Summary
Bronchiolitis obliterans is de sleutel belemmering voor de lange termijn overleving van patiënten na longtransplantatie en het ontbreken van een robuuste preklinisch model sluit de behandeling van bronchiolitis obliterans immunopathogenese. In tegenstelling tot andere vaste orgaantransplantaties, gevasculariseerd muis longtransplantatie heeft pas recent ontwikkeld. Hier laten we ons onafhankelijk van elkaar ontwikkeld Bronchiolitis obliterans model na murine orthotoop single-longtransplantatie.
Abstract
Orthotoop longtransplantatie bij ratten werd voor het eerst gemeld door Asimacopoulos en collega's in 1971 1. Op dit moment is deze methode goed geaccepteerd en gestandaardiseerd, niet alleen voor de studie van allo-afwijzing, maar ook tussen syngene stammen voor de behandeling van de mechanismen van ischemie-reperfusie schade na longtransplantatie. Hoewel de toepassing van de rat en andere grote dieren model 2 belangrijke bijdrage geleverd aan de opheldering van deze studies, is de reikwijdte van dit onderzoek beperkt door de schaarste aan knockout en transgene ratten. Door geen effectieve therapieën voor Bronchiolitis obliterans, de belangrijkste oorzaak van overlijden bij longtransplantatie patiënten, is er sprake van een intensieve zoektocht naar pre-klinische modellen die Bronchiolitis obliterans repliceren. De tracheale allograft model is de meest gebruikte en kunnen reproduceren enkele van de histopathologische kenmerken van bronchiolitis obliterans 3. Het ontbreken van een intact vasculature met geen verbinding met het uitvoeren van de ontvanger luchtwegen, en onvolledige pathologische kenmerken van bronchiolitis obliterans beperken het nut van dit model 4. In tegenstelling tot de transplantatie van andere vaste organen, hebben gevasculariseerd muis longtransplantaties alleen het recente rapport van Okazaki en collega's voor het eerst in 2007 5. Het toepassen van de basisprincipes van de rat longtransplantatie, ons lab leidde de Bronchiolitis obliterans model met behulp van kleine histoincompatible antigeen murine orthotope single-linker long transplantaties die de verdere studie van bronchiolitis obliterans immunopathogenese 6 staat.
Protocol
1. Donor Procedure
- Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd gebruik te maken van steriele techniek. Geen antibiotica worden gegeven aan zowel de donor en de ontvanger muizen.
- Inductie van anesthesie van de donor muis wordt gestart met 5% isofluraan.
- De muis is orotracheally geïntubeerd met een 20-gauge intraveneuze katheter en vervolgens geplaatst op een knaagdier ventilator, met behulp van 100% zuurstof met een snelheid van 125 ademhalingen / minuut en ongeveer 0,5 ml ademvolume (2% van zijn lichaamsgewicht).
- Anesthesie wordt onderhouden met inhalatie 1-2% isofluraan.
- De donor muis wordt geplaatst in een liggende positie klaargestoomd met 70% alcohol.
- Laparosternotomy wordt uitgevoerd als een gecombineerde middellijn en transversale incisie.
- Heparine 100 u / kg wordt geïnjecteerd in het lagere vena cava (IVC) van iets minder dan de lever.
- Het membraan wordt gesneden langs de ventrale ribbenboog bevestiging in de richting van de wervelkolom, en van de borstholte wordt blootgesteld door het snijden van beide zijden van de borstmuur om de nek.
- Na insnijden van de IVC op het niveau van het membraan, wordt het rechter atriaal aanhangsel snijden en de longen gespoeld met 2 ml gekoelde (4 ° C) gelacteerde Ringer's injectie en 0,1 ml heparine via een dwarse incisie in de basis van de longslagader ( PA) stam.
- Arrestatie ventilatie aan twee derde van de end-tidal de inflatie, wordt de hart-long blok uitgesneden en opgeslagen op ijs (4 ° C).
- De donor linker long is voorbereid voor de ontvanger door de bevestiging van manchetten. De pulmonale ligament wordt ingesneden tot aan de Pulmonary Vein (PV). De navel wordt naar buiten gebracht door het verwijderen van de slokdarm en de aorta.
- Stel de PA, gelegen aan de schedel aspect van de navel, evenals de bijgevoegde hoofdbronchus (Br). Voorzichtig ontleden de PA van de bronchus.
- PA manchet is gemaakt van een 24-gauge Intraveneuze (IV) katheter en gesneden tot 0,5 mm met een verlenging van 0,7 mm.
- Het gehele oppervlak van de manchet wordt geschuurd met anasto vergemakkelijkenMosis.
- De manchet de bronchus afgeleid van een 20-gauge IV katheter en gesneden in lengte van 1,0 mm met een verlenging van 0,7 mm.
- Met dezelfde materialen, PV manchet varieert met het gewicht van de donor muis. In het bijzonder voor muizen 24-27 gram van de manchet is 22-gauge, 0,7 mm in de lengte met een 0,7 mm extensie. Voor muizen met een gewicht 27-32 gram, de studies gebruik gemaakt van een 20-gauge katheter die is 0,7 mm in de lengte met een 0,7 mm extensie.
- De manchetten worden in de distale uiteinden van de PA, PV en Br en vastgezet met een 9-0 hechtdraad.
- De donor long is gespoeld en gewassen met steriele zoutoplossing met een steriele heparine voor het opbergen. De donor long wordt vervolgens bedekt met een steriel gaasje gedrenkt in een steriele zoutoplossing op ijs (4 ° C), dat houdt de longen zeer schoon en steriel zijn.
- Een microvaatje klem wordt geplaatst op de bronchus naar Ringerlactaat toegang tot de luchtwegen te voorkomen.
2. Ontvanger Procedure
- Inductie van Anesthesia en mechanische ventilatie zijn dezelfde als beschreven voor de donor hierboven.
- De linker borstwand wordt geschoren en klaargestoomd met 70% alcohol en het chirurgische veld wordt gedrapeerd.
- Een thoracotomie incisie wordt gemaakt in de linker derde intercostale ruimte, uitbreiding van de incisie dorsaal in de buurt van de wervelkolom, en een microvaatje klem op de linker longvaten en bronchus grenzend aan het hart. U kunt PA op de craniale aspect, PV aan het caudale einde van de navel en Br tussen hen.
- Met behulp van zachte tractie op de hemostaat van lichte spanning op de PA, Br en PV veroorzaken, is de linker long teruggetrokken uit de borstholte, terwijl de centrale hilaire structuren geklemd.
- De PA, PV en Br worden geïsoleerd door stompe dissectie gevolgd door het plaatsen van een 9-0 hechting los gepositioneerd rond de PA, PV en Br.
- Na het ontleden van de PA volledig uit de adventitia schede, een kleine dwarse incisie van ongeveer een kwart van de omtrek van het schip isgemaakt in de voorwand, waarbij de voortzetting van de rug van de slagader intact.
- De donor long, verpakt in koude, Ringerlactaat geweekte gaasje en bereid zoals hierboven beschreven, wordt geplaatst in de borstholte en manchetten ingebracht in de ontvanger PA, PV en Br en vastgezet met 9-0 hechtdraad.
- De hilair knevel verwijderd waardoor reperfusie en ventilatie.
- Na het plaatsen van de getransplanteerde long terug in de ontvanger thorax, wordt de thoracotomie incisie gesloten met een 5-0 hechtdraad.
- De muis is toegestaan om te herstellen van anesthesie. Buprenorfine (0.05 tot 0,15 mg / kg) wordt onmiddellijk toegediend na de operatie, en voor elke 8 uur gedurende 2-3 dagen na de operatie.
3. Representatieve resultaten
Onze ervaring heeft ons geleerd dat het vereist een aantal maanden van herhaalde praktijk bekwamen in de muis longtransplantatie model. Na de vaardigheid wordt bereikt, hebben we eenchieved een 96% (96/100 opeenvolgende operaties) peri-operatieve overlevingskans met sterfgevallen die zich binnen zeven dagen na de operatie. Twee doden waren het gevolg van bloeden dat intra begon, en pneumothraces waren de oorzaak van de dood in de andere twee muizen. Voor alle procedures, de warme ischemie tijd was 14.32 ± 3.14 minuten, en koude ischemie tijd was 58.51 ± 18.06 minuten. Drie orthotoop longtransplantatie groepen werden bestudeerd: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, allograft: C57BL/10 → C57BL / 6 en C57BL / 6 → C57BL/10. We alleen gebruikt mannelijke muizen maar onze techniek kan ook worden toegepast voor vrouwelijke muizen, omdat er geen significant verschil anatomische geslachten.
Indeling van afwijzing pathologie werd uitgevoerd op een blinde manier gebruik te maken van standaard criteria voor de klinische longtransplantatie 7 (tabel 1). Terwijl we waargenomen milde of geen afwijzing in isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), beide allograft combinaties ontwikkeld bedrijvenlijkbare acute of chronische afstoting (figuur 1). Daarentegen OB werd significant meer in het C57BL/10 → C57BL / 6 dan C57BL / 6 → C57BL/10 groep door day28 (tabel 1).
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | C57BL/10 → C57BL / 6 | C57BL / 6 → C57BL/10 | P-waarde | |
| Afwijzing Pathologie "A" Scores op dag 28 | 0,67 ± 0,89 | * 3,33 ± 0,82 | * 3,29 ± 0,76 | * P> 0,05 |
| OB / Totaal aantal muizen op dag 21 en 28 | 0/24 (0%) | ** 14/34 (42,1%) | ** 2/16 (12,5%) | ** P <0,05 |
Tabel 1. Histologische scores van acute afstoting en de prevalentie van bronchiolitis obliterans na de transplantatie. Scoren van acute afstoting ("A" Scores) van Standard CRIteria zoals beschreven in representatieve resultaten. Gegevens de gemiddelde ± SD van "A" scores op dag 28 na transplantatie. Gegevens de hoeveelheid en het percentage van muizen per groep OB ontwikkeld dag 21 en 28 na transplantatie.
Figuur 1. Macroscopische bevindingen en histopathologie op 28 dagen na longtransplantatie. Panel 1A vertegenwoordigen macroscopische bevindingen en H & E gekleurd Isograft long en rechts naïef long. Panel 1B en 1C staat voor H & E en trichroom lood Masson BL/10 long allograft getransplanteerd in BL / 6 muis ontvanger, die OB en niet OB ontwikkeld, respectievelijk. De witte pijl in 1B identificeert laesies van OB. Panel 1D toont BL / 6 long allograft getransplanteerd in BL/10 muis ontvanger.
Belangrijkste verhelpen van storingen tijdens de procedure als volgt.
- Doorbloeding stoornis: Flush donor long totwordt de kleur wit van kleur. Het gebruik van overmatige druk zou kunnen leiden tot longoedeem. Maar maak je niet druk te veel om oedeem te voorkomen na transplantatie.
- Moeilijkheidsgraad van de manchet inbrengen in de donor: Controleer dat hierbij vaatstelsel is van voldoende lengte en vrij van bijgevoegde vet en bindweefsel.
- Bloeden bij anastomose site: Gebruik Q tips om de druk op de getroffen site geldt voor ongeveer 5 minuten.
- Ontvanger PA de bloedstroom obstructie: met name veroorzaakt door torsie van de manchet tijdens het inbrengen. Als lucht wordt waargenomen binnen de PA dan opnieuw te doen van de anastomose is noodzakelijk.
- Moeilijk PV anastomose: Membraan van PV is erg dun is en gemakkelijk tranen. Selecteer de juiste manchet grootte en plaats rechtstreeks naar PV van de ontvanger heel zacht.
- Ontvanger PV bloedstroom verstopping: Zorg ervoor dat de positie en richting van de manchet. Laat de compressie van de bronchiale cuff.
- Pneumothorax: Dit kan worden veroorzaakt door bronchiale perforatie door manipulation van de luchtwegen, of perforatie van de longen oppervlak als gevolg van trauma in verband met de transplantatie procedure. De eerste is behandeld met chirurgische afsluiting van de opening in de luchtweg wand en deze wordt behandeld door oversewing het lek van de long oppervlak met 10-0 nylon hechtdraad.
Discussion
Orthotoop longtransplantatie bij muizen is een uitdaging als gevolg van microchirurgische eisen en extreme kwetsbaarheid van weefsels. Inleiding van de manchet techniek heeft het mogelijk gemaakt voor het wijdverbreide gebruik van de orthotope longtransplantatie bij ratten 8. Dit werd de basis voor de ontwikkeling van de orthotoop longtransplantatie model in muizen in ons lab. In muizen en ratten, in tegenstelling tot de mens, de linker long bevat slechts een nok en maakt slechts 25% van de totale long massa. Hierdoor links een longtransplantatie haalbaar muismodel zonder een ondersteuning van de circulatie systeem.
Onze voorlopige operaties toonde aan dat ventilatie en perfusie van de getransplanteerde long was in hoge mate afhankelijk van de grootte van de PV-anastomose. Specifieke PV anastomose manchetmaat werden gebruikt om donor te passen en ontvangers zoals gerapporteerd 9. Ongepast manchet sizing resulteerde in een atelectase van de getransplanteerde long of openspringen van de PV-anastomosis. Okazaki et al melding gemaakt van het gebruik van gecombineerde schip ligatie en het knippen van de bronchus 5. In de huidige studie gebruiken we een aneurysmaclip voor alle hilaire structuren, die we voor kan warm ischemisch te verkorten. Een beperking van de orthotoop linker long transplantatie in het muizenmodel is dat de ontvanger dieren kunnen overleven na alloimmuun-gemedieerde necrose van hun allografts 5. Daarom overleven studies zijn niet haalbaar en graft beoordeling hangt af van histologisch onderzoek van de getransplanteerde long 10.
Met behulp van deze techniek, hebben we een preklinisch Bronchiolitis obliterans model bij muizen. Met name de donor muis is C57BL/10 en de ontvanger is C57BL / 6. Dit suggereert de rol van kleine en geen grote, histocompatibiliteitsantigenen in Bronchiolitis obliterans pathogenese 6. Verder hebben we gemeld neutraliseren IL-17 verhindert obliterans bronchiolitis de muismodel. Deze modusl staat voor een nieuw onderzoeksinstrument voor de behandeling van long transplantatie en de vooruitgang van de klinische longtransplantaties.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Financieringsbronnen: Dit werk zoals ondersteund door National Institutes of Health subsidies HL067177, HL096845 en P01AI084853 naar DSW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Opmi 6SFC-1880 | Prescott’s Inc | PMZ014 | |
| Harvard Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7058 | |
| 20-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100510D | |
| 22-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 081015S | |
| 24-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100522A | |
| 9/0 Meth Blue Virgin Silk | Ashaway Line Twine Mfg. CO | MBVS-90 | |
| 10-0 Alcon Surgical Suture | Alcon Laboratories, Inc | 8065-192101 | |
| Black Braided Silk 5-0/18inches | Henry Schein | M652630 | |
| Heparin Sodium 1000 units/ml | APP Pharmaceuticals | 407156 | |
| Betadine Solution | Purdue Product | 67618-150 | |
| Lactated Ringer's injection | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
| C57BL/10 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor |
| C57BL/6 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor or recipient |
Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment. |
|||
References
- Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
- Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
- McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
- Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
- Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
- Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
- Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
- Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).
