Summary
Obliterans bronkiolitt er nøkkelen hinder for langsiktig overlevelse av lungetransplanterte mottakere og mangelen på en robust preklinisk modell utelukker undersøke obliterans bronkiolitt immunopathogenesis. I motsetning til andre faste organtransplantasjoner, har vascularized mus lungetransplantasjon bare nylig blitt utviklet. Her viser vi vår utviklet uavhengig obliterans bronkiolitt modellen etter murine orthotopic single-lungetransplantasjon.
Abstract
Orthotopic lungetransplantasjon i rotter ble først rapportert av Asimacopoulos og kolleger i 1971 1. Foreløpig er denne metoden godt akseptert og standardisert ikke bare for studier av allo-avvisning, men også mellom syngeneic stammer til å undersøke mekanismer for iskemi-reperfusjon skade etter lungetransplantasjon. Selv om anvendelsen av rotter og andre store dyr modell 2 bidratt vesentlig til klarlegging av disse studiene, er omfanget av de undersøkelser begrenset av knapphet på knockout og transgene rotter. Grunnet ingen effektiv behandling for obliterans bronkiolitt, den ledende dødsårsaken i lungetransplanterte pasienter, har det vært en intensiv søk etter pre-kliniske modeller som simulerer obliterans bronkiolitt. Den tracheal allograft modellen er den mest brukte, og kan gjengi noen av de histopatologiske trekk ved obliterans bronkiolitt tre. Men mangelen på en intakt vasculature uten tilknytning til mottakerens gjennomføre luftveiene, og ufullstendige patologiske trekk ved obliterans bronkiolitt begrense nytten av denne modellen 4. I motsetning til transplantasjon av andre faste organer, har vascularized mus lunge transplantasjoner kun nylig blitt rapportert av Okazaki og kolleger for første gang i 2007 5. Anvende de grunnleggende prinsippene i rotte lungetransplantasjon, innledet vår lab på obliterans bronkiolitt modellen med mindre histoincompatible antigen murine orthotopic single-venstre lunge transplantasjoner som gjør at videre studier av obliterans bronkiolitt immunopathogenesis 6.
Protocol
1. Donor Prosedyre
- Alle kirurgiske prosedyrer ble utført utnytte steril teknikk. Ingen antibiotika er gitt til både giver og mottaker mus.
- Induksjon av anestesi av donor musen innledes med 5% isofluran.
- Musen er orotracheally intubert med en 20-gauge venekateter og deretter plassert på en gnager ventilator, med 100% oksygen med en hastighet på 125 åndedrag per minutt og ca 0,5 ml tidevolum (2% av kroppsvekten).
- Anestesi opprettholdes med inhalert 1-2% isofluran.
- Den donor musen plasseres i en liggende stilling, preparert med 70% alkohol.
- Laparosternotomy utføres som en kombinert midtlinjen og tverrgående snitt.
- Heparin ved 100 U / kg er sprøytet inn i Inferior vena cava (IVC), fra like under leveren.
- Membranen er skåret langs ventrale costal vedlegget mot ryggraden, og brysthula er eksponert ved å kutte begge sider av brystetveggen til nakken.
- Etter incising at IVC på nivå med mellomgulvet, er retten atrial vedheng klippe og lungene skylles med 2 ml avkjølt (4 ° C) Ringer-laktat injeksjonsvæske og 0,1 ml heparin via en tverrstilt snitt ved roten av lungepulsåren ( PA) bagasjerommet.
- Arrestere ventilasjon på to tredjedeler av end-tidevann inflasjon, er hjerte-lunge-blokk fjernet og lagret på is (4 ° C).
- Den donor venstre lunge er forberedt for mottakeren ved å feste mansjettene. Den pulmonal ligament er radert opp til Pulmonary Vein (PV). Den hilum er brakt ut ved å fjerne spiserøret og aorta.
- Identifiser PA, som ligger på den mest kraniale aspektet av hilum, samt vedlagte viktigste bronkie (BR). Forsiktig dissekere PA fra bronkier.
- PA mansjetten er laget av en 24-gauge Intravenøs (IV) kateter og kuttet til 0,5 mm i lengde med en forlengelse på 0,7 mm.
- Hele overflaten av mansjetten er så slipt til rette anastomosis.
- Mansjetten for bronkie er avledet fra en 20-gauge IV kateter, og kuttet i lengde på 1,0 mm med en forlengelse på 0,7 mm.
- Bruke de samme materialene, varierer PV mansjetten med vekten av donor mus. Spesielt for mus 24-27 gram mansjetten størrelse er 22-gauge, 0,7 mm i lengde med en 0,7 mm forlengelse. For mus som veier 27-32 gram, utnyttet de studiene en 20-gauge kateter som er 0,7 mm i lengde med en 0,7 mm forlengelse.
- De mansjettene er satt inn i distale endene av PA, PV og Br og sikret med en 9-0 sutur.
- Den donor lunge spyles og vaskes med sterilt saltvann med steril heparin før lagring. Den donor lunge blir deretter pakket med sterilt gasbind fuktet i sterilt saltvann på is (4 ° C), som holder lungen veldig rent og sterilt.
- En microvessel klemme plasseres på bronkie for å hindre Ringer-laktat inntreden i luftveiene.
2. Mottakers Prosedyre
- Induksjon av anesthesia og mekanisk ventilasjon er de samme som beskrevet for donor ovenfor.
- Den venstre brystveggen er barbert og preparert med 70% alkohol og det kirurgiske feltet er drapert.
- En torakotomi innsnitt er gjort i venstre tredje interkostalrom, utvide snittet dorsally nær ryggraden, og en microvessel klemme plassert på venstre lunge fartøyene og bronkier tilstøtende til hjertet. Du kan se PA på skallen aspektet, PV ved kaudal slutten av hilum og Br mellom dem.
- Bruk skånsom trekkraft på hemostat å forårsake mild spenning på PA, Br og PV, er venstre lunge trukket ut fra brysthula samtidig la de sentrale hilar strukturer festet.
- PA, PV og Br er isolert av stump disseksjon fulgt ved å plassere en 9-0 sutur plassert løst rundt PA, PV og Br.
- Etter dissekere PA helt fra sin adventitial kappe, en liten tverrstilt snitt på ca en fjerdedel av fartøyets omkrets ergjort i fremre vegg, slik at videreføring av dorsal del av arterien intakt.
- Donor lunge, innpakket i kaldt, Ringer-laktat-våte bomull gasbind og tilberedt som beskrevet ovenfor, blir så plassert inn i thorax hulrom, og mansjetter settes inn i mottakeren PA, PV og Br og sikret med 9-0 sutur.
- Den hilar korset klemmen er fjernet slik at for reperfusjon og ventilasjon.
- Etter å plassere transplanterte lungen tilbake til mottakeren thorax er torakotomi snittet lukkes med en 5-0 sutur.
- Musen er tillatt å komme seg fra anestesi. Buprenorfin (0,05 til 0,15 mg / kg) administreres umiddelbart etter operasjonen, og for hver 8 timer 2-3 dager etter operasjonen.
3. Representative Resultater
Vår erfaring har lært oss at det krever flere måneder med gjentatte øvelser for å bli dyktigere i mus lungetransplantasjon modell. Etter ferdighet oppnås, en vichieved en 96% (96/100 påfølgende operasjoner) perioperative overlevelse med dødsfall innen syv dager etter operativt. To dødsfall skyldtes blødninger som begynte intraoperativt, og pneumothraces var dødsårsaken i de to andre musene. For alle prosedyrer, var varm iskemi tiden 14,32 ± 3.14 minutter, og kald iskemi tid var 58,51 ± 18.06 minutter. Tre orthotopic lungetransplanterte grupper ble undersøkt: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, allograft: C57BL/10 → C57BL / 6 og C57BL / 6 → C57BL/10. Vi brukte kun mannlige mus, men vår teknikk kan også brukes til hunnmus, fordi det er ingen signifikant anatomisk forskjell mellom kjønnene.
Gradering av avvisning patologi ble gjennomført i en blindet mote benytte standard kriterier for klinisk lungetransplantasjon 7 (tabell 1). Mens vi observerte mild eller ingen avvisning i isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), begge allograft kombinasjoner utviklet selskaperdelig akutt eller kronisk avvisning (figur 1). Derimot var OB signifikant hyppigere i C57BL/10 → C57BL / 6 enn C57BL / 6 → C57BL/10 gruppe med day28 (Tabell 1).
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | C57BL/10 → C57BL / 6 | C57BL / 6 → C57BL/10 | P-verdi | |
| Avslag Pathology "A" Poeng på dag 28 | 0.67 ± 0.89 | * 3.33 ± 0.82 | * 3.29 ± 0.76 | * P> 0,05 |
| OB / Total mus på dag 21 og 28 | 0/24 (0%) | ** 14/34 (42,1%) | ** 2/16 (12,5%) | ** P <0,05 |
Tabell 1. Histologiske score til akutt avvisning og prevalens av obliterans bronkiolitt etter transplantasjon. Scoring av akutt avstøting ("A" Poeng) ved standard kriTeria som beskrevet i representative resultater. Data representerer gjennomsnittlig ± SD "A" Poeng på dager 28 etter transplantasjonen. Data representerer mengde og andel av musene i hver gruppe som utviklet OB på dager 21 og 28 etter transplantasjon.
Figur 1. Makroskopiske funn og histopatologi på 28 dager etter lungetransplantasjon. Panel 1A representere makroskopiske funn og H & E beiset Isograft lunge og høyre naiv lunge. Panel 1B og 1C representerer H & E og Masson sine Trichrome beiset BL/10 lunge allograft transplantert inn BL / 6 mus mottaker, som utviklet OB og ikke OB, henholdsvis. Den hvite pilen i 1B identifiserer lesjoner i OB. Panel 1D viser BL / 6 lunge allograft transplantert inn BL/10 mus mottaker.
Hoved feilsøking under inngrepet var som følger.
- Blodstrømmen lidelse: Flush donor lunge inntilfargen blir hvit i fargen. Bruk av overtrykk kan indusere lungeødem. Men ikke presse for mye å forebygge ødem etter transplantasjon.
- Vansker med mansjett innsetting i donor: konstatere at blodkar er av tilstrekkelig lengde og uten vedlagte fett og bindevev.
- Blødning ved anastomotisk site: Bruk Q tips til å legge press på det infiserte stedet i ca 5 minutter.
- Mottaker PA blodstrøm obstruksjon: Hovedsakelig forårsaket av torsjon av under mansjetten innsetting. Hvis luften er observert i PA deretter re-do av anastomosen er nødvendig.
- Vanskelig PV anastomose: Membran av PV er svært tynn og lett tårer. Velg riktig mansjett størrelse og sette rett til mottakerens PV veldig forsiktig.
- Mottakers PV blodstrøm obstruksjon: Pass på at posisjonen og retningen av mansjetten. Slipp kompresjonen fra bronkial mansjetten.
- Pneumothorax: Dette kan skyldes enten bronkial perforasjon grunn manipulation av luftveiene, eller perforasjon av lunge overflaten på grunn av traumer knyttet til transplantasjon prosedyren. Den tidligere er behandlet med kirurgisk lukking av hullet i luftveiene veggen, og sistnevnte blir behandlet av oversewing lekkasjen på lungen overflaten med 10-0 nylon sutur.
Discussion
Orthotopic lungetransplantasjon i mus er utfordrende på grunn mikrokirurgiske krav og ekstrem skjørhet av vev. Innføring av mansjetten teknikken har åpnet for utbredt bruk av orthotopic lungetransplantasjon i rotter 8. Dette ble grunnlaget for utviklingen av orthotopic lungetransplantasjon modell hos mus i vår lab. Hos mus og rotter, i motsetning til mennesker, inneholder den venstre lungen eneste lapp og utgjør bare 25% av den totale lunge masse. Dette gjør venstre-singel lungetransplantasjon gjennomførbart i murine modellen uten behov for en sirkulasjons støttesystem.
Våre foreløpige operasjoner avslørt at ventilasjon og perfusjon av det transplanterte lungen var svært avhengig av størrelsen på PV anastomose. Spesifikk PV anastomotisk mansjettstørrelse ble utnyttet til å matche donor og mottaker, som rapportert ni. Upassende cuff dimensjonering resulterte i enten atelektase av det transplanterte lungen eller Spaltedannelse av PV anastomosis. Okazaki et al rapporterte bruk av kombinerte fartøy ligation og klipping av bronkie 5. I denne studien bruker vi en aneurisme klipp for alle hilar strukturer, som vi foreslår kan forkorte varm iskemisk tid. En begrensning av orthotopic venstre lunge transplantasjon i murine modellen er at mottaker dyr kan overleve etter alloimmune-mediert nekrose av sine allografts 5. Derfor overlevelse studier er ikke gjennomførbart og pode vurdering avhenger histologisk undersøkelse av transplanterte lungen 10.
Ved hjelp av denne teknikken, har vi utviklet en preklinisk obliterans bronkiolitt modell hos mus. Spesielt er donor musen C57BL/10 og mottaker er C57BL / 6. Dette tyder rolle mindre, og ikke store, histocompatibility antigener i obliterans bronkiolitt patogenesen 6. Videre har vi rapportert nøytralisere IL-17 forhindrer obliterans bronkiolitt i murine modellen. Denne modusenl representerer en roman forskning verktøy for undersøkelse av lungetransplantasjon og fremme av klinisk lunge transplantasjoner.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Finansieringskilder: dette arbeidet som støttes av National Institutes of Health tilskudd HL067177 og HL096845 og P01AI084853 til DSW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Opmi 6SFC-1880 | Prescott’s Inc | PMZ014 | |
| Harvard Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7058 | |
| 20-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100510D | |
| 22-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 081015S | |
| 24-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100522A | |
| 9/0 Meth Blue Virgin Silk | Ashaway Line Twine Mfg. CO | MBVS-90 | |
| 10-0 Alcon Surgical Suture | Alcon Laboratories, Inc | 8065-192101 | |
| Black Braided Silk 5-0/18inches | Henry Schein | M652630 | |
| Heparin Sodium 1000 units/ml | APP Pharmaceuticals | 407156 | |
| Betadine Solution | Purdue Product | 67618-150 | |
| Lactated Ringer's injection | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
| C57BL/10 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor |
| C57BL/6 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor or recipient |
Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment. |
|||
References
- Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
- Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
- McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
- Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
- Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
- Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
- Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
- Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).
