Summary
一个精简的工作流程，研究DNA甲基化和基因表达变化后早期生活压力。从新生鼠和离散脑组织隔离母体分离开始，我们代表的协议，同时为随后的亚硫酸氢钠测序和RT-PCR分析DNA和RNA分离脑组织拳。
Abstract
暴露于饮食，药物和早期生活逆境中，在生活的1,2敏感窗口可以导致持久的基因表达的变化，有助于生理和行为表型显示。这样的环境规划是可能增加易感性代谢，心血管疾病和精神疾病3,4。
DNA甲基化和组蛋白修饰的基因与环境对话的调解被认为是在关键工序，也出现下衬的环境规划5。在哺乳动物中，DNA甲基化通常包括甲基胞嘧啶5位内的CpG二核苷酸的背景下，除了共价。
CpG甲基化发生在一个高度的组织和细胞特异性的方式使其成为一个挑战，研究，脑细胞的异质性高，组织数量有限的离散小区域。此外，Because基因表达和甲基化紧密相连的活动，增加值，可以得到比较这两个参数在同一样品。
在这里，一步一步的协议，为大脑中的后生编程调查（ 图1）提出使用“母婴分离”说明目的的早期生活逆境的典范。协议描述的DNA和RNA可以同时分离出的大脑差异中年鼠标micropunches的准备，从而在同一样品中的DNA甲基化和基因表达分析。
Protocol
1。由早期的生活逆境的编程
母婴分离（MS）进行早期生活压力（ELS）的诱导由定时孕妇C57BL/6N小鼠（产后一天出生当天（P0））提供的幼仔。
- 个别窝放置在清洁的笼子里每天3小时（加热垫）从P1-10。
- 控制（非ELS）的幼崽留在产妇巢整个原状。
- （P21蛋白），断奶后的时间，他们安置在性别相匹配的组标准的实验室动物的住房条件下（每笼3-5只）保持与他们的母亲，直到幼崽。
2。脑组织中分离和解剖
- 小鼠被杀害在颈椎脱位注意所需的年龄，因为该协议涉及的应力范式，没有麻醉前给予颈椎错位，以避免干扰正常的应激激素的生理调节。头骨被打开，大脑小心取下，并立即冻结单元，沉浸在异戊烷干冰，之前被储存在-80°C
- 的大脑cryosectioned（厚度为10微米），路段安装对Superfrost玻片，并保持在-20°C参考标准鼠标立体地图集（如Paxinos 6）是用来验证解剖的精度，以确保该地区的利益（如在室旁核神经元-下丘脑室旁核-延髓PVN内，囟门的水平开始收集部分列入-0.75至-0.85）。
- 甲酚紫染色部分，以便识别不同的大脑结构。拳（0.8毫米）的利益的地区（如PVN内），得到了局部显微。
3。来自脑拳核酸提取
一个优化的协议，同时提取DNA和RNA的微小的神经解剖学定义的大脑章亚硫酸氢钠和基因表达分析的离子描述7。
注：考虑到RNA是不到GTC的缓冲区中的DNA的稳定，我们建议先处理的RNA。用于DNA纯化匀浆可以在这段时间里保持在室温（RT）。
- 在使用400μL的异硫氰酸胍（GTC的）缓冲区（异硫氰酸胍4.5米，2％的N-lauroylsarcosine，50 mM EDTA的pH值8.25毫米的Tris-HCl pH值7.5，0.1 M的β-巯基乙醇，0.2％，消泡剂吸管和vortexer的均质拳一）在室温下，多次通过皮下注射针筒（29G）（ 图2）。
- 将等份分割裂解物;可同时提取RNA和DNA或单独，取决于在特定的实验需要。
- RNA纯化，添加量的1/10，醋酸钠，1的体积AquaPhenol（Appligene）（pH值4）和1/2体积的氯仿：异戊酯（24:1）裂解物。每一步后大力涡和在冰上孵育10分钟，离心（20分钟在10,000 g 4℃）;添加70％乙醇的等量aequous阶段。
- 混合物转移到RNA的自旋列（例如Nucleospin RNA二）从马谢雷-内格尔和执行列DNase的消化和洗涤步骤（遵循制造商的协议）;洗脱RNA在25μLH 2 O
- 对于DNA纯化Qiagen公司的的DNeasy血液和组织工具的优化协议。平衡裂解物与等量缓冲AL和100％的乙醇，自旋式离心机的负载（10,000 RTĞ1分钟），并丢弃流过。
- 加入500μL，其中包括5μLRNA酶（1毫克/毫升）AW1缓冲列，并在室温下孵育10分钟。自旋（1分，在10,000 g，RT），并丢弃流过。
- 用500μl缓冲AW2洗柱，流过旋干空列（1分钟）15000克丢弃。
- 加入预热（70℃）缓冲AE和10分钟的孵育列在70°C。离心洗脱（1分钟万克），重新申请流过重复离心步骤。
使用分光光度计测定DNA和RNA的浓度。一个典型的PVN内冲产量〜600毫微克DNA和〜400毫微克的RNA。定量PCR（qPCR）的基因表达分析，我们通常使用〜100毫微克的RNA逆转录反应。
4。重亚硫酸盐转化
亚硫酸氢钠是用来转换uracils非甲基化的胞嘧啶。相比之下，甲基化的胞嘧啶转换保护。因此，在最后的亚硫酸氢钠PCR的扩增测序检测到的所有胞嘧啶代表甲基化的胞嘧啶。
重亚硫酸盐转化导致大量的DNA降解，这可以是一个限制因素，在PCR分析。优化的反应条件下，最大限度地提高胞嘧啶转换，减少DNA片段，并保持单链DNA，即使在较低温度下可以实现使用EpiTect硫酸氢钠QIAGEN的试剂盒。在我们的手中〜200纳克从micropunches纯化的DNA提供足够量的亚硫酸氢钠反应起始材料。
为了防止在转换反应效率的差异，模板DNA的量应保持恒定在实验过程中处理所有样品。此外，序列读审议通过考察非转换非的CPGs率应为转换效率。这个比率应该超过98％。较低的值显示不完整或低效的重亚硫酸盐转化和底层的序列应该从分析中排除。
5。亚硫酸氢钠聚合酶链反应
- 设计亚硫酸氢钠测序引物是特定的亚硫酸氢盐转化的DNA（见讨论）;甲基Primer Express软件（ https://products.appliedbiosystems.com/ab/ EN /美国/ adirect / AB？CMD = catNavigate2及CATID = 602121），将有助于这一点，中试实验，以确定最佳退火温度。
- PCR主混合（一反应）准备如下：
2.5μL10x PCR缓冲液
0.5μL10 mM的dNTPs浓度
1μL10μM的正向引物
1μL10μM的反向引物
0.125μLQiagen公司的热启动Taq酶加
与H 2 O补至23μL - 加入2μL亚硫酸氢钠处理DNA反应。
- 放大使用下列条件：
1个周期6分钟95℃
45-50周期1分钟95℃，最佳退火温度1分钟，1分钟72°C间
1个周期5分钟72℃
7μlPCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析，以验证扩增的大小和净化随后结扎剩余使用市售的PCR清洁试剂盒（PCR反应如马谢雷娜凝胶Nucleospin提取）。的情况下获得附加意外的PCR产物，凝胶净化建议。
6。亚硫酸氢钠测序
高分辨率的DNA甲基化概况，从单一的克隆读数推导出可以检测DNA甲基化的微小变化，并确定监管区域，是顺应治疗（环境规划）。亚硫酸氢钠测序过程包括三个连续的工作步骤。首先，由之前的亚硫酸氢钠PCR获得的PCR产物连接到一个向量和细菌转化。其次，从单一的克隆PCR殖民地，以确定正确的插入大小。第三，积极菌落PCR的清理和遭受大染料的测序反应。经过清理的一步，产品电泳毛细管序。
6.1结扎和转型
注：我们经常使用的pGEM-T载体CLoning试剂盒（Promega公司）。在我们的经验，克隆效率的关键取决于上结扎插入。应测试不同的载体，重组克隆的低的情况下，多次获得。
- 建立连接反应：
5μL2X结扎缓冲区
1μLpGEM-T载体
1μl的T4连接酶
3μL清理PCR产物 - 通过吸取和孵育过夜混合反应在4°C。
注：结扎术可能也可以在室温下进行，以及为1小时。到晚上结扎重组克隆数增加，在4°C是首选。
- 清理乙醇沉淀结扎产品：
- 加入1μL糖原，1μL3M NaAc和25μL100％的乙醇，在液氮中1分钟的连接反应和沉淀。
- 离心机（15000克30分钟，在4°C间），弃上清。
- 用300μL清洗70％的乙醇和离心机（15,000克20分钟，在4°C间），弃上清和沉淀干燥，在室温下（10分钟）。
- 重悬浮颗粒，在10μL的H 2 O
6.2结扎产品electrocompetent细菌转化
- 预冷电试管（1毫米宽）冰和冰解冻等份electrocompetentDH5α，细菌。
- 加入45μLDH5α，细菌10μL清理结扎产品（见上文），并转移到试管。
- 改造1.5千伏，200Ω，15μF的细菌，并添加1毫升预热后直接脉冲传递哽咽介质。
- 在37°C，1小时恢复细菌传播LB /氨苄青霉素与经IPTG / X-Gal的涂层板100μL悬浮。
- 孵育板一夜之间在37°C。
6.3菌落PCR
注：殖民地PCR技术从单一的克隆进行，以确保插入规模的预测。延迟的颜色从蓝/白筛选，结扎，低聚引物对纳入或截断的PCR产物中的意外重组事件的发展，否则可能导致故障的测序结果。我们经常使用的T7和SP6引物扩增克隆插入额外约150 bp的载体序列，这种方法的结果。的T7引物用于测序反应在后面的步骤。
- 建立了殖民地，在96孔板PCR反应。对于一个反应使用：
3微升2.5毫米MgCl 2的
2.5μL10倍的Taq缓冲
1.5μL10毫米的dNTP
2μL2.5毫米的T7引物
2μL2.5毫米SP6的底漆
Fermentas公司的Taq聚合酶1μL
填补与H 2 O 25μL - 免除/主组合的96孔板每孔25μL。
- 挑板枪头和浸正（白）克隆到PCR反应。
- 扩大使用FOL必须符合以下条件：
1个周期4分钟95°C间
℃，30日在第56号第10次30秒94°C和30秒72°C间
℃，30日在第48号第30次30秒94°C和30秒72°C间
1个周期5分钟，72°C间 - 装载5μL菌落PCR和琼脂糖凝胶确定包含正确的插入大小的反应。
- 含有所需扩增的殖民地PCR的清理使用一个市售套件（Machery内格尔Nucleofast）的。
6.4大染料终止反应和测序
- 准备大染料反应法师组合。对于一个反应使用：
1μLH 2 O
0.5μL大染料试剂
1.5μL测序缓冲 - 免除微升/ 3以及每一个96孔板，每以及加入2μl和清理菌落PCR产物，用下列参数运行一个热循环反应： 10秒35的周期在96℃，5秒，在50℃，4分钟在60°C
- 大染料的反应是使用商业试剂盒（Millipore公司蒙太奇96测序清洁套件）清理和处理上的毛细管测序仪（如ABI的3100的DNA）。
- 序列分析，BIQ分析器（ http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ）的在线工具BISMA（ http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ）得出的甲基化模式的研究DNA区域（ 图4）。
7。代表结果
获得洞察ELS的AVP的表达和甲基化状态的影响，C57BL/6N小鼠，根据上述工作流程处理。简言之，一组C57BL/6N小鼠为Subjected给ELS，而对照组离开不受干扰。室旁核和视上核（SON），拳打脚踢同时分离DNA和RNA的单拳。 RNA的反转录和，AVP成绩单qPCR分析和归HPRT和GAPDH看家基因表达水平。 DNA是亚硫酸氢钠处理，与AVP增强（ 图4a）和PCR产物的特异性引物扩增，克隆和测序。至少有20个从每个鼠标/ PCR克隆进行分析，以确定甲基化PCR扩增（ 图4b）中的CPGs频率。与对照组相比，ELS的诱导CpG10，CpG12，CpG13 AVP增强Cpg14（P <0.05，N = 6-8动物）1显着的甲基化，暗示后生本监管区域标记通过早期的生活经验。相比之下PVN内，甲基化AVP增强在儿子说明表观遗传标记（ 图4c）的组织特异性的ELS的影响。 DNA甲基化状态分析CpG10和AVP控制动物的基因表达（N = 6）负相关指向的DNA甲基化在AVP的基因表达（ 图4d）微调的作用可见一斑。
图1。的 Micropunches得到控制和生命早期强调小鼠大脑解剖。继DNA和RNA的分离，是由QRT-PCR基因表达，而亚硫酸氢钠处理的DNA扩增和克隆纯化产品是在一个合适的载体，允许重组克隆鉴定蓝色/白色选择。正确插入尺寸验证菌落PCR前开展大染料的反应和处理毛细管序。甲基化模式是通过适当的软件工具，可视化。 点击这里查看大图 。
图2。时间轴从DNA / RNA提取硫酸氢钠测序。
图3。同时提取DNA和RNA的工作流程。下丘脑室旁核，一个微小的AVP基因表达的大脑区域，打了一拳，被放置在400μL多伦多缓冲区，振荡，直到破坏和进一步匀浆通过注射器（29G）。匀浆，然后分裂RNA和DNA的纯化。拆分可以是1:1或不同比例在特定的实验问题。的匀浆应在几个小时内处理。
图4。在AVP轨迹在6周龄控制和ELS的动物CpG甲基化。 （一）AVP和催产素基因导向尾对尾的计划和区域间（IGR）分隔。外显子描绘开放（编号）框。的CpG残留的分布情况和各自的PCR扩增含CpG 10日至CpG14的大小和位置是一个大胆的行标记。 （二）在控制和ELS的动物PVN内AVP增强甲基化组（n = 6-8）。 （三）在控制和ELS动物的儿子（N = 8-10）甲基化的AVP增强。 （四）AVP基因的表达呈正相关与甲基在CpG10（N = 6）。 点击这里查看大图 。
Discussion
后生编程日益被视为潜在的健康和疾病的一个重要机制。在这里，我们提出了一个同时隔离，从micropunches和后续步骤获得通过亚硫酸氢盐测序的DNA甲基化谱的DNA和RNA的精制方法。优化工作流程，允许在应对环境刺激大脑中的后生编程方便分析。此外，这种做法有利于功能的DNA甲基化和基因表达之间的关系，因为二者都是从同一样品分析的调查。最后，实验所需的动物数量可显着减少。
应遵循一定的预防措施和指引，而提出的工作流程执行。考虑非凡的复杂性和异质性脑和甲基化和表达模式，因为在细胞和组织的具体方式可能会有所不同，它是最重要的是micropunching在一个标准化的方式进行。作为一个点的情况下，AVP后生编程在paravaventriuclar检测，但没有在视上核（ 图4B-D），两个地区的下丘脑4 AVP表达。在这方面，来自同一组织冲床DNA和RNA的可用性是有利的RNA可以在某些情况下使用证明，正确的区域被打了个一定的组织特异性标记基因的表达。 ，虽然micropunching可以减少细胞的异质性，它必须记住，这种方法不会导致单细胞类型或种群的隔离。可能被视为额外的纯化步骤，以解决这一主题。
对于亚硫酸氢盐测序的PCR扩增以下的亚硫酸氢钠治疗的最佳引物设计是必不可少的。长度超过400 bp的PCR产物可以由B的问题，由于DNA降解isulfite治疗。还应指出，巢式PCR可以给偏见的结果，如果只有少数完整的模板有助于放大过程。设计应当是具体的修改扩增引物对，它们的DNA序列不应该含有CpG二核苷酸，以避免偏向甲基化扩增。另外，引物应该包含非CpG基胞嘧啶，以防止未修改或不完全转换的DNA扩增。进行热启动PCR扩增一些模板可能会受益。在任何情况下，对引物的适用性，应在试点实验验证，有价值的实验标本，以防止腐败。
亚硫酸氢钠测序代表一个站点特定的甲基化分析的标准方法，因为它是能够可靠和准确的检测甲基化的CpG单残留在等位基因特异的方式8。 PCR产物直接测序，不建议作为混合甲基Ø发CPG渣会出现一个C /双峰在电泳，它可以防止定量甲基化有关的网站。出于这个原因，中间克隆步骤进行，一些克隆测序（20-30），以确定甲基化的程度。焦磷酸测序的一种替代方法，以量化DNA甲基化。它还采用重亚硫酸盐转化和亚硫酸氢钠PCR而是克隆和测序的扩增受到直接的焦磷酸测序反应，其中一个CpG残留的甲基化状态是作为一个C / T单核苷酸多态性，可以很容易量化阅读。这两种方法检测9甲基化水平相似，但自克隆步可以省略焦磷酸测序技术是更多的时间效率。然而，根据模板只有40-100个核苷酸测序一次，这样几轮不同的测序引物与焦磷酸测序是必要的。这是一个关键的限制，给予THADNA T更高的金额（约1微克每反应）是必需的，可预见的超过金额可从微小的脑组织拳。因此，在地区范围内的几个碱基的初始扫描，由焦磷酸测序似乎不太适合作为单一的克隆读数。然而，对小区域的利益焦磷酸测序鉴定后应予以考虑。
总的来说，上述协议提供了一个后生变化的脑micropunches快速和成本效益分析，准确，高效和简化的方法。多个标本，可以在一个单一的运行和处理的方法是合适的运行时从中间大小的实验样本。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由马克斯·普朗克研究所精神病学和欧盟的玛丽·居里的初始培训网络（如心合同238665）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 | |
| Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |
References
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