Summary
Obliterativ bronkiolit är nyckeln hinder för den långsiktiga överlevnaden av mottagare lungtransplanterade och avsaknaden av en robust preklinisk modell utesluter att undersöka obliterativ bronkiolit immunpatogenes. Till skillnad från andra fasta organtransplantationer har vaskulariserad musen lungtransplantation först nyligen har utvecklats. Här visar vi vårt egenutvecklade obliterativ bronkiolit modellen efter mus ortotopisk enda lungtransplantation.
Abstract
Ortotopisk lungtransplantation i råttor först rapporterades av Asimacopoulos och kollegor i 1971 1. För närvarande är denna metod väl accepterad och standardiserad inte bara för studier av allo-avvisande, men också mellan syngena stammar för att undersöka mekanismerna för ischemi-reperfusionsskada efter lungtransplantation. Även om tillämpningen av råtta och andra stora djurmodell 2 bidrog avsevärt till att klarlägga dessa studier, är omfattningen av dessa undersökningar begränsas av bristen på knockout och transgena råttor. På grund av att inga effektiva behandlingar för obliterativ bronkiolit, den ledande dödsorsaken bland patienter lungtransplanterade har det varit en intensiv sökning för prekliniska modeller som replikerar obliterativ bronkiolit. Den trakeal allograft modellen är den mest använda och kan reproducera en del av de histopatologiska egenskaper obliterativ bronkiolit 3. Emellertid avsaknaden av en intakt vasculature utan koppling till mottagarens luftvägarna och ofullständiga patologiska funktioner i obliterativ bronkiolit begränsar nyttan av denna modell 4. Till skillnad från transplantation av andra fasta organ, har vaskulariserade mus lungtransplantationer först nyligen rapporterats av Okazaki och kollegor för första gången i 2007 5. Tillämpa de grundläggande principerna för råtta lungtransplantation inledde vårt labb för obliterativ bronkiolit modellen med mindre histoinkompatibla antigen murina ortotopisk enda vänster lungtransplantationer som tillåter ytterligare studier av obliterativ bronkiolit immunpatogenes 6.
Protocol
1. Donator Procedur
- Alla kirurgiska förfaranden utfördes med användning av steril teknik. Inga antibiotika ges till både givare och möss mottagande.
- Induktion av anestesi av donator mus initieras med 5% isofluran.
- Musen orotracheally intuberades med en 20-gauge intravenös kateter och placerades sedan på en Rodent Ventilator, med användning av 100% syre vid en hastighet av 125 andetag per minut och cirka 0,5 ml andetagsvolym (2% av dess kroppsvikt).
- Anestesi underhållas med inhalerade 1-2% isofluran.
- Givaren mus placeras i ryggläge, prepped med 70% alkohol.
- Laparosternotomy utförs som en kombinerad mittlinjen och tvärgående snitt.
- Heparin vid 100 U / kg injiceras in i nedre hålvenen (IVC), från strax under levern.
- Membranet skärs längs den ventrala costal fastsättning mot ryggraden, och brösthålan exponeras genom att skära båda sidor av bröstkorgenväggen till halsen.
- Efter öppning av den IVC vid nivån för membranet, är den högra förmaksbihanget skära och lungorna sköljdes med 2 ml kyld (4 ° C) laktat Ringers injektion och 0,1 ml av heparin via en tvärgående incision vid roten av den pulmonära artären ( PA) stam.
- Arrestera ventilation vid två tredjedelar av slutet av tidal inflation, är hjärt-lung-block ut och lagras på is (4 ° C).
- Givaren vänstra lungan är förberedd för mottagaren av kvarstad på manschetterna. Lungans ligamentet snittas till lungvenen (PV). Den hilum förs ut genom att ta bort matstrupe och aorta.
- Identifiera PA, som ligger på den mest kraniala aspekten av hilum, liksom de bifogade viktigaste bronker (Br). Försiktigt dissekera PA från luftrör.
- PA manschetten är tillverkad av ett 24-gauge intravenös (IV) kateter och skars till 0,5 mm i längd med en förlängning av 0,7 mm.
- Hela ytan av manschetten är därefter slipas för att underlätta anastomosis.
- Manschetten för luftrör är härledd från en 20-gauge intravenös kateter, och skars i längd av 1,0 mm med en förlängning av 0,7 mm.
- Användning av samma material, varierar PV manschetten med vikten av donator mus. Specifikt för möss 24-27 gram manschetten storlek är 22-gauge, 0,7 mm i längd med en 0,7 mm förlängning. För möss som väger 27-32 gram, används studierna en 20-gauge kateter som är 0,7 mm i längd med en 0,7 mm förlängning.
- Manschetterna är införda i de distala ändarna av PA, PV och Br och säkras med en 9-0 sutur.
- Givaren lunga spolas och tvättas med steril saltlösning med steril heparin före lagring. Givaren lungan lindas sedan med steril gasbinda indränkt i steril saltlösning på is (4 ° C), som håller lungan mycket ren och steril.
- En mikrokärlsbildning klämma placeras på luftrör för att förhindra Ringer-laktat inträde i luftvägarna.
2. Mottagare Procedur
- Induktion av Anesthesia och mekanisk ventilation är desamma som beskrivits för givaren ovan.
- Den vänstra bröstkorgen rakas och förberedd med 70% alkohol och det kirurgiska fältet är draperad.
- En torakotomi snitt görs i den vänstra 3:e interkostalrummet, utvidga snittet dorsalt nära ryggraden och ett mikrokärlsbildning klämma placeras på vänster lung fartyg och luftrör intill hjärtat. Du kan se PA på kraniala aspekten PV i kaudala slutet av hilum och Br mellan dem.
- Använda försiktigt dra i hemostat för att orsaka mild spänning på PA, Br och PV är den vänstra lungan dras ut från brösthålan medan de centrala hilar strukturer fastklämd.
- PA, PV och Br isoleras genom trubbig dissektion följt av att placera en 9-0 sutur placeras löst runt den palestinska myndigheten, PV och Br.
- Efter dissekera PA helt från sin adventitiala mantel, en liten tvärgående snitt i ungefär en fjärdedel av fartygets omkrets ärgöras till den främre väggen, lämnande en fortsättning av den dorsala delen av artären intakt.
- Givaren lunga, svept i kyla, Ringer-laktat-indränkta bomullsgasväv och preparerades såsom beskrivits ovan, placeras sedan in i brösthålan och manschetter införd i mottagaren PA, PV och Br och säkras med 9-0 sutur.
- Den hilar korset klämman avlägsnas tillåter reperfusion och ventilation.
- Efter placering av transplanterade lungorna tillbaka till mottagaren thorax, är torakotomi snittet stängs med en 5-0 sutur.
- Musen fick återhämta sig från anestesin. Buprenorfin (0,05-0,15 mg / kg) administreras omedelbart efter operationen, och för var 8: e timme under 2-3 dygn efter kirurgi.
3. Representativa resultat
Vår erfarenhet har lärt oss att det krävs flera månaders upprepade praktiken att bli skicklig i musen lungtransplantation modell. Efter kunskaper uppnås, en vichieved en 96% (96/100 på varandra följande operationer) perioperativ överlevnad med dödsfall som inträffar inom sju dagar efter operationen. Två dödsfall berodde på blödande som började intraoperativt och pneumothraces var dödsorsaken i de andra två möss. För alla förfaranden, var varm ischemi tiden 14,32 ± 3,14 minuter och kall ischemi var 58,51 ± 18.06 minuter. Tre ortotopisk lungtransplanterade grupper studerades: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, transplantatavstötning: C57BL/10 → C57BL / 6 och C57BL / 6 → C57BL/10. Vi använde bara hanmöss, men vår teknik kan också tillämpas på honmöss, eftersom det inte finns någon signifikant anatomiskt skillnad mellan könen.
Gradering av avstötning patologi utfördes i ett blindtest använder enhetliga kriterier för klinisk lungtransplantation 7 (tabell 1). Medan vi observerade lindriga eller inga avslag i isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), båda allograft kombinationerna utvecklats företagförbara akut eller kronisk avstötning (figur 1). Däremot var OB betydligt mer frekvent i C57BL/10 → C57BL / 6 än C57BL / 6 → C57BL/10 grupp genom day28 (Tabell 1).
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | C57BL/10 → C57BL / 6 | C57BL / 6 → C57BL/10 | P-värde | |
| Avslag patologi A-värden vid dag 28 | 0,67 ± 0,89 | * 3,33 ± 0,82 | * 3,29 ± 0,76 | * P> 0,05 |
| OB / Totala möss vid dag 21 och 28 | 0/24 (0%) | ** 14/34 (42,1%) | ** 2/16 (12,5%) | ** P <0,05 |
Tabell 1. Histologiska värderingar för akut avstötning och utbredning av obliterativ bronkiolit efter transplantationen. Poängsättning av akut avstötning ("a" poäng) av Standard CRIterier såsom beskrivits i representativa resultat. Data representerar medelvärdet ± SD av A-värden vid dagarna 28 efter transplantation. Data som representerar den mängd och andel av mössen i varje grupp som utvecklade OB vid dagarna 21 och 28 efter transplantation.
Figur 1. Makroskopiska fynd och histopatologi vid 28 dagar efter lungtransplantation. Panel 1A representerar makroskopiska fynd och H & E färgade isograft lung och rätt naiva lunga. Panel 1B och 1C representerar H & E och Masson trikromfärgade BL/10 lungtransplantat transplanteras in i BL / 6 mus mottagare, som utvecklade OB och icke OB, respektive. Den vita pilen i 1B identifierar lesioner av OB. Panel 1D visar BL / 6 lungtransplantat transplanteras in BL/10 musen mottagare.
Huvud felsökning under förfarandet var följande.
- Blodflödet sjukdom: Flush donator lung framfärgen blir vita. Användning av för högt tryck kan orsaka lungödem. Men inte trycka för mycket för att förhindra ödem efter transplantation.
- Svårighet att manschetten föras in i givaren: försäkra sig om att kärl har tillräcklig längd och fria från vidhängande fett och bindväv.
- Blödning vid anastomotic sajt: Använd Q tips att applicera tryck vid påverkade plats för ca 5 minuter.
- Mottagare PA blodflödet hindras: Huvudsakligen på grund av vridning av den under manschetten införandet. Om luft observerades inom PA därefter åter göra med anastomosen är nödvändig.
- Svårt PV anastomos: membran av PV är mycket tunn och lätt tårar. Välj rätt manschett storlek och in direkt till mottagarens PV väldigt försiktigt.
- Mottagare PV blodflödet hindras: Se till att position och riktning av manschetten. Frigöra kompression från den bronkiala manschetten.
- Pneumothorax: Detta kan orsakas av antingen bronkiell perforering på grund av manipulation i luftvägarna, eller perforering av lungytan på grund av trauma associerad med transplantation. Fd behandlas med kirurgiska slutningen av hålet i luftvägsväggen, och den senare behandlas genom oversewing läckan på lungytan användning 10-0 nylonsutur.
Discussion
Ortotopisk lungtransplantation hos möss är en utmaning på grund av mikrokirurgisk krav och extrema känslighet av vävnader. Införande av manschetten tekniken har gjort det möjligt för den omfattande användningen av ortotopisk lungtransplantation hos råttor 8. Detta blev grunden för utvecklingen av ortotopisk lungtransplantation modell i möss i vårt labb. Hos möss och råttor, till skillnad från människor, innehåller den vänstra lungan enda lob och utgör endast 25% av den totala lungan massan. Detta gör vänstra inre lungtransplantation genomförbara inom den murina modellen utan behovet av ett cirkulationssystem stödsystem.
Våra preliminära operationer visade att ventilationen och perfusion av transplanterad lunga var starkt beroende på storleken av PV anastomos. Specifik PV anastomotic manschettstorlek utnyttjades för att matcha donator och mottagare som rapporterats 9. Olämplig manschett dimensionering resulterade i antingen atelektas av transplanterade lungorna eller sårruptur av PV anastomosis. Okazaki et al rapporterade användning av kombinerade fartygets ligering och klippa luftrör 5. I den aktuella studien använder vi ett aneurysm klämma för alla hilar strukturer, som vi föreslår kan förkorta varm ischemisk tid. En begränsning av ortotopisk vänstra lungtransplantation i murina modellen är att mottagande djur kan överleva efter alloimmuna-medierad nekros av sina allografter 5. Därför överlevnad studier inte genomförbara och transplantat bedömning beror på histologisk undersökning av det transplanterade lungan 10.
Användning av denna teknik, har vi utvecklat en preklinisk obliterativ bronkiolit modell i möss. Närmare bestämt är det donatormus C57BL/10 och mottagaren är C57BL / 6. Detta antyder roll av mindre, och inte stora, histokompatibilitetsantigener i obliterativ bronkiolit patogenes 6. Vidare har vi rapporterat neutralisering IL-17 förhindrar obliterativ bronkiolit i den murina modellen. Detta lägeL representerar en ny forsknings-verktyg för undersökning av lungtransplantation och främjande av kliniska lungtransplantationer.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansieringskällor: Detta arbete som stöds av National Institutes of Health bidrag HL067177 och HL096845 och P01AI084853 till DSW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Opmi 6SFC-1880 | Prescott’s Inc | PMZ014 | |
| Harvard Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7058 | |
| 20-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100510D | |
| 22-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 081015S | |
| 24-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100522A | |
| 9/0 Meth Blue Virgin Silk | Ashaway Line Twine Mfg. CO | MBVS-90 | |
| 10-0 Alcon Surgical Suture | Alcon Laboratories, Inc | 8065-192101 | |
| Black Braided Silk 5-0/18inches | Henry Schein | M652630 | |
| Heparin Sodium 1000 units/ml | APP Pharmaceuticals | 407156 | |
| Betadine Solution | Purdue Product | 67618-150 | |
| Lactated Ringer's injection | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
| C57BL/10 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor |
| C57BL/6 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor or recipient |
Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment. |
|||
References
- Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
- Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
- McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
- Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
- Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
- Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
- Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
- Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).
