Summary
Un flux de travail simplifié pour étudier méthylation de l'ADN et des modifications d'expression des gènes lors de début de la vie de stress est montré. A partir de la séparation maternelle des souriceaux nouveau-nés et l'isolement des tissus cérébraux distincts, nous représentons un protocole à la fois isoler l'ADN et l'ARN à partir de poinçons de tissus cérébraux pour le séquençage du bisulfite de suite et analyse RT-PCR.
Abstract
L'exposition à l'alimentation, les médicaments et l'adversité au cours de la vie au début fenêtres sensibles de la vie 1,2 peut conduire à des changements durables dans l'expression des gènes qui contribuent à l'affichage des phénotypes physiologiques et comportementaux. Cette programmation de l'environnement est susceptible d'augmenter la susceptibilité à métaboliques, les maladies cardio-vasculaires et mentales 3,4.
Méthylation de l'ADN et des modifications des histones sont considérés comme des processus clés dans la médiation du dialogue gènes-environnement et semblent aussi sous-tendaient la programmation de l'environnement 5. Chez les mammifères, méthylation de l'ADN comprend typiquement l'addition covalente par un groupe méthyle à la position 5 de la cytosine dans le contexte de dinucléotides CpG.
Méthylation de CpG se produit de façon hautement tissu-spécifique de cellule et qui en fait un défi à étudier, des petites régions discrètes du cerveau, où l'hétérogénéité cellulaire est haute et la quantité de tissu limitée. En outre, barce que l'expression des gènes et de méthylation sont étroitement liés les événements, une valeur accrue peut être obtenue en comparant les deux paramètres dans le même échantillon.
Ici, un protocole étape par étape (Figure 1) pour l'enquête de la programmation épigénétique dans le cerveau est présenté en utilisant le paradigme du «séparation maternelle» de l'adversité début de la vie à des fins d'illustration. Le protocole décrit la préparation de micropunches de cerveaux de souris différentiellement d'âge à partir duquel l'ADN et l'ARN peuvent être simultanément isolés, permettant ainsi méthylation de l'ADN et les analyses d'expression génique dans le même échantillon.
Protocol
1. Programmation par l'adversité de la vie précoce
La séparation de la mère (MS) est effectuée pour induire en début de vie sans stress (ELS) chez les bébés souris fournis par C57BL/6N timed-enceintes (jour postnatal 0 (P0) le jour de naissance).
- Portées individuels sont placés dans des cages propres (avec un coussin chauffant) pendant 3 h tous les jours de P1-10.
- Témoin (non-ELS) chiots ne sont pas perturbés dans le nid maternel à travers.
- Les chiots sont gardés avec leur mère jusqu'au sevrage (P21), après quoi ils sont logés en groupe sexe-appariés (3-5 souris par cage) dans des conditions standard de laboratoire de logement des animaux.
2. L'isolement et la dissection du tissu cérébral
- Les souris sont tués à des âges souhaités par une note col de l'utérus dislocation:. Parce que ce protocole implique un paradigme du stress, aucune anesthésie n'est donnée avant la dislocation cervicale, pour éviter d'interférer avec la régulation physiologique normale d'hormones de stress. Crânes sont ouvertes etcerveaux sont soigneusement enlevés et immédiatement congélation rapide par immersion dans de la glace iso-pentane-sec, avant d'être stockés à -80 ° C.
- Les cerveaux sont cryosectioned (10 um d'épaisseur); coupes sont montées sur des lames de verre Superfrost et maintenue à -20 ° C. Référence à une norme de la souris stéréotaxique atlas (par exemple Paxinos 6) est utilisée pour vérifier la précision anatomique et d'assurer l'inclusion de la région d'intérêt (par exemple pour les neurones dans le noyau paraventriculaire - PVN - recueillir des sections à partir du niveau de la rostrale PVN, bregma -0,75 à -0,85).
- Les sections sont colorées avec du violet de crésyl pour faciliter l'identification des structures cérébrales différentes. Poinçons (0,8 mm) des régions d'intérêt (par exemple PVN) sont obtenus par microdissection loco.
3. Extraction des acides nucléiques à partir de poinçons du cerveau
Un protocole optimisé pour extraire simultanément l'ADN et d'ARN à partir minuscule neuroanatomically défini reg cerveauions pour les analyses d'expression et le bisulfite de gène est décrite 7.
Note: Considérant que l'ARN est moins stable que l'ADN dans la CGT-tampon, nous vous recommandons le traitement d'ARN en premier. L'homogénat utilisé pour la purification d'ADN peuvent être conservés à température ambiante (RT) pendant ce temps.
- Homogénéiser poinçons aide d'une pipette et de tourbillons dans 400 ul de thiocyanate de guanidinium (GTC) du tampon (4,5 M thiocyanate de guanidinium, 2% N-lauroylsarcosine, EDTA 50 mM pH 8,25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M bêta-mercaptoéthanol, 0,2% antimousse A) à température ambiante, en passant plusieurs fois à travers une seringue hypodermique (29G) (figure 2).
- Diviser en parties égales lysat; ARN et d'ADN peut être extrait en même temps ou séparément, en fonction de besoins spécifiques expérimentales.
- Pour la purification d'ARN ajouter du volume 1/10 de NaOAc, 1 AquaPhenol volume (Appligene) (pH 4) et le volume 1/2 de chloroforme: isoamyle (24:1) à lysat. Vortex vigoureusement après chaque étape etincuber sur de la glace pendant 10 min, centrifugeuse (20 min à 10000 g à 4 ° C), ajouter un volume égal d'EtOH à 70% à la phase aequous.
- Transférer le mélange dans une colonne de spin ARN (par exemple Nucleospin II de l'ARN à partir de Macherey-Nagel) et effectuez les étapes sur la colonne DNase-digestion et le lavage (suivre le protocole du fabricant); éluer l'ARN dans 25 ul de H 2 O.
- Pour la purification d'ADN d'un protocole optimisé du sang Qiagen DNeasy et Kit de tissus est utilisé. Equilibrer lysat avec des volumes égaux de tampon AL et EtOH 100%, la charge sur une centrifugeuse colonne Spin (1 min à 10000 g à température ambiante) et jetez-débit par le biais.
- Ajouter 500 pi de tampon AW1 dont 5 pl RNAse (1 mg / ml) à la colonne et incuber 10 min à température ambiante. Spin (1 min à 10000 g, RT) et jetez-débit par le biais.
- Laver la colonne avec 500 pi de tampon AW2, jetez accréditives et au sèche-linge colonne vide (1 min à 15000 g).
- Ajouter préchauffé (70 ° C) et tampon AE colonnes incuber pendant 10 min à 70 ° C. Éluer par centrifugation (1 min, 10.000 g), une nouvelle demande accréditives et répétez l'étape de centrifugation.
Utiliser un spectrophotomètre pour déterminer l'ADN et concentrations d'ARN. Un typique PVN poinçon rendements ~ 600 ng d'ADN et d'ARN ~ 400 ng. Pour analyse d'expression génique par PCR quantitative (qPCR), nous utilisons généralement ~ 100 ng d'ARN dans la réaction de transcription inverse.
4. Conversion au bisulfite
Bisulfite de sodium est utilisé pour convertir les non-méthylés cytosines à uraciles. En revanche, cytosines méthylées sont protégés de la conversion. Par conséquent, toutes les cytosines qui sont détectés dans le séquençage final du bisulfite de PCR-amplicon représentent cytosines méthylées.
Conversion au bisulfite entraîne une dégradation substantielle d'ADN qui peut être un facteur limitant dans l'analyse par PCR. Les conditions réactionnelles optimisées pour maximiser la conversion cytosine, réduire la fragmentation de l'ADN et maintenir l'ADN simple brin, même à des températures plus basses peuvent être obtenus en utilisantKit de Qiagen bisulfite EpiTect. Dans les mains ~ 200 ng de l'ADN purifié à partir micropunches fournir une quantité suffisante de matière de départ pour la réaction de bisulfite.
Pour éviter que les différences dans l'efficacité de la réaction de conversion, la quantité d'ADN modèle doit être maintenue constante entre tous les échantillons traités au cours d'une expérience. En outre, la séquence se lit doit être examinée pour l'efficacité de conversion en examinant le taux de non-convertis non-CpG. Ce taux devrait dépasser 98%. Des valeurs inférieures indiquent conversion au bisulfite incomplète ou inefficace et les séquences sous-jacents devraient être exclus de l'analyse.
5. Bisulfite PCR
- Bisulfite de conception des amorces de séquençage qui sont spécifiques à l'ADN au bisulfite transformé (voir la discussion); méthyle logiciel Primer Express ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ Fr / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 & catid = 602 121) aidera la situation et aider à déterminer optimales températures de recuit dans des expériences pilotes.
- Préparer PCR-Master-Mix (pour une réaction) comme suit:
2,5 pi de tampon 10x PCR
0,5 ul 10 mM de dNTPs
1 pl 10 uM Amorce
1 pl 10 amorce inverse uM
0,125 pi Qiagen Hotstart Taq plus
remplir jusqu'à 23 pi avec H 2 O - Ajouter 2 ul bisulfite traité l'ADN à la réaction.
- Amplifier en utilisant les conditions suivantes:
1 cycle 6 min 95 ° C
45-50 cycles de 1 min à 95 ° C, une température de recuit min à optimale, 1 min à 72 ° C
1 cycle de 5 min 72 ° C
Analyser 7 ul du produit de PCR par électrophorèse sur gel agarose pour vérifier la taille de l'amplicon et purifier en restant réaction de PCR pour la ligature ultérieure à l'aide disponible dans le commerce PCR clean-up kit (par exemple Macherey-Nagel Nucleospin Extrait). En cas supplémentaires indésirables des produits de PCR sont obtenus, purification sur gel est recommandé.
6. Séquençage de bisulfite
Haute résolution des profils de méthylation d'ADN déduites à partir des lectures clone unique peut détecter de petits changements dans la méthylation de l'ADN et d'identifier les régions régulatrices qui sont sensibles au traitement (programmation de l'environnement). Le processus de séquençage au bisulfite comprend trois étapes consécutives de travail. Tout d'abord, les produits PCR obtenus par le bisulfite avant PCR sont ligués dans un vecteur et transformé dans des bactéries. Deuxièmement, une PCR sur colonie de clones individuels est utilisée pour déterminer la taille correcte de l'insert. Troisièmement, les RAP colonie positifs sont nettoyés et soumis à une réaction de séquençage Big-Dye. Après une étape de nettoyage, les produits sont soumis à une électrophorèse sur un séquenceur capillaire.
6.1 La ligature et la transformation
Remarque: Nous utilisons régulièrement le vecteur pGEM-T clkit oning (Promega). Dans notre expérience, l'efficacité de clonage dépend de façon critique sur l'insert à ligaturer. Différents vecteurs doivent être testés dans le cas où le faible nombre de clones recombinants sont à plusieurs reprises obtenu.
- Mettre en place réaction de ligature:
5 pi de tampon 2x ligature
1 pl vecteur pGEM-T
1 pl T4-ligase
3 pl nettoyé produit de PCR - Mélanger la réaction par pipetage et incuber pendant une nuit à 4 ° C.
Remarque: La ligature peut aussi être effectuée pendant 1 h à température ambiante ainsi. Pour augmenter le nombre de clones recombinants, plus de ligature nuit à 4 ° C est préférable.
- Nettoyage des produits de ligature par précipitation à l'éthanol:
- Ajouter 1 ul glycogène, 1 pl 3M NaAc et 25 EtOH ul 100% à la réaction de ligature et précipité pendant 1 min dans de l'azote liquide.
- Centrifugeuse (15,0000 g pendant 30 min à 4 ° C) et éliminer le surnageant.
- Laver avec 300 plEtOH à 70% et centrifuger (15.000 g pendant 20 min à 4 ° C), éliminer le surnageant et culot sec à température ambiante (10 min).
- Resuspendre le culot dans 10 ul de H 2 O.
6.2 Transformation des produits de ligature dans les bactéries électrocompétentes
- Prérefroidir cuvettes d'électroporation (1 mm de largeur) sur la glace et le dégel du aliquote électrocompétentes bactéries DH5a sur la glace.
- Ajouter 45 ul bactéries DH5a à 10 ul nettoyé produit de ligature (voir ci-dessus) et transfert à la cuvette.
- Transformer des bactéries à 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF et ajouter 1 ml de milieu SOB préchauffé directement après la livraison d'impulsion.
- Récupérer les bactéries pendant 1 h à 37 ° C, d'épandage 100 ul de la suspension sur LB ou des plaques d'ampicilline recouvertes avec de l'IPTG / X-Gal.
- Incuber les boîtes de nuit à 37 ° C.
6,3 PCR colonie
Remarque: Colony PCR à partir de clones individuels est effectué afin de s'assurer que les inserts sontde taille prédite. Développement de la couleur en différé à partir de la projection bleu / blanc, des événements de recombinaison indésirables au cours de la ligature, l'incorporation de paires d'amorces oligomères ou tronquées produits de PCR peut par ailleurs conduire à des résultats de séquençage défectueux. Nous utilisons régulièrement T7 et SP6 amorces pour amplifier inserts clonés; Cette approche aboutit à des séquences de vecteurs supplémentaires d'environ 150 pb. Amorce T7 est utilisée dans la réaction de séquençage, dans une étape ultérieure.
- Mettre en place une PCR sur colonie de réaction dans la plaque de 96 puits. Pour utiliser une réaction:
3 pl 2,5 mM MgCl 2
2,5 pi de tampon 10x Taq
1,5 ul 10 mM dNTP
2 pl 2,5 mM T7 amorce
2 pl 2,5 mM SP6 amorce
1 pl Fermentas polymérase Taq
remplir jusqu'à 25 pi avec H 2 O - Distribuer 25 pl / puits de mélange-maître dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
- Choisissez positif (blanc) clone de la plaque avec la pointe de pipette et plonger dans la réaction PCR.
- Amplifier l'aide folconditions vants:
1 cycle 4 min à 95 ° C
10 cycles 30 s à 94 ° C, 30 s à 56 ° C et 30 s à 72 ° C
30 cycles 30 s à 94 ° C, 30 s à 48 ° C et 30 s à 72 ° C
1 cycle 5 min à 72 ° C - Chargez 5 ul de la colonie de PCR sur un gel d'agarose et de déterminer des réactions qui contiennent de la taille d'insertion à droite.
- RAP Colony contenant les amplicons souhaités sont nettoyés en utilisant un kit disponible dans le commerce (Machery Nagel Nucleofast).
6,4 Big-Dye terminateur de réaction et le séquençage
- Préparer le mélange maître pour Big-Dye réaction. Pour utiliser une réaction:
1 pl H 2 O
0,5 pi Big-Dye réactif
1,5 tampon de séquençage ul - Distribuer 3 pl / puits dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, à chaque puits, ajouter 2 pl de la colonie produit nettoyé PCR et exécuter la réaction sur un thermocycleur avec les paramètres suivants: 35 cycles de 10 s à 96 ° C, 5 s à 50 ° C et 4 min à 60 ° C
- La réaction Big-Dye est nettoyé à l'aide d'un kit commercial (Millipore Montage 96 séquençage Clean-Up Kit) et traitées sur un séquenceur capillaire (ABI 3100, par exemple l'ADN).
- Les séquences sont analysées à l'aide de l'analyseur Biq ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) ou l'outil en ligne BISMA ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) pour dériver le profil de méthylation de la région d'ADN étudié (figure 4).
7. Les résultats représentatifs
Pour mieux comprendre l'influence de ELS sur l'expression AVP et l'état de méthylation, les souris ont été traitées selon C57BL/6N au flux de travail décrit ci-dessus. En bref, un groupe de souris a été C57BL/6N subjected à ELS tandis que le groupe témoin a été laissé au repos. Le PVN et le noyau supraoptique (SON) ont été perforées et l'ADN et l'ARN ont été isolés à partir des coups de poing en même temps simples. L'ARN a été reverse transcrit et les niveaux de transcrits avp ont été mesurées par l'analyse qPCR et normalisée à l'expression de gènes de ménage HPRT et GAPDH. L'ADN a été traitée au bisulfite, amplifié avec des amorces spécifiques à l'amplificateur AVP (figure 4a) et les produits de PCR ont été clonés et séquencés. Au moins 20 clones recombinants de chaque souris / PCR ont été analysés afin de déterminer les fréquences de méthylation pour les CpG contenus dans l'amplicon PCR (figure 4b). Comparativement aux témoins, ELS a induit une hypométhylation de significatif à CpG10, CpG12, CpG13 et Cpg14 de l'amplificateur AVP (p <0,05, n = 6-8 animaux) suggérant marquage épigénétique de cette région régulatrice jusqu'au début des expériences vécues. Contrairement à la PVN, la méthylation del'amplificateur AVP a été affectée par ELS dans la spécificité tissulaire FILS illustrant des épigénétique marquage (Figure 4c). L'analyse de la méthylation de l'ADN à l'état CpG10 et l'expression des gènes chez les animaux témoins Avp (n = 6) mis en évidence une corrélation négative pointant vers un rôle de la méthylation de l'ADN dans le peaufinage de l'expression des gènes AVP (Figure 4d).
Micropunches Figure 1. Sont obtenus à partir de cerveaux disséqués de contrôle et de début de la vie des souris stressées. Après l'ADN et l'isolement d'ARN, l'expression des gènes est déterminée par qRT-PCR alors que l'ADN au bisulfite traité est amplifié et les produits purifiés sont clonés dans un vecteur approprié permettant l'identification des clones recombinants par le bleu / blanc de sélection. Insérer la bonne taille sont vérifiées parcolonie PCR avant l'exécution de Big-Dye réaction et de traitement sur un séquenceur capillaire. Modèle de méthylation sont visualisés par des outils logiciels appropriés. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Chronologie de l'ADN / ARN d'extraction au séquençage au bisulfite.
Figure 3. Flux de travail pour l'extraction simultanée de l'ADN et l'ARN. Le poinçon du noyau hypothalamique paraventricularis, un gène exprimant Avp petite région du cerveau, est placé dans 400 pi de tampon GTA, vortex jusqu'à ce que perturbé et encore homogénéisé en passant par une seringue (29G). L'homogénat est ensuite divisé pour la purification de l'ARN et l'ADN. La scission peut être de 1:1 ou de proportions différentes selonsur la question expérimentale particulière. Homogénats doivent être traitées en quelques heures.
Figure 4. Méthylation CpG au niveau du locus de contrôle Avp dans 6 semaines et les animaux ELS. (A) Système de la queue et Avp gènes ocytocine orienté à-queue, et séparées par la région intergénique (IGR). Les exons sont représentés par des ouverts (numérotée) boîtes. La distribution des résidus CpG est indiqué et la taille et la position de l'amplicon respectif PCR contenant CpG 10 à CpG14 est marquée par un trait gras. (B) La méthylation de l'amplificateur AVP dans le PVN chez les animaux témoins et ELS (n = 6-8). (C) méthylation de l'amplificateur AVP dans le Fils dans le contrôle et les animaux ELS (n = 8-10). (D) l'expression des gènes a été corrélée Avpà la méthylation au CpG10 (n = 6). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Discussion
Programmation épigénétique est de plus en plus reconnue comme un mécanisme important qui sous-tend la santé et la maladie. Nous présentons ici une méthode plus perfectionnée pour l'isolement simultané de l'ADN et d'ARN à partir micropunches et les étapes ultérieures d'obtenir des profils de méthylation d'ADN par séquençage au bisulfite. Le flux de travail optimisé permet une analyse pratique de la programmation épigénétique dans le cerveau en réponse à des stimuli environnementaux. En outre, cette approche facilite l'enquête de la relation fonctionnelle entre la méthylation de l'ADN et l'expression des gènes à la fois comme sont analysés à partir du même échantillon. Enfin, le nombre d'animaux nécessaires pour l'expérience peut être considérablement réduit.
Certaines précautions et les directives doivent être suivies lors de l'exécution du flux de travail présenté. Considérant l'extraordinaire complexité et l'hétérogénéité du cerveau et, depuis motif de méthylation et d'expression peut varier d'une manière cellules et des tissus spécifiques, il est de la plus hauteimportance que micropunching est effectuée de manière standardisée. Comme un cas au point, la programmation épigénétique de AVP est détecté dans le paravaventriuclar, mais pas dans le noyau supraoptique (figure 4b-d), deux Avp exprimer régions de l'hypothalamus 4. À cet égard, la disponibilité de l'ADN et l'ARN du poinçon même tissu est avantageux que l'expression d'ARN de gènes marqueurs tissulaires certaines spécifiques peuvent être utilisés dans certains cas, pour certifier que la zone voulue a été frappé. Bien que micropunching peut réduire l'hétérogénéité cellulaire, il ne faut pas oublier que cette approche ne conduise pas à l'isolement de types de cellules simples ou des populations. Étapes de purification supplémentaires pourraient être envisagées pour traiter ce sujet.
Pour le bisulfite de séquençage de conception d'amorce optimale pour l'amplification par PCR de bisulfite de traitement suivant est essentiel. Les produits de PCR de plus de 400 pb de longueur peut être problématique en raison de la dégradation de l'ADN par le btraitement isulfite. Il convient également de noter que la PCR nichée peut donner des résultats biaisés si seulement quelques modèles intacts contribuer au processus d'amplification. Paires d'amorces qui sont spécifiques pour l'amplicon modification doit être conçue; leurs séquences ne doivent pas contenir des dinucléotides CpG, afin d'éviter la méthylation polarisée d'amplification. En outre, des amorces doit contenir non-CpG cytosines pour éviter l'amplification de l'ADN non modifié ou incomplètement convertie. L'amplification de certains modèles peuvent bénéficier de la conduite de démarrage à chaud PCR. Dans tous les cas, la pertinence de paires d'amorces doivent être vérifiées dans des expériences pilotes de manière à empêcher la détérioration de la valeur des spécimens expérimentaux.
Séquençage bisulfite représente une méthode standard pour l'analyse de méthylation spécifique de site tel qu'il est capable de détecter de manière fiable et précise de la méthylation de CpG uniques résidus de manière spécifique de l'allèle 8. Le séquençage direct du produit de PCR n'est pas conseillé que la méthylation mixte oFA CpG résidus apparaît comme un pic C / double T dans le électrophérogramme, ce qui peut empêcher la quantification de la méthylation du site concerné. Pour cette raison, une étape de clonage intermédiaire est effectuée et plusieurs clones sont séquencés (~ 20-30) pour déterminer l'étendue de la méthylation. Pyroséquençage représente une méthode alternative pour quantifier méthylation de l'ADN. Il utilise également la conversion au bisulfite et le bisulfite de PCR mais au lieu de clonage et le séquençage de l'amplicon est soumis à une réaction directe pyroséquençage où le statut de méthylation d'un résidu CpG est lu comme un C / T polymorphisme de nucléotide unique qui peut être facilement quantifiés. Les deux méthodes de détecter des niveaux similaires de méthylation 9, mais depuis le clonage étape peut être omise pyroséquençage prend plus de temps efficace. Toutefois, selon le modèle de seulement 40 à 100 nucléotides peuvent être séquencés à la fois de sorte que plusieurs séries de pyroséquençage avec amorce de séquençage différentes sont nécessaires. Il s'agit d'une limitation critique, étant donné thamontants plus élevés de l'ADN t (environ 1 pg par réaction) sont nécessaires, ce qui prévisible dépasse les montants disponibles à partir de minuscules coups de tissus cérébraux. Ainsi la première analyse des régions dans la gamme de plusieurs kilobases par pyroséquençage semble moins adapté que la lecture seul clone. Néanmoins, à la suite de l'identification d'une petite région de pyroséquençage intérêt doit être pris en considération.
Collectivement, le protocole décrit ci-dessus fournit une approche précise, efficace et rationalisé pour l'analyse rapide et rentable de micropunches cerveau de modifications épigénétiques. Spécimens multiples peuvent être traitées en un seul passage et les méthodes sont adaptées lors de l'exécution des échantillons provenant de taille intermédiaire expériences.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par l'Institut Max Planck de psychiatrie et de l'Union européenne Marie Curie Réseau de formation initiale (contrat NINA 238 665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 | |
| Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |
References
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