Summary
एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो के प्रारंभिक जीवन तनाव पर डीएनए मेथिलिकरण और जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों का अध्ययन दिखाया है. नवजात चूहों के और असतत मस्तिष्क के ऊतकों के अलगाव की मातृ जुदाई से शुरू, हम करने के लिए एक साथ मस्तिष्क के ऊतकों घूंसे से बाद bisulfite अनुक्रमण और RT-पीसीआर विश्लेषण के लिए डीएनए और आरएनए अलग प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करते हैं.
Abstract
भोजन करने के लिए एक्सपोजर, और दवाओं प्रारंभिक जीवन विपत्ति जीवन 1,2 की संवेदनशील खिड़कियों के दौरान जीन अभिव्यक्ति में स्थायी परिवर्तन है कि शारीरिक और व्यवहार phenotypes का प्रदर्शन करने के लिए योगदान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. जैसे पर्यावरण प्रोग्रामिंग चयापचय, हृदय और मानसिक रोगों 3,4 करने के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि की संभावना है.
डीएनए मेथिलिकरण histone संशोधनों जीन पर्यावरण बातचीत की मध्यस्थता में प्रमुख प्रक्रियाओं पर विचार कर रहे हैं और पर्यावरण प्रोग्रामिंग 5 बुनियाद भी दिखाई. स्तनधारियों में, डीएनए मेथिलिकरण साइटोसिन की 5 CPG dinucleotides के संदर्भ में स्थिति पर आम तौर पर एक मिथाइल समूह के सहसंयोजक अलावा शामिल हैं.
CPG मेथिलिकरण एक अत्यधिक ऊतकों और सेल विशिष्ट मस्तिष्क जहां सेलुलर विविधता है उच्च है और ऊतक मात्रा सीमित असतत, छोटे क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए एक चुनौती बना ढंग में होता है. इसके अलावा ख,ecause जीन अभिव्यक्ति और मेथिलिकरण निकट घटनाओं जुड़े हुए हैं, मूल्य में वृद्धि हुई है एक ही नमूना में दोनों मानकों की तुलना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
यहाँ, मस्तिष्क में epigenetic प्रोग्रामिंग की जांच के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल (चित्रा 1) निदर्शी प्रयोजनों के लिए प्रारंभिक जीवन प्रतिकूल परिस्थितियों का 'मातृ जुदाई' प्रतिमान का उपयोग कर प्रस्तुत किया है. प्रोटोकॉल विभिन्न आयु वर्ग के माउस से जो डीएनए और शाही सेना एक साथ अलग किया जा सकता है दिमाग से micropunches की तैयारी का वर्णन है, इस प्रकार एक ही नमूने में डीएनए और मेथिलिकरण जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति देता है.
Protocol
1. प्रारंभिक जीवन दुर्भाग्य से प्रोग्रामिंग
मातृ जुदाई (एमएस) के लिए समय गर्भवती C57BL/6N चूहों (जन्म के दिन पर प्रसव के बाद का दिन 0 (P0)) के द्वारा दिया पिल्ले में प्रारंभिक जीवन तनाव (एल्स) प्रेरित किया जाता है.
- व्यक्तिगत litters साफ पिंजरों में रखा जाता है (हीटिंग पैड के साथ) P1-10 से 3 घंटे दैनिक के लिए.
- नियंत्रण पिल्ले (गैर एल्स) भर में मातृ घोंसला में undisturbed रहते हैं.
- पिल्ले (p21) दूध छुड़ाने का वायु, जो समय के बाद वे मानक प्रयोगशाला पशु आवास की स्थिति के तहत यौन संबंध मिलान समूहों (पिंजरे प्रति 3-5 चूहों) में रखे जाते हैं जब तक अपनी मां के साथ रखा जाता है.
2. अलगाव और मस्तिष्क के ऊतकों के विच्छेदन
- चूहे अव्यवस्था ग्रीवा नोट द्वारा वांछित उम्र में मारे गए हैं: क्योंकि यह प्रोटोकॉल तनाव प्रतिमान शामिल है, कोई संज्ञाहरण पूर्व ग्रीवा अव्यवस्था के लिए दिया जाता है, सामान्य शारीरिक तनाव हार्मोन के विनियमन के साथ हस्तक्षेप से बचने के. खोपड़ी खोला और कर रहे हैंदिमाग सावधानी से हटा दिया और तुरंत तस्वीर - जमे हुए आईएसओ पैंटेन सूखी बर्फ में विसर्जन से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा रहा है,
- दिमाग cryosectioned (10 माइक्रोन मोटाई) हैं, वर्गों Superfrost गिलास स्लाइड पर बढ़ रहे हैं और -20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा PVN - विजय - स्तम्भ PVN, शीर्षस्थान के स्तर पर शुरू वर्गों इकट्ठा एक मानक माउस stereotaxic एटलस संदर्भ (जैसे 6 Paxinos) संरचनात्मक परिशुद्धता सत्यापित करने के लिए और ब्याज क्षेत्र (paraventricular नाभिक में न्यूरॉन्स के लिए जैसे के शामिल किए जाने को सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है -0.75 के लिए -0.85).
- धारा cresyl बैंगनी दाग कर रहे हैं करने के लिए अलग मस्तिष्क संरचना की पहचान की सुविधा. हित के क्षेत्रों के घूंसे (0.8 मिमी) (जैसे PVN) से लोको microdissection में प्राप्त कर रहे हैं.
3. ब्रेन घूंसे से न्यूक्लिक एसिड निकालना
साथ ही छोटे neuroanatomically परिभाषित मस्तिष्क reg से डीएनए और आरएनए को निकालने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉलbisulfite और जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए आयनों 7 वर्णित है.
नोट: यह देखते हुए कि शाही सेना के गोरखा प्रशिक्षण केन्द्र-बफर में डीएनए से कम स्थिर है, हम शाही सेना 1 प्रसंस्करण की सलाह देते हैं. homogenate की डीएनए शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया उस समय के दौरान कमरे के तापमान (आर टी) में रखा जा सकता है.
- के 400 guanidinium thiocyanate (जीटीसी) बफर (4.5 एम guanidinium thiocyanate, 2% एन - lauroylsarcosine., 50 मिमी EDTA के पीएच 8.25 मिमी Tris - एचसीएल 7.5 पीएच, 0.1 एम बीटा - mercaptoethanol के 0.2% antifoam के μl में एक विंदुक और vortexer का उपयोग घूंसे Homogenize ए आर टी) में, एक चमड़े के नीचे (29G) सिरिंज (चित्रा 2) के माध्यम से कई बार गुजर रहा है.
- बराबर भागों में विभाजित lysate, दोनों शाही सेना और डीएनए एक ही समय में निकाला जा सकता है या अलग, विशेष रूप से प्रयोगात्मक जरूरतों पर निर्भर करता है.
- (24:1) isoamyl lysate: शाही सेना के शुद्धिकरण के लिए NaOAc के 1/10 मात्रा, मात्रा 1 (Appligene में) AquaPhenol (4 पीएच) और क्लोरोफॉर्म के 1/2 मात्रा जोड़ने. और हर कदम के बाद सख्ती भंवर70% EtOH के एक बराबर मात्रा जोड़ने aequous चरण, 10 मिनट, अपकेंद्रित्र (4 पर 10,000 जी पर 20 मिनट डिग्री सेल्सियस) के लिए बर्फ पर सेते हैं
- एक शाही सेना स्पिन स्तंभ (जैसे Macherey Nagel से Nucleospin शाही सेना द्वितीय) के लिए इस मिश्रण हस्तांतरण और प्रदर्शन पर स्तंभ DNase पाचन और धोने कदम (निर्माता प्रोटोकॉल का पालन), 25 μl एच 2 ओ में elute शाही सेना
- क्विएज़न DNeasy रक्त और ऊतक किट के एक अनुकूलित प्रोटोकॉल डीएनए शुद्धि के लिए प्रयोग किया जाता है. संतुलित करना बफर अल के बराबर मात्रा और 100% EtOH, एक स्पिन स्तंभ अपकेंद्रित्र पर लोड (आरटी में 10,000 जी में 1 मिनट) के साथ lysate और प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- स्तंभ के लिए 500 5 μl RNase (1 मिलीग्राम / एमएल) सहित μl AW1 बफर जोड़ें और आरटी पर 10 मिनट सेते हैं. स्पिन (10,000 जी में 1 मिनट, आर टी) और प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- 500 μl बफर AW2 साथ स्तंभ धो, प्रवाह के माध्यम से और स्पिन शुष्क खाली स्तंभ (15,000 जी में 1 मिनट) त्यागें.
- जोड़ें prewarmed (70 डिग्री सेल्सियस) बफर AE और 10 मिनट के लिए सेते हैं कॉलम 70 में डिग्री सेल्सियस Centrifugation द्वारा Elute (1 मि10,000 g), प्रवाह के माध्यम से फिर से लागू और centrifugation कदम दोहराएँ.
एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए डीएनए और शाही सेना सांद्रता निर्धारित करने के लिए. एक ठेठ पंच पैदावार PVN ~ 600 एनजी डीएनए और ~ 400 एनजी शाही सेना. मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए, हम आम तौर पर रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में शाही सेना के ~ 100 एनजी का उपयोग करें.
4. Bisulfite रूपांतरण
सोडियम bisulfite uracils गैर - methylated cytosines के साथ परिवर्तित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके विपरीत, methylated cytosines के रूपांतरण से संरक्षित कर रहे हैं. इसलिए, सभी cytosines कि bisulfite पीसीआर - amplicon के अंतिम अनुक्रमण में पता चला रहे हैं methylated cytosines के प्रतिनिधित्व करते हैं.
Bisulfite रूपांतरण जो एक सीमित कारक पीसीआर विश्लेषण में हो सकता है पर्याप्त डीएनए गिरावट का कारण बनता है. अनुकूलित प्रतिक्रिया शर्तों साइटोसिन रूपांतरण को अधिकतम करने के लिए, डीएनए विखंडन को कम करने और कम तापमान पर भी एकल असहाय डीएनए को बनाए रखने का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता हैक्विएज़न EpiTect bisulfite किट. हमारे हाथ में ~ micropunches से शुद्ध डीएनए के 200 एनजी bisulfite प्रतिक्रिया के लिए सामग्री शुरू करने के लिए पर्याप्त राशि प्रदान करते हैं.
रूपांतरण प्रतिक्रिया की क्षमता में अंतर को रोकने के लिए, टेम्पलेट डीएनए की राशि सभी एक प्रयोग के दौरान संसाधित नमूनों के बीच लगातार रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, अनुक्रम रूपांतरण दक्षता के लिए गैर परिवर्तित गैर CpGs की दर की जांच के द्वारा जांच की जानी चाहिए पढ़ता है. यह दर 98% से अधिक होना चाहिए. निम्न मानों को अधूरा या अक्षम bisulfite रूपांतरण से संकेत मिलता है और अंतर्निहित अनुक्रम विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए.
5. Bisulfite पीसीआर
- मिथाइल प्राइमर एक्सप्रेस सॉफ्टवेयर (, डिजाइन bisulfite प्राइमरों है कि bisulfite परिवर्तित (चर्चा देखें) डीएनए के लिए विशिष्ट हैं अनुक्रमण https://products.appliedbiosystems.com/abएन / अमेरिका / / / adirect अब अध्यक्ष तथा प्रबंध निदेशक = catNavigate2 catID और = 602,121) इस सहायता और पायलट प्रयोगों में इष्टतम annealing के तापमान को निर्धारित करने में मदद करेगा?
- पीसीआर मास्टर मिक्स एक प्रतिक्रिया के लिए तैयार के रूप में निम्नानुसार है:
2.5 μl 10x पीसीआर बफर
0.5 μl 10 मिमी dNTPs
1 μl 10 माइक्रोन आगे प्राइमर
1 μl 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर
0.125 μl क्विएज़न Hotstart Taq प्लस
23 μl के लिए एच 2 हे के साथ भरें - प्रतिक्रिया 2 μl डीएनए bisulfite - इलाज जोड़ें.
- निम्नलिखित शर्तों का उपयोग बढ़ाना:
1 6 चक्र मिनट 95 डिग्री सेल्सियस
1 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस के 45-50 चक्र, इष्टतम annealing के तापमान में 1 मिनट, 1 मिनट 72 डिग्री सेल्सियस
एक चक्र 5 मिनट 72 ° C
Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद के 7 μl का विश्लेषण करने के लिए amplicon के आकार की पुष्टि के लिए और शेष बाद के ligation के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर स्वच्छ (किट का उपयोग कर शुद्ध जैसे Macherey - नाजेल Nucleospin) निकालें. मामले में अतिरिक्त अवांछित पीसीआर उत्पादों को प्राप्त कर रहे हैं, जेल शुद्धि की सिफारिश की है.
6. Bisulfite अनुक्रमण
उच्च संकल्प डीएनए मेथिलिकरण प्रोफाइल एकल क्लोन रीडिंग के deduced से डीएनए मेथिलिकरण में छोटे परिवर्तन का पता लगाने और विनियामक क्षेत्रों है कि उपचार (पर्यावरण प्रोग्रामिंग) के लिए उत्तरदायी हैं की पहचान कर सकते हैं. bisulfite अनुक्रमण प्रक्रिया लगातार तीन काम कर कदम शामिल हैं. सबसे पहले, एक सदिश में ligated पीसीआर पूर्व bisulfite पीसीआर द्वारा प्राप्त उत्पादों रहे हैं और बैक्टीरिया के रूप में तब्दील. दूसरे, एक क्लोन से कॉलोनी पीसीआर डालने का सही आकार का निर्धारण करने के लिए कार्यरत है. तीसरा, सकारात्मक कॉलोनी PCRs साफ कर रहे हैं और बड़ी डाई अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए अधीन है. सफाई एक कदम के बाद, उत्पादों एक केशिका अनुक्रमक पर electrophoresed कर रहे हैं.
6.1 Ligation और परिवर्तन
नोट: हम नियमित रूप से pGEM टी वेक्टर सीएल का उपयोगoning किट (Promega). हमारे अनुभव में, क्लोनिंग दक्षता ligated जा डालने पर निर्भर करता है. अलग वैक्टर पुनः संयोजक क्लोन की कम संख्या के मामले में बार - बार प्राप्त कर रहे हैं परीक्षण किया जाना चाहिए.
- बंधाव प्रतिक्रिया सेट करें:
5 μl 2x Ligation बफर
1 μl pGEM टी वेक्टर
1 -4-ligase μl
3 μl साफ - पीसीआर उत्पाद - Pipetting और रात में सेते हैं द्वारा 4 पर प्रतिक्रिया मिश्रण डिग्री सेल्सियस
नोट: Ligation एक घंटे के लिए भी हो सकता है किया जाता है के रूप में अच्छी तरह से आरटी पर. पुनः संयोजक क्लोन की संख्या में वृद्धि करने के लिए, 4 बजे रात बंधाव से अधिक डिग्री सेल्सियस पसंद है.
- इथेनॉल घन द्वारा ligation के उत्पादों की साफ अप:
- 1 μl ग्लाइकोजन, 1 μl 3M राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद और 25 μl 100% बंधाव और तरल नाइट्रोजन में 1 मिनट के लिए प्रतिक्रिया वेग EtOH के जोड़ें.
- अपकेंद्रित्र (30 मिनट के लिए 4 में 15,0000 जी ° C) और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 300 μl साथ धो डालें70% EtOH है और अपकेंद्रित्र (4 बजे 20 मिनट के लिए 15,000 जी ° सी), आर टी (10 मिनट) में सतह पर तैरनेवाला और शुष्क गोली त्यागें.
- 10 μl एच 2 ओ में resuspend गोली
Electrocompetent बैक्टीरिया में 6.2 ligation के उत्पादों के परिवर्तन
- Precool बर्फ और बर्फ पर electrocompetent DH5α बैक्टीरिया का पिघलना अशेष भाजक पर electroporation cuvettes (1 मिमी की चौड़ाई).
- 10 बंधाव उत्पाद साफ μl (ऊपर देखें) के लिए 45 μl DH5α बैक्टीरिया जोड़ें और क्युवेट करने के लिए स्थानांतरण.
- 1.5 केवी, 200 Ω, 15 μF में बैक्टीरिया रूपांतरण और नाड़ी प्रसव के बाद सीधे prewarmed सिसकी मध्यम के 1 मिलीग्राम जोड़ें.
- 37 डिग्री सेल्सियस, 1 ज के लिए बैक्टीरिया पुनर्प्राप्त / एम्पीसिलीन साथ IPTG / एक्स - लड़की लेपित प्लेटें लेग पर निलंबन की 100 μl फैल गया.
- 37 पर रात भर प्लेटें डिग्री सेल्सियस सेते हैं
6.3 कालोनी पीसीआर
नोट: एकल क्लोन से कालोनी पीसीआर करने के लिए सुनिश्चित करें कि आवेषण आयोजित किया जाता हैभविष्यवाणी आकार की. नीले / सफेद स्क्रीनिंग, ligation, oligomeric प्राइमर जोड़े का समावेश या छोटा पीसीआर उत्पादों के दौरान अवांछित पुनर्संयोजन घटनाओं से विलंबित रंग विकास अन्यथा दोषपूर्ण अनुक्रमण परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हम नियमित T7 और SP6 प्राइमरों का उपयोग करने के लिए क्लोन आवेषण को बढ़ाना, लगभग 150 बीपी के अतिरिक्त वेक्टर दृश्यों में इस दृष्टिकोण का परिणाम है. T7 प्राइमर बाद में एक चरण में अनुक्रमण प्रतिक्रिया में प्रयोग किया जाता है.
- कॉलोनी पीसीआर प्रतिक्रिया में 96 अच्छी तरह से थाली सेट. एक प्रतिक्रिया उपयोग के लिए:
3 μl 2.5 मिमी 2 MgCl
2.5 μl 10x Taq बफर
1.5 μl 10 मिमी dNTP
2 μl 2.5 मिमी T7 प्राइमर
2 μl 2.5 मिमी SP6 प्राइमर
1 μl Fermentas Taq पोलीमरेज़
25 μl के लिए एच 2 हे के साथ भरें - / प्रत्येक अच्छी तरह से में मास्टर मिश्रण अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली के 25 μl बांटना.
- विंदुक टिप और डुबकी के साथ थाली से पीसीआर प्रतिक्रिया में सकारात्मक क्लोन (सफेद) उठाओ.
- Fol का उपयोग बढ़ानाlowing शर्तों:
1 में 95 चक्र 4 मिनट डिग्री सेल्सियस
94 में 10 चक्र 30 डिग्री सेल्सियस, 56 में 30 डिग्री सेल्सियस और 72 पर 30 डिग्री सेल्सियस
94 में 30 चक्र 30 डिग्री सेल्सियस, 48 में 30 है डिग्री सेल्सियस और 72 पर 30 डिग्री सेल्सियस
72 पर 1 चक्र 5 मिनट डिग्री सेल्सियस - एक agarose जेल पर कॉलोनी पीसीआर 5 μl लोड और प्रतिक्रियाओं है कि सही डालने के आकार का निर्धारण.
- कालोनी वांछित amplicons युक्त PCRs को साफ कर रहे हैं एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (Machery Nagel Nucleofast) का उपयोग.
6.4 बिग डाई टर्मिनेटर प्रतिक्रिया और अनुक्रमण
- बड़ी डाई प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें. एक प्रतिक्रिया उपयोग के लिए:
1 μl एच 2 हे
0.5 μl बिग डाई अभिकर्मक
1.5 μl अनुक्रमण बफर - Μl / 96 अच्छी तरह से थाली की हर अच्छी तरह से में अच्छी तरह से अच्छी तरह से साफ कॉलोनी पीसीआर उत्पाद के 2 μl जोड़ने और निम्नलिखित मानकों के साथ एक thermocycler पर प्रतिक्रिया चलाने के प्रत्येक के लिए 3, बांटना: 96 पर 35 10 के चक्र डिग्री सेल्सियस, 5 के 50 डिग्री सेल्सियस और 60 में 4 मिनट डिग्री सेल्सियस
- बिग - डाई प्रतिक्रिया को साफ किया जाता है एक वाणिज्यिक किट (Millipore 96 संग्रथित क्लीन - अप किट अनुक्रमण) का उपयोग और एक केशिका sequencer (जैसे अबी 3100 डीएनए) पर संसाधित.
- दृश्यों BIQ (विश्लेषक का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) या ऑनलाइन उपकरण BISMA ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) जांच डीएनए क्षेत्र (चित्रा 4) के मेथिलिकरण पैटर्न प्राप्त.
7. प्रतिनिधि परिणाम
AVP अभिव्यक्ति और मेथिलिकरण स्थिति पर एल्स के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, C57BL/6N चूहों ऊपर वर्णित वर्कफ़्लो के अनुसार प्रोसेस किया गया. संक्षेप में, C57BL/6N चूहों के एक समूह थाएल्स के लिए ubjected जबकि नियंत्रण समूह undisturbed छोड़ दिया गया था. PVN और supraoptic नाभिक (बेटे) मुक्का मारा गया और एक घूंसे से डीएनए और शाही सेना एक साथ अलग थे. शाही सेना रिवर्स और लिखित AVP टेप के स्तर qPCR विश्लेषण और Hprt और GAPDH गृह व्यवस्था जीन की अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत द्वारा मापा गया था. डीएनए bisulfite इलाज किया था, AVP बढ़ाने (चित्र 4a) और पीसीआर उत्पादों विशिष्ट प्राइमरों के साथ प्रवर्धित गया क्लोन और अनुक्रम. प्रत्येक माउस / पीसीआर से 20 कम से कम पुनः संयोजक क्लोन से पीसीआर amplicon (4b चित्रा) में निहित CpGs के लिए मेथिलिकरण आवृत्तियों का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया गया. नियंत्रण की तुलना में एल्स CpG10, CpG13 CpG12 और Cpg14 (AVP बढ़ाने की <0.05 पी, एन = 6-8 पशुओं) में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक जीवन के अनुभवों के माध्यम से epigenetic इस विनियामक क्षेत्र के अंकन सुझाव hypomethylation प्रेरित किया. PVN, की मेथिलिकरण के विपरीतAVP बढ़ाने बेटे illustrating के के epigenetic अंकन (चित्रा 4c) ऊतक विशिष्टता में एल्स से अप्रभावित रहा था. डीएनए मेथिलिकरण स्थिति के विश्लेषण CpG10 और AVP जीन नियंत्रण पशुओं में अभिव्यक्ति में (n = 6) एक नकारात्मक सहसंबंध AVP जीन अभिव्यक्ति (चित्रा 4d) के ठीक ट्यूनिंग में डीएनए मेथिलिकरण की भूमिका की ओर इशारा करते सबूत है.
चित्रा 1. Micropunches नियंत्रण और प्रारंभिक जीवन पर जोर दिया चूहों से विच्छेदित दिमाग से प्राप्त कर रहे हैं. डीएनए और शाही सेना के अलगाव के बाद, जीन अभिव्यक्ति qRT-पीसीआर द्वारा निर्धारित किया जाता है, जबकि bisulfite इलाज डीएनए प्रवर्धित और शुद्ध उत्पादों नीले / सफेद चयन के द्वारा एक उपयुक्त वेक्टर पुनः संयोजक क्लोन की पहचान की अनुमति में क्लोन कर रहे हैं. सही डालने के आकार के द्वारा सत्यापित कर रहे हैंकॉलोनी पूर्व बिग डाई और एक केशिका अनुक्रमक पर प्रतिक्रिया प्रसंस्करण बाहर ले जाने के लिए पीसीआर. मेथिलिकरण पैटर्न उपयुक्त सॉफ्टवेयर उपकरण द्वारा देखे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 2 / शाही सेना डीएनए निष्कर्षण से bisulfite अनुक्रमण करने के लिए समयरेखा.
चित्रा 3 डीएनए और आरएनए के साथ - साथ निष्कर्षण के लिए कार्यप्रवाह. hypothalamic paraventricularis नाभिक, एक छोटे AVP व्यक्त जीन मस्तिष्क क्षेत्र के पंच 400 μl GTA बफर में रखा गया है, vortexed तक बाधित है और एक सिरिंज (29G) के माध्यम से गुजर से आगे homogenized. homogenate तो शाही सेना और डीएनए की शुद्धि के लिए विभाजित है. विभाजन 1:01 हो या विभिन्न अनुपात के आधार कर सकते हैंविशेष रूप से प्रयोगात्मक प्रश्न पर. Homogenates कुछ घंटे के भीतर कार्रवाई की जानी चाहिए.
चित्रा 4 6 सप्ताह पुरानी नियंत्रण और एल्स पशुओं में AVP ठिकाना पर CPG मेथिलिकरण. (ए) AVP और ऑक्सीटोसिन जीन केंद्रित पूंछ पूंछ की योजना और intergenic क्षेत्र (IGR) द्वारा अलग. Exons खुले बक्से (गिने) द्वारा चित्रित कर रहे हैं. CPG अवशेषों का वितरण संकेत है और बोल्ड लाइन द्वारा आकार और संबंधित पीसीआर CpG14 CPG से 10 युक्त amplicon की स्थिति के रूप में चिह्नित है. (बी) AVP बढ़ाने के नियंत्रण और एल्स पशुओं में PVN में मेथिलिकरण (एन = 6-8). (सी) नियंत्रण और एल्स पशुओं में बेटे (एन = 8-10) में AVP बढ़ाने के मेथिलिकरण. (डी) AVP जीन अभिव्यक्ति सहसंबद्ध थामेथिलिकरण साथ CpG10 पर (n = 6). यहाँ बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें .
Discussion
Epigenetic प्रोग्रामिंग तेजी से एक महत्वपूर्ण अंतर्निहित तंत्र स्वास्थ्य और रोग के रूप में मान्यता प्राप्त है. यहाँ हम micropunches और bisulfite अनुक्रमण के माध्यम से डीएनए मेथिलिकरण प्रोफाइल प्राप्त करने के बाद कदम से डीएनए और आरएनए के साथ अलगाव के लिए एक परिष्कृत विधि प्रस्तुत करते हैं. अनुकूलित वर्कफ़्लो पर्यावरण stimuli करने के लिए प्रतिक्रिया में मस्तिष्क में epigenetic प्रोग्रामिंग की सुविधाजनक विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण डीएनए मेथिलिकरण और जीन अभिव्यक्ति के रूप में दोनों एक ही नमूना से विश्लेषण कर रहे हैं के बीच कार्यात्मक संबंध की जांच की सुविधा. अंत में, जानवरों के प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या काफी कम किया जा सकता है.
कुछ सावधानियों और दिशा निर्देशों का पालन किया जाना चाहिए, जबकि प्रस्तुत कार्यप्रवाह प्रदर्शन है. असाधारण जटिलता और मस्तिष्क की विविधता को देखते हुए और मेथिलिकरण और अभिव्यक्ति पैटर्न के बाद से सेल और ऊतक के विशिष्ट ढंग से भिन्न हो सकते हैं यह अत्यंत का हैमहत्व micropunching कि एक मानकीकृत तरीके से किया जाता है. बिंदु में एक मामले के रूप में, AVP की epigenetic प्रोग्रामिंग paravaventriuclar में पता चला है, लेकिन नहीं supraoptic नाभिक में (4b-घ चित्रा), दो AVP 4 hypothalamus के क्षेत्रों व्यक्त. इस संबंध में, डीएनए और आरएनए के ही ऊतक पंच से उपलब्धता निश्चित ऊतक विशेष मार्कर जीनों के शाही सेना अभिव्यक्ति कुछ मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए प्रमाणित करते हैं कि सही क्षेत्र छिद्रित किया गया था के रूप में लाभप्रद है. हालांकि micropunching सेलुलर विजातिता को कम कर सकते हैं, यह करने के लिए याद किया है कि इस दृष्टिकोण एकल कोशिका प्रकार या आबादी के अलगाव के लिए नेतृत्व नहीं करता है. अतिरिक्त शोधन कदम इस विषय को संबोधित करने के लिए विचार किया जा सकता है.
के लिए पीसीआर प्रवर्धन निम्नलिखित bisulfite उपचार के लिए इष्टतम प्रथम डिजाइन अनुक्रमण bisulfite आवश्यक है. पीसीआर लंबाई में 400 बीपी से अधिक उत्पादों समस्याग्रस्त ख डीएनए के क्षरण के कारण हो सकता हैisulfite उपचार. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि नेस्टेड पीसीआर पक्षपाती परिणाम देने के लिए अगर केवल कुछ ही बरकरार टेम्पलेट्स प्रवर्धन प्रक्रिया में योगदान कर सकते हैं. प्राइमर जोड़े कि संशोधित amplicon के लिए विशिष्ट हैं डिजाइन किया जाना चाहिए, उनके दृश्यों CPG dinucleotides शामिल नहीं करने में मेथिलिकरण पक्षपाती प्रवर्धन से बचने के चाहिए. इसके अलावा, प्राइमरों गैर - CPG cytosines के होते असंशोधित या अधूरे परिवर्तित डीएनए का प्रवर्धन को रोकने चाहिए. कुछ टेम्पलेट्स का प्रवर्धन गर्म शुरू पीसीआर आयोजन से लाभ हो सकता है. किसी भी मामले में, प्राइमर जोड़े की उपयुक्तता पायलट प्रयोगों में सत्यापित किया जाना चाहिए के रूप में इतना मूल्यवान प्रयोगात्मक नमूनों की विकृति को रोकने के लिए.
Bisulfite अनुक्रमण साइट विशेष मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए एक मानक विधि का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में इसे और मज़बूती से ठीक एक एलील विशिष्ट 8 तरीके से एक CPG अवशेषों की मेथिलिकरण का पता लगाने में सक्षम है. पीसीआर उत्पाद के प्रत्यक्ष अनुक्रमण मिश्रित मेथिलिकरण ओ के रूप में सलाह नहीं दी हैपिता CPG अवशेषों / सी टी electropherogram में डबल चोटी है, जो संबंधित साइट पर मेथिलिकरण की मात्रा का ठहराव रोका जा सकता है के रूप में दिखाई देगा. इस कारण के लिए एक मध्यवर्ती क्लोनिंग कदम आयोजित किया जाता है और कई क्लोन (20-30 ~~) अनुक्रम मेथिलिकरण की सीमा निर्धारित है. Pyrosequencing डीएनए मेथिलिकरण यों के लिए एक वैकल्पिक पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है. यह भी bisulfite रूपांतरण और bisulfite पीसीआर बजाय क्लोनिंग और अनुक्रमण amplicon जहां एक CPG अवशेषों के मेथिलिकरण स्थिति एक सी / टी एकल nucleotide बहुरूपता है कि आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है के रूप में पढ़ा है एक प्रत्यक्ष pyrosequencing प्रतिक्रिया के अधीन है, लेकिन का उपयोग किया जाता है. दोनों तरीकों 9 मेथिलिकरण की समान स्तर का पता लगाने, लेकिन बाद से क्लोनिंग कदम छोड़े गए किया जा सकता है pyrosequencing अधिक समय कुशल है. हालांकि, टेम्पलेट के आधार पर 40-100 केवल nucleotides एक बार अनुक्रम किया जा सकता है ताकि अलग अनुक्रमण प्राइमर के साथ pyrosequencing के कई दौर के लिए आवश्यक हैं. यह एक महत्वपूर्ण सीमा है था दिया,डीएनए की टी उच्च मात्रा में (1 के बारे में प्रतिक्रिया के प्रति μg) की आवश्यकता है, निकट है जो छोटे मस्तिष्क के ऊतकों घूंसे से उपलब्ध मात्रा से अधिक कर रहे हैं. इस प्रकार कई kilobases की श्रेणी में क्षेत्रों की pyrosequencing द्वारा प्रारंभिक स्कैनिंग कम एकल क्लोन पढ़ने के रूप में अनुकूल दिखाई देता है. फिर भी, ब्याज pyrosequencing के एक छोटे से क्षेत्र की पहचान के बाद विचार किया जाना चाहिए.
सामूहिक रूप से, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल epigenetic परिवर्तन के लिए मस्तिष्क micropunches की तेजी से और लागत प्रभावी विश्लेषण के लिए एक सटीक, कुशल और सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करता है. एकाधिक नमूनों को एक ही समय में संसाधित किया जा सकता है और तरीकों उपयुक्त हैं जब मध्यवर्ती आकार प्रयोगों से नमूने चल रहा है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के मनश्चिकित्सा मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट और यूरोपीय संघ मैरी क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क (NINA 238,665 अनुबंध) के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 | |
| Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |
References
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