Summary
Рационализировать рабочий процесс изучения метилирования ДНК и изменениями экспрессии генов на ранних жизненных стрессов показано. Начиная с материнской отделение новорожденных мышей и изоляции дискретных тканях головного мозга, которые мы представляем протокол одновременно изолировать ДНК и РНК от ударов мозговой ткани для последующего секвенирования бисульфит и ПЦР-анализа.
Abstract
Воздействие диеты, лекарства и рано невзгоды жизни в чувствительных окна жизни 1,2 может привести к долгосрочным изменениям в экспрессии генов, которые способствуют проявление физиологических и поведенческих фенотипов. Такие экологические программы, скорее всего, увеличит чувствительность к метаболическим, сердечно-сосудистые и психические заболевания 3,4.
Метилирования ДНК и гистонов модификации считаются ключевыми процессами в посредничестве генов и окружающей среды диалога и появляются также легли в основу экологической программы 5. У млекопитающих, метилирование ДНК обычно содержит ковалентные добавление метильной группы в положении 5 цитозина в рамках ди-CpG.
CpG метилирования происходит в крайне образом ткани и клетки, что делает его конкретных задач для изучения дискретных, небольшой области мозга, где сотовая неоднородность ткани высокой и количество ограничены. Кроме того, бecause экспрессии генов и метилирования тесно связаны между собой событий, увеличилось значение можно получить, сравнивая оба параметра в одной пробе.
Здесь шаг за шагом протокола (рис. 1) для изучения эпигенетических программирования в мозге представлены с использованием парадигмы "материнской разделение" раннего невзгоды жизни в иллюстративных целях. В протоколе описывается подготовка micropunches от дифференциально возраста мыши мозга, из которых ДНК и РНК, могут быть одновременно изолированы, таким образом позволяя метилирования ДНК и анализ экспрессии генов в одной пробе.
Protocol
1. Программирование на ранних Беда жизнь
Материнская разделения (MS) выполняется, чтобы вызвать в ранний период жизни стресс (ELS) у щенков выступил временном беременных C57BL/6N мышей (постнатальный день 0 (P0) на день рождения).
- Индивидуальные помета помещают в чистые клетки (с грелку) в течение 3 ч ежедневно с Р1-10.
- Управления (не ELS) щенки остаются нетронутыми в материнском гнезде во всем.
- Щенки находятся вместе с матерями до отъема (P21), после чего они помещаются в пол подобранные группы (3-5 мышей в клетке) при стандартных условиях животное лаборатории жилья.
2. Выделение и Препарирование мозга ткани
- Мыши погибают в возрасте от желаемого шейки дислокации. Примечание: так как этот протокол включает в себя стресс парадигмы, без анестезии дается до шейки дислокацию, чтобы не мешать нормальной физиологической регуляции гормонов стресса. Черепа открыты иМозг осторожно удаляют и сразу же оснастки заморожены погружение в изо-пентан-сухой лед, прежде чем хранили при -80 ° C.
- Мозг cryosectioned (толщина 10 мкм); разделы монтируются на салазках SuperFrost стекла и поддерживается на уровне -20 ° С. Ссылка на стандартную мышь стереотаксической атлас (например, Paxinos 6) используется для проверки анатомической точностью и обеспечить включение области интересов (например, нейроны в паравентрикулярное ядро - НДС - собрать разделов, начиная с уровня ростральной НДС, брегмы -0,75 до -0,85).
- Разделы окрашивали крезиловый фиолетовый для облегчения идентификации различных структур головного мозга. Удары (0,8 мм) регионах, представляющих интерес (например, НДС) получены в микродиссекции локомотива.
3. Нуклеиновых кислот из мозга Пуансоны
Оптимизированный протокол для одновременного извлечения ДНК и РНК с крошечными neuroanatomically определенные мозга регионов для анализа бисульфит и экспрессии генов описаны 7.
Примечание: Учитывая, что РНК менее стабильна, чем ДНК в GTC-буфера, мы рекомендуем обработку РНК, в первую очередь. Гомогената для очистки ДНК можно хранить при комнатной температуре (RT) в это время.
- Однородный удары с помощью пипетки и vortexer в 400 мкл гуанидиний тиоцианата (GTC) буфера (4,5 М гуанидин тиоцианат, 2% N-lauroylsarcosine, 50 мМ EDTA рН 8,25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 М бета-меркаптоэтанола, 0,2% пеногасителя А) при комнатной температуре, проходя несколько раз через шприц (29G) (рис. 2).
- Сплит лизата на равные части, как РНК и ДНК могут быть получены одновременно или по отдельности, в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей.
- Для очистки РНК добавить 1/10 объема NaOAc, 1 объем AquaPhenol (Appligene) (рН 4) и 1/2 объема хлороформ: изоамиловый (24:1) в лизата. Vortex энергично после каждого шага иинкубировать на льду в течение 10 мин, центрифуги (20 мин при 10000 г на 4 ° С), добавить равное количество 70% этанола в aequous фазы.
- Передача смесь РНК колонке спином (например, Nucleospin РНК II с Macherey-Nagel) и выполнять в колонку ДНКазы, пищеварение и промывки (следовать протоколу производителя); элюируются РНК в 25 мкл H 2 O.
- Для очистки ДНК оптимизированный протокол крови Qiagen DNeasy и тканей Kit используется. Равновесие лизата с равными объемами буфера AL и 100% этанола, нагрузка на центрифуге Колонка Spin (1 мин при 10000 г при комнатной температуре) и отказаться от проточных.
- Добавить 500 мкл буфера AW1 в том числе 5 мкл РНКазы (1 мг / мл) в колонну и инкубировать 10 мин при комнатной температуре. Spin (1 мин при 10000 г, РТ) и отказаться от проточных.
- Промойте колонку с 500 мкл буфера AW2, отказаться от проточных и спин-сухой пустой столбец (1 мин при 15000 г).
- Добавить нагретого (70 ° C) буфера AE и инкубировать столбцов в течение 10 мин при 70 ° C. Элюции с помощью центрифугирования (1 мин, 10000 г), повторно применять проточные и повторите шаг центрифугирования.
Используйте спектрофотометр для определения ДНК и РНК концентрации. Типичный НДС удар дает ~ 600 нг ДНК и ~ 400 нг РНК. Для экспрессии генов анализ ПЦР (КПЦР), мы обычно используем ~ 100 нг РНК в обратной реакции транскрипции.
4. Бисульфит преобразования
Бисульфита натрия используется для преобразования неметилированных цитозина в урацила. В отличие от метилированных цитозина защищены от преобразования. Таким образом, все цитозина, которые были обнаружены в конечном секвенирования бисульфит ПЦР-ампликонов представляют метилированных цитозина.
Бисульфит преобразования приводит к существенному деградации ДНК, которая может быть ограничивающим фактором в ПЦР-анализа. Оптимизированные условия реакции, которые максимизируют цитозин преобразования, снизить фрагментацию ДНК и поддерживать одноцепочечной ДНК даже при низких температурах может быть достигнуто с помощьюEpiTect бисульфит Qiagen в комплект. В наших руках ~ 200 нг ДНК очищали от micropunches обеспечивать достаточное количество исходного материала для бисульфит реакции.
Чтобы избежать различий в эффективности преобразования реакции, количество матричной ДНК должна быть постоянной среди всех образцов, обработанных во время эксперимента. Кроме того, последовательность чтения должны быть тщательно проанализированы на эффективность преобразования путем изучения скорости неконвертированных без CpGs. Эта ставка должна превышать 98%. Более низкие значения указывают на неполной или неэффективной бисульфит преобразования и основной последовательности должны быть исключены из анализа.
5. Бисульфит ПЦР
- Дизайн бисульфит последовательности праймеров, которые являются специфическими для бисульфит превращается ДНК (см. обсуждение); метил Primer Express, программное обеспечение ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ EN / США / adirect / AB? Cmd = catNavigate2 и CATID = 602121) поможет это и помогает определить оптимальные температуры отжига в пилотных экспериментах.
- Подготовка ПЦР-Мастер-Mix (для одной реакции) следующим образом:
2,5 мкл 10x ПЦР буфер
0,5 мкл 10 мМ дНТФ
1 мкл 10 мкМ прямого праймера
1 мкл 10 мкМ обратный праймер
0,125 мкл Taq Qiagen HotStart Plus
заполнить до 23 мкл H 2 O - Добавить 2 мкл бисульфит обработанных ДНК реакции.
- Усиление с помощью следующих условиях:
1 цикл 6 мин 95 ° C
45-50 циклов в 1 мин 95 ° С, 1 мин при оптимальной температуре отжига, 1 мин 72 ° C
1 цикл 5 мин 72 ° C
Анализ 7 мкл продукта ПЦР электрофорезом в агарозном геле для проверки размеров ампликона и очистить оставшиеся реакции ПЦР для последующей перевязкой использованием коммерчески доступных ПЦР очистке комплект (например, Macherey-NaГель Nucleospin Извлечение). В случае дополнительных нежелательных продуктов ПЦР получен, гель очистки рекомендуется.
6. Бисульфит Sequencing
Высокое разрешение метилирования ДНК профилей выводится из одного чтения клон может обнаружить небольшие изменения метилирования ДНК и выявление регуляторных областях, которые реагируют на лечение (экологических программ). В процессе секвенирования бисульфит состоит из трех последовательных этапов работы. Во-первых, ПЦР продуктов, полученных по предварительному бисульфит ПЦР лигируют в вектор и превращаются в бактерии. Во-вторых, колония ПЦР из одного клона используется для определения правильного размера вставки. В-третьих, положительный ПЦР колонии очищают и подвергают Биг-краска последовательность реакций. После очистки шаг, продукты электрофорезу на капиллярной секвенсор.
6,1 лигирования и трансформации
Примечание: Мы обычно используем pGEM-T вектор млoning комплект (Promega). По нашему опыту, эффективность клонирования в решающей степени зависит вставки должны быть перевязаны. Различные векторы должны быть проверены в случае небольшого числа рекомбинантных клонов неоднократно получены.
- Настройка реакции лигирования:
5 мкл 2х буфера лигирования
1 мкл pGEM-T векторного
1 мкл Т4-лигазы
3 мкл очищенных продуктов ПЦР - Смешайте реакции с помощью пипетки и инкубировать в течение ночи при 4 ° C.
Примечание: Перевязка может быть проведена в течение 1 часа при комнатной температуре, а также. Для увеличения количества рекомбинантных клонов, за одну ночь перевязки при 4 ° С является предпочтительным.
- Очистка от перевязки продуктов осаждения этанолом:
- Добавить 1 мкл гликогена, 1 мкл 3М NaAc и 25 мкл 100% этанола в реакции лигирования и осадка в течение 1 мин в жидком азоте.
- Центрифуга (15,0000 г в течение 30 мин при 4 ° С) и отказаться от супернатант.
- Промыть 300 мкл70% этанола и центрифуги (15,000 г в течение 20 мин при 4 ° С), удалите супернатант и сухие гранулы при комнатной температуре (10 мин).
- Ресуспендируйте гранул в 10 мкл H 2 O.
6,2 трансформации перевязки продуктов в electrocompetent бактерии
- Предварительно охлаждать электропорации кюветы (1 мм), на льду и оттаивания аликвоты electrocompetent DH5α бактерий на льду.
- Добавьте 45 мкл DH5α бактерий до 10 мкл очистке перевязки продуктов (см. выше) и трансфер в кювет.
- Преобразование бактерий на 1,5 кВ, 200 Ω, 15 мкФ и добавляют 1 мл предварительно нагретого среду SOB непосредственно после импульса доставки.
- Восстановление бактерий в течение 1 ч при 37 ° C, распространяются по 100 мкл суспензии на LB / ампициллин плиты с покрытием из IPTG / X-Гал.
- Инкубируйте пластины ночи при 37 ° C.
6,3 колонии PCR
Примечание: Колония ПЦР из одного клона проводится с целью обеспечения того, чтобы вставкипрогнозируемого размера. Задержка развития цвет синий / белый скрининга, нежелательные события рекомбинации во время перевязки, включение олигомерных пар праймеров или усеченной продуктов ПЦР в противном случае могут привести к порче результатов секвенирования. Мы регулярно использовать Т7 и SP6 праймерами для амплификации клонировали вставками, этот подход приводит к дополнительному последовательности вектор около 150 базисных пунктов. T7 грунтовка применяется в последовательности реакций на более позднем этапе.
- Настройка колонии реакции ПЦР в 96-луночного планшета. С одной реакции использовать:
3 мкл 2,5 мМ MgCl 2
2,5 мкл 10x буфер Taq
1,5 мкл 10 мМ дНТФ
2 мкл 2,5 мМ T7 праймером
2 мкл 2,5 мМ SP6 грунтовка
1 мкл Taq полимераза Fermentas
заполнить до 25 мкл H 2 O - Внесите 25 мкл / лунку мастер смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.
- Выберите положительный (белая) от клонов пластины с пипетки и окунуться в реакции ПЦР.
- Усиление использованием следуюследующим условиям:
1 цикл 4 мин при 95 ° C
10 циклов 30 с при 94 ° С, 30 с при 56 ° C и 30 с при 72 ° C
30 циклов 30 с при 94 ° С, 30 с при 48 ° С и 30 с при 72 ° C
1 цикл 5 мин при 72 ° C - Загрузка 5 мкл колонии ПЦР на геле агарозы и определить реакции, которые содержат нужный размер вставки.
- Колония ПЦР, содержащий нужный ампликонов очищаются с использованием коммерчески доступного набора (Machery Nagel Nucleofast).
Большой 6,4-краска терминатор реакции и секвенирования
- Подготовка магистра смесь для Big-краска реакции. С одной реакции использовать:
1 мкл H 2 O
Большой 0,5 мкл краски реагент
1,5 мкл буфера Sequencing - Внесите 3 мкл / лунку в каждую лунку 96-луночного планшета, в каждую лунку добавляют 2 мкл очищенных продуктов ПЦР колонии и запустить реакцию на Термоциклер со следующими параметрами: 35 циклов 10 с при 96 ° C, 5 с при 50 ° С и 4 мин при 60 ° C
- Биг-краска реакции очищают с использованием коммерческого набора (Millipore Montage 96 Последовательность Clean-Up Kit) и обрабатываться на капиллярной секвенсор (например, ABI 3100 ДНК).
- Последовательности, анализируются с помощью BIQ Analyzer ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) или онлайн-инструмент BISMA ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) для получения метилирования исследуемых ДНК области (рис. 4).
7. Представитель Результаты
Чтобы лучше понять влияние ELS на Avp выражения и статуса метилирования, C57BL/6N мышей были обработаны в соответствии с рабочим процессом, описанные выше. Короче говоря, группа мышей была с C57BL/6Nubjected в ELS в то время как в контрольной группе осталась нетронутой. НДС и супраоптического ядра (SON) были кулаками и ДНК и РНК были выделены одновременно в одном ударов. РНК обратной транскрипции и уровни транскриптов Avp измерялись КПЦР анализа и нормированная на выражение HPRT и гены GAPDH хозяйства. ДНК бисульфит лечение, усиливается с праймеров, специфичных для Avp усилитель (рис. 4а) и ПЦР-продукты были клонированы и последовательность. По меньшей мере 20 рекомбинантных клонов из каждой мыши / ПЦР были проанализированы для определения частоты метилирования CpGs, содержащихся в ПЦР-ампликонов (рис. 4б). По сравнению с контрольной группой, ELS вызвало значительное понижение уровня метилирования в CpG10, CpG12, CpG13 и Cpg14 из Avp усилитель (р <0,05, п = 6-8 животных), предлагая эпигенетической маркировки этой регуляторной области по ранним жизненным опытом. В отличие от НДС, метилированиеAvp усилитель не повлияло на ELS в сыне иллюстрирует тканевой специфичности эпигенетической маркировки (рис. 4в). Анализ состояния метилирования ДНК в CpG10 и Avp экспрессии генов у контрольных животных (п = 6) свидетельствует отрицательная корреляция указывает на роль метилирования ДНК в тонкой настройки AVP экспрессии генов (рис. 4б).
Рисунок 1. Micropunches получаются из расчлененных мозги от контроля и раннего жизнь подчеркнул мышей. После ДНК и РНК, изоляция, экспрессия генов определяется QRT-PCR в то время как бисульфит рассматривать ДНК усиливается и очищенные продукты клонированы в подходящий вектор, позволяющие идентифицировать рекомбинантных клонов синий / белый выбор. Правильные размеры вставки проверяютсяПЦР колонии до проведения Big-краска реакции и обработки на капиллярной секвенсор. Метилирование картина визуализируются на соответствующие программные средства. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Сроки от ДНК / РНК добычи до бисульфит последовательности.
Рисунок 3. Workflow для одновременного извлечения ДНК и РНК. Удар гипоталамо ядра paraventricularis, маленький геном Avp выражения головного мозга, находится в 400 мкл буфера GTA, встряхивали до нарушается и далее гомогенизируется, проходя через шприц (29G). Гомогенат затем разделить для очистки ДНК и РНК. Раскол может быть 1:1 или различных пропорциях в зависимостиот конкретных экспериментальных вопрос. Гомогенатах должны быть обработаны в течение нескольких часов.
Рисунок 4. CpG метилирования в локусе Avp в 6 недель контроля и ELS животных. (А) Схема АВП и окситоцин генов ориентированных хвост к хвосту и отделены друг от друга межгенных области (ИГИ). Экзоны изображены открытые (номерные) коробки. Распределение CpG остатков указывается и размер и положение соответствующих ампликона ПЦР содержащие CpG 10 CpG14 отмечено жирной линией. (B) Метилирование Avp усилитель в ПВН в управлении ELS и животных (п = 6-8). (C) Метилирование Avp усилитель на сына в управлении ELS и животных (п = 8-10). (D) Avp экспрессии генов коррелируетс метилирования в CpG10 (п = 6). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Discussion
Эпигенетическая программирования получает все большее признание в качестве важного механизма, лежащих в основе здоровья и болезни. Здесь мы приводим точный метод для одновременного выделения ДНК и РНК из micropunches и последующие шаги для получения профилей метилирования ДНК через бисульфит последовательности. Оптимизированный рабочий процесс позволяет удобно анализ эпигенетических программирования в мозге в ответ на стимулы окружающей среды. Кроме того, этот подход облегчает исследование функциональной взаимосвязи между метилирование ДНК и экспрессии генов, как и анализируются с того же образца. Наконец, поголовья скота, необходимых для эксперимента может быть значительно уменьшена.
Некоторые меры предосторожности и руководящих принципов следует придерживаться при выполнении представлен рабочий процесс. Учитывая чрезвычайную сложность и неоднородность головного мозга и с метилирования и экспрессии могут варьироваться в клетку и ткань определенным образом это крайневажно, чтобы микроперфорацией производится в стандартном порядке. В качестве примера в момент эпигенетических программирования Avp обнаруживается в paravaventriuclar, но не в супраоптического ядра (рис. 4, б-г), два Avp выражения регионов гипоталамус 4. В связи с этим, наличие ДНК и РНК из той же ткани удара выгодно как РНК экспрессии определенных тканей конкретных генов-маркеров можно использовать в некоторых случаях для подтверждения, что правильное области был избит. Хотя микроперфорацией может уменьшить сотовой неоднородность, он должен помнить, что этот подход не приведет к изоляции отдельных типов клеток или групп населения. Дополнительные шаги очистки можно считать для решения этой теме.
Для секвенирования бисульфит оптимального проектирования грунт для ПЦР-амплификации после лечения бисульфит имеет важное значение. ПЦР-продукты более 400 б.п. в длину может быть проблематичным из-за деградации ДНК бisulfite лечения. Следует также отметить, что ПЦР может дать результат, если предвзято только несколько шаблонов нетронутым свой вклад в усиление процесса. Грунтовка пар, которые являются специфическими для модифицированного ампликона должны быть разработаны, их последовательности не должны содержать CpG динуклеотиды во избежание метилирования смещением усиления. Кроме того, грунтовки должны содержать не-CpG цитозина, чтобы предотвратить усиление неизмененных или полностью преобразовать ДНК. Усиление некоторые шаблоны могут извлечь выгоду из проведения горячего старта ПЦР. В любом случае, пригодности пары праймеров должны быть проверены в пилотных экспериментов, чтобы предотвратить порчу ценных экспериментальных образцов.
Бисульфит последовательность представляет собой стандартный метод для конкретных участков метилирования анализа, он способен надежно и точно обнаружить метилирования CpG одного остатков в аллель-специфической образом 8. Прямое секвенирование ПЦР-продукт не рекомендуется в качестве смешанного метилирования офа CpG остаток будет выглядеть как C / T двойного пика в electropherogram, который может предотвратить количественное метилирования на сайте обеспокоены. По этой причине промежуточный этап клонирования проводится и несколько клонов последовательность (~ 20-30), чтобы определить степень метилирования. Пиросеквенирования представляет собой альтернативный метод количественной метилирования ДНК. Он также использует преобразование бисульфит и бисульфит ПЦР, но вместо клонирования и секвенирования ампликонов подвергается прямой реакции пиросеквенирования где статус метилирования CpG остаток читается как C / T полиморфизм одного нуклеотида, которые могут быть легко определены количественно. Оба метода обнаружения такого же уровня метилирования 9, но так как клонирование шаг можно опустить пиросеквенирования более эффективный по времени. Однако, в зависимости от шаблона только 40-100 нуклеотидов может быть последовательность сразу, так что несколько раундов с различными пиросеквенирования грунтовка последовательности необходимо. Это является одним из важнейших ограничений, учитывая тхат большее количество ДНК (около 1 мкг на реакцию) не требуются, который обозримом превышать суммы можно получить крошечные удары ткани мозга. Таким образом, начальная проверка регионах в диапазоне от нескольких тысяч пар нуклеотидов по пиросеквенирования кажется менее подходит в качестве одного чтения клон. Тем не менее, следуя по определению небольшая область интереса пиросеквенирования должны быть рассмотрены.
Совокупность описанных выше протокол обеспечивает точный, эффективный и рациональный подход для быстрого и экономически эффективного анализа мозг micropunches на эпигенетические изменения. Несколько образцов могут быть обработаны за один проход и методы пригодны при работе с образцами из среднего размера экспериментов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась из Института Макса Планка по психиатрии и Мари Европейского союза Кюри Сеть по обучению (NINA контракта 238 665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 | |
| Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |
References
- Jirtle, R. L., Skinner, M. K. Environmental epigenomics and disease susceptibility. Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).
- Murgatroyd, C., Spengler, D. Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides. Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).
- Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases. Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).
- Murgatroyd, C. Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress. Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).
- Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression. Epigenetics. 5, (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC research notes. 4, 314 (2011).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation. Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).
