a quantidade de radioactividade precipitado (= 100 - uma%) (ligado às esferas magnéticas) pode ser estimada de forma indirecta pela radioactividade no sobrenadante (=% a). Por outro lado, também é possível medir a radioactividade da fracção precipitada consolidado de antigénio de uma forma directa por eluição dos imunocomplexos a partir das esferas magnéticas com 500 mM de imidazole. Foi anteriormente demonstrado 11 que existe uma correspondência perfeita entre a quantidade total de radioactividade ea soma de a radioactividade encontrado nas fracções de sobrenadante e de sedimento. Por conseguinte, é aceitável e com economia de tempo para medir a radioactividade do sobrenadante. O método para a eluição dos imunocomplexos das esferas magnéticas está descrito por Thys et al., 2011 11.
Apart de poliovírus, picornavírus outros são conhecidos por ser sensível à superfície sólida induzida conversão conformacional, como o pé economicamente importante e vírus da doença de boca (FMDV) 2. A alteração da forma e da redução da afinidade de ligação de proteínas, em geral, após ligação ao plástico é descrita na literatura 12. O ensaio pode, por conseguinte, ser usado para investigar a interacção entre outras proteínas que são sensíveis a alterações conformacionais, por mapeamento de epítopos, para definir a quantidade de proteínas correctamente dobrados, para triagem de impurezas estrutura relacionados, durante os processos de produção, para a detecção rápida de lotes durante produção, para a purificação de amostras que são misturas de proteínas estreitamente relacionados e muitas outras aplicações pode ser pensado. A disponibilidade de diferentes esferas magnéticas com afinidade para marcas diferentes suportar estas possibilidades. Embora os rótulos radioactivos foram utilizados nestas experiências, os sinais de outros poderiaser implementadas para detectar e quantificar as interações, como corantes fluorescentes 13,14. Várias amostras podem ser analisadas durante uma experiência e é possível automatizar o método. As esferas magnéticas utilizadas neste ensaio pode facilmente ser re-utilizado por apenas um passo, de ebulição de extracção e de regeneração, o que torna este um método barato. Até à data, cinco destes ciclos de regeneração das pérolas não afectou a reprodutibilidade dos resultados (dados não mostrados).
Além disso, ele pode ser considerado como um método específico, uma vez que são utilizados nanocorpos específicos que reconhecem apenas o seu antigénio, tal como eles foram capazes de interagir de modo diferente com o poliovírus N-e H-antigénios e da subunidade 14S.
Pode concluir-se que este ensaio de captura de afinidade utilizando contas magnéticas é um ensaio com uma ampla gama de aplicações possíveis que seja fiável, simples, quantitativa, específica, de poupança de tempo e de baixo custo.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à equipe do departamento de Biotecnologia Farmacêutica e Biologia Molecular e, especialmente, Monique De Pelsmacker para a preparação do vírus radioactivas. Somos gratos a Ellen Merckx e Halewyck Hadewych para suas observações e discussões interessantes e Gerrit De Bleeser por sua ajuda no laboratório. Este trabalho foi financiado por uma bolsa OZR da Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), o Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ea Organização Mundial de Saúde (TSA 200410791). Lise Schotte é um companheiro predoctoral do Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
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