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Biology

Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

doi: 10.3791/3937 Published: May 29, 2012

Summary

En este artículo, un simple, cuantitativo, la afinidad de la fase líquida ensayo de captura se presenta. Es una técnica fiable basado en la interacción entre partículas magnéticas y las proteínas marcadas (por ejemplo nanocuerpos) en una mano y la afinidad entre la proteína marcados y una segunda proteína, con la etiqueta (por ejemplo, virus de la polio) en el otro.

Abstract

En este artículo, un simple, cuantitativo, la afinidad de la fase líquida ensayo de captura se presenta. Siempre que una proteína puede ser marcados y etiquetados otra proteína, este método puede ser aplicado para la investigación de las interacciones proteína-proteína. Se basa en una mano en el reconocimiento de la proteína marcados por perlas magnéticas recubiertas de cobalto y en la otra mano en la interacción entre la proteína marcados y una segunda proteína específica que se etiqueta. En primer lugar, las proteínas marcadas y etiquetada se mezclan y se incuban a temperatura ambiente. Las perlas magnéticas, que reconocen la etiqueta, se añaden y la fracción unida de proteína marcada se separa de la fracción no unida mediante imanes. La cantidad de proteína marcada que es capturada se puede determinar de una manera indirecta mediante la medición de la señal de la proteína marcada se mantuvo en la fracción no unida. La fase líquida se describe ensayo de afinidad es muy útil cuando las proteínas conformacionales de conversión son sensibles culoAyed. El desarrollo y la aplicación del ensayo se demuestra por la interacción entre poliovirus y poliovirus reconociendo nanocuerpos 1. Dado que el poliovirus es sensible a la conversión conformacional 2 cuando está unido a una superficie sólida (resultados no publicados), el uso de ELISA es limitado y un sistema basado en fase líquida, por tanto, se prefiere. Un ejemplo de un sistema de fase líquida basada utiliza a menudo en polioresearch 3,4 es la proteína de micro-inmunoprecipitación Un ensayo 5. A pesar de que esta prueba ha demostrado su aplicabilidad, se requiere un Fc-estructura, que está ausente en los Nanobodies 6,7. Sin embargo, como otra oportunidad, estos interesantes y estable de un solo dominio anticuerpos 8 puede ser fácilmente diseñado con diferentes etiquetas. El ampliamente utilizado (Su) 6-etiqueta muestra afinidad por los iones bivalentes tales como níquel o cobalto, que puede a su vez, ser fácilmente recubierta por perlas magnéticas. Por lo tanto, desarrolló este cuantitativo simpleensayo de afinidad de captura sobre la base de cobalto perlas magnéticas recubiertas. Poliovirus se marcó con 35 S para permitir una interacción sin obstáculos con los Nanobodies y para hacer una detección cuantitativa factible. El método es fácil de realizar y puede establecerse con un bajo costo, que se ve apoyada por la posibilidad de regenerar eficazmente las perlas magnéticas.

Protocol

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El principio (A) y una visión general del método (B) se muestra en la Figura 1.

1. Preparación del tampón

  1. Preparar Encuadernación / tampón de lavado por disolución de dihidrógeno fosfato sódico (50 mM) y cloruro de sodio (300 mM) en agua y ajustar el pH a 8,0. Adicionalmente añadir Tween 20 (0,01% (m / v) de concentración final), metionina (2% (m / v) de concentración final) y la albúmina (0,1% (m / v) de concentración final) y ajustar el volumen requerido.

2. Preparación de las perlas magnéticas

Preparar las partículas magnéticas de acuerdo con el manual de instrucciones. En pocas palabras:

  1. Resuspender las perlas magnéticas usando un vórtice.
  2. Transferencia, para cada muestra, 10 l de las perlas magnéticas resuspendidos (40 mg / ml) en un tubo.
  3. Recoge las bolas magnéticas con un imán, hasta que el sobrenadante es claro (+ / - 30 segundos) y separar el sobrenadante con cuidado.
  4. Lave elperlas magnéticas dos veces: volver a suspender las bolas en 150 l de unión / tampón de lavado. Migración de las perlas magnéticas a un lado del tubo utilizando un imán hasta que el sobrenadante es claro y quitar cuidadosamente el sobrenadante.
  5. Utilizar 40 l de unión / tampón de lavado, para cada muestra, para volver a suspender las perlas (10 mg / ml).

3. Afinidad ensayo de captura

Nota: Para medir la radiactividad de fondo (cósmico) (0% de radioactividad), ningún virus radiomarcado se añade a una muestra de control 1. En cambio, el mismo volumen Encuadernación / tampón de lavado, se añade.

Nota: 100% radiactividad se define por una muestra de control 2 para que todos los componentes se añaden excepto el nanocuerpos. En cambio, el mismo volumen Encuadernación / tampón de lavado, se añade.

  1. Llevar 2000 cpm de 35 S etiquetados (β-radiación) poliovirus Sabin tipo de cepa 1 9, se diluyó con Encuadernación / tampón de lavado a 80 l en una placa de microtitulación de 96 pocillos.
  2. Añadir 10 & mu, l de dilución nanocuerpos a los pocillos.
  3. Mezclar durante unos 10 segundos con un agitador.
  4. Permitir que las muestras se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente.
  5. Añadir 40 l de la suspensión lavada perlas magnéticas y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente, bajo agitación continua.
  6. Separar las perlas y el sobrenadante utilizando un imán y transferir el sobrenadante aclarado en un tubo.

4. La medición de la radiactividad

  1. Transferir 50 l del sobrenadante de la etapa 3.6 en un matraz de escrutinio.
  2. Añadir 3 ml de líquido de centelleo y se mezcla. Medir la radiactividad en un contador de centelleo β-.

5. El reciclaje de las perlas

  1. Recoger las perlas magnéticas utilizadas en un tubo y se centrifuga a 500 xg durante 2 minutos o hasta que un sobrenadante claro se obtiene.
  2. Eliminar el sobrenadante y resuspender las cuentas en 6 ml de NaOH 0,5 M.
  3. Transferir la suspensión a multipltubos electrónicos y se incuba en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos.
  4. Utilizar los imanes para recoger las perlas magnéticas y separar el sobrenadante.
  5. Añadir 1 ml de SDS al 2%-solución a cada tubo y resuspender utilizando un vórtice. Se hierve durante 5 minutos.
  6. Recoger las perlas y separar el sobrenadante. Resuspender las perlas en 1 ml de EDTA 0,2 M (pH = 7).
  7. Incubar los tubos en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos y una vez más, separar el sobrenadante.
  8. Añadir 1 ml de agua a cada tubo y resuspender las perlas. Recoger las perlas y separar el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.
  9. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 1 ml de 10 mM CoCl 2 solución. Colocar en un agitador durante 10 minutos.
  10. Eliminar el sobrenadante utilizando un imán para recoger las perlas y resuspender en 1 ml de enlace / tampón de lavado.
  11. Eliminar el sobrenadante y lavar las perlas dos veces utilizando 1 ml de 20% (v / v) de etanol
  12. Resuspender las perlas de su volumen original de 20% (v / v) ethanol para obtener perlas regeneradas en una concentración de 40 mg / ml.

6. Interpretación de los Resultados

  1. Muestra de control 1, en la que se añadió ningún virus radiomarcado, se utiliza para corregir la radioactividad de fondo y para establecer el valor radiactividad 0%. Muestra de control 2, que no contiene nanocuerpos y donde por consiguiente, todos los virus radiomarcado permanece en el sobrenadante, se establece como el valor radiactividad 100%.
  2. El porcentaje de radiactividad en el sobrenadante (= un%) es una medida de la precipitación total (= 100 - un%) del virus radiomarcado por el nanocuerpos.

7. Los resultados representativos

Los resultados representativos para este ensayo de captura de afinidad se muestran en las figuras 2, 3 y 4. En la Figura 2, la afinidad de PVSS38C, una específica para nanocuerpos poliovirus, se muestra. La afinidad de PVSS38C fue probado para tres diferentes antígenos de poliovirus: Nativo-antígeno (N-antígeno), climatizada antígeno (H-antígeno) y las subunidades 14S. N-antígeno es el virus intacto que es infeccioso. Cuando el virus se calienta (20 minutos a 56 ° C) o unida a una superficie sólida (resultados no publicados), la conformación de los cambios cápside, resultando en una pérdida (parcial) del ARN viral y la proteína de la cápside VP4, y vacío cápsides se forman que luego se llama H-antígenos. Subunidades 14S son intermedios de montaje. Estos antígenos son reconocidos por los diferentes conjuntos de anticuerpos después de la vacunación 10 y por lo tanto, poseen epítopos antigénicos y sitios diferentes. En la figura el porcentaje de la radiactividad se encuentra en el sobrenadante se representa como una función de la concentración de Nanobodies. Se puede observar que la radioactividad en el sobrenadante de las muestras que contienen radiomarcados subunidades 14S disminuye con concentraciones crecientes de la PVSS38C nanocuerpos. Esto puede traducirse como un aumento en la cantidad de poliovirus 14S Con subunidadesconectado al PVSS38C nanocuerpos e indirectamente a las perlas magnéticas. El título de la captura (= la concentración de Nanobodies necesario para capturar 50% del virus radiomarcado) puede ser calculada como gráficamente 0.099 nM. N afinidad de PVSS38C para la N-antigénica y H-antigénica forma de poliovirus se observa. A partir de estos datos se interpreta que PVSS38C está interactuando con un epítopo que es exclusivamente presentes en la subunidad 14S y no en las dos formas antigénicas otros de poliovirus.

Para demostrar que la pérdida de la radiactividad del sobrenadante es sólo debido a la afinidad específica de la nanocuerpos hacia sus antígenos, el mismo ensayo se realizó con NB1, un nanocuerpos generada contra el regulador transcripcional de lrpB sulfataricus Sulfolobus y se sabe que no tienen ninguna interacción con cualquier antígeno de poliovirus. El resultado de este ensayo se muestra en la Figura 3. Todos los virus radiomarcado permanece en los sobrenadantes que muestran que no hay reactividad deNB1 en contra de las tres formas antigénicas del virus de la polio.

Reproducibilidad de los resultados fue probado por repetir el experimento para un total de ocho veces para un determinado Nanobodies (es decir, PVSP29F) en días diferentes y por diferentes personas. Los resultados se muestran en la Figura 4. El valor medio de la radiactividad porcentaje en el sobrenadante se calculó para cada concentración nanocuerpos y está representado en correspondencia con su desviación estándar.

Figura 1.
Figura 1. Una visión general del principio de (A) y el método (B) del ensayo. A. Su-etiquetados nanocuerpos que reconocen específicamente un antígeno determinado poliovirus será capaz de interactuar con las perlas magnéticas recubiertas de cobalto y se precipitará el virus marcado radiactivamente. Nanocuerpos B. Su-etiquetados se añaden a poliovirus marcado radiactivamente y se incubaron. El cobalto-perlas magnéticas recubiertas sonagregado y separación magnética del antígeno unido / no unido se realiza. La radiactividad del sobrenadante y se mide la cantidad de antígeno capturado puede ser derivado.

Figura 2
Figura 2. Magnética perlas de captura por afinidad de los antígenos de poliovirus diferentes por nanocuerpos PVSS38C. El porcentaje de la radiactividad se encuentra en el sobrenadante se representa como una función de la concentración de PVSS38C. Por 14S una relación concentración-respuesta se puede encontrar, que muestra la interacción de PVSS38C con un epítopo presente exclusivamente en 14S. No hay interacción significativa con N-, ni H-antígeno se puede detectar, aunque un insignificante no específica capturar a concentraciones muy altas se nota.

Figura 3
Figura 3. Magnética perlas de captura por afinidad de los antígenos de poliovirus diferentes por nanocuerpos NB1 figura 2 es por lo tanto, sólo debido a la afinidad específica de la nanocuerpos hacia sus antígenos.

Figura 4.
Figura 4. Reproducibilidad del ensayo. El valor medio de la radiactividad porcentaje en el sobrenadante se representa como una función de la concentración de Nanobodies. El experimento se repitió ocho veces en días diferentes y por diferentes personas. La desviación estándar se representa como barras verticales.

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Discussion

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En el protocolo, la radiactividad de la interacción con el antígeno nanocuerpos se define como la pérdida de virus radiomarcado a partir del sobrenadante. Por lo tanto la cantidad de radiactividad precipitada (= 100 - un%) (unido a las perlas magnéticas) se puede estimar en una forma indirecta por la radioactividad en el sobrenadante (= un%). Por otro lado, también es posible medir la radiactividad de la fracción precipitada la envolvente de antígeno en una forma particular a eluyendo los inmunocomplejos de las perlas magnéticas con 500 mM de imidazol. Se demostró previamente 11 que hay una coincidencia perfecta entre la cantidad total de radiactividad y la suma de la radiactividad en las fracciones sobrenadante y sedimento. Por tanto, es aceptable y ahorro de tiempo para medir la radiactividad del sobrenadante. El método para la elución de los inmunocomplejos de las perlas magnéticas se describe por Thys et al., 2011 11.

ApaRT de poliovirus, otros picornavirus se sabe que son sensibles a la superficie sólida inducida conversión conformacional, como el pie de importancia económica y el virus de la fiebre aftosa (VFA) 2. La alteración de la forma y la reducción de la afinidad de unión de proteínas en general después de unirse a los plásticos se describe en la literatura 12. El ensayo por lo tanto, podría ser utilizado para investigar la interacción entre otras proteínas que son sensibles a los cambios conformacionales, para el mapeo de epítopo, para definir la cantidad de proteínas correctamente plegadas, para la detección de impurezas relacionadas con la estructura durante los procesos de producción, para la detección rápida de lotes durante producción, para la purificación de las muestras que son mezclas de proteínas estrechamente relacionadas y muchas otras aplicaciones puede ser pensado. La disponibilidad de diferentes perlas magnéticas con afinidad por diferentes etiquetas apoya estas posibilidades. Aunque marcadores radiactivos fueron utilizados en estos experimentos, otras señales podríanponerse en práctica para detectar y cuantificar las interacciones, como los tintes fluorescentes 13,14. Muchas muestras pueden ser analizadas durante un experimento y es posible automatizar el método. Las perlas magnéticas utilizadas en este ensayo puede ser fácilmente re-utilizado por sólo una etapa de ebullición, de agotamiento y regeneración, lo que hace que este un método barato. Hasta la fecha, cinco de estos ciclos de regeneración de las perlas no afecta a la reproducibilidad de los resultados (datos no presentados).

Además, se puede considerar como un método específico, ya que nanocuerpos específicos que se utilizan sólo reconocen su antígeno, ya que eran capaces de interactuar de forma diferente con el poliovirus N y H-antígenos y la subunidad 14S.

Se puede concluir que este ensayo de captura de afinidad utilizando perlas magnéticas es un ensayo con una amplia gama de aplicaciones posibles que es fiable, sencilla, cuantitativa específica, el ahorro de tiempo y de bajo costo.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen al personal del departamento de Biotecnología Farmacéutica y Biología Molecular y sobre todo Pelsmacker Monique De la preparación del virus de la etiqueta radiactivo. Estamos muy agradecidos a Elena de Merckx y Hadewych Halewyck por sus interesantes comentarios y discusiones y Gerrit De Bleeser por su ayuda en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado financieramente por un subsidio OZR de la Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) y la Organización Mundial de la Salud (TSA 200 410 791). Lise Schotte es un becario predoctoral del Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown Invitrogen 101.03D Magnetic beads
Optiphase ’HiSafe’ 2 PerkinElmer, Inc. 1200 - 436 Scintillation fluid

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References

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Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).More

Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).

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