Summary
التهاب القصيبات المسد هو المعوق الرئيسي لبقاء طويل الأمد للمتلقي زرع الرئة وعدم وجود نموذج ما قبل السريرية قوي يحول دون دراسة مسد إمراض مناعي التهاب القصيبات. خلافا لغيرها من عمليات زرع الأعضاء الصلبة، وأوعية دموية فأر زرع رئة إلا في الآونة الأخيرة وضعت. هنا نعرض لدينا نموذج تطويرها بشكل مستقل التهاب القصيبات مسد الفئران بعد زرع رئة واحدة orthotopic.
Abstract
لاول مرة زرع مثلي الرئة في الفئران عن طريق Asimacopoulos وزملاؤه في عام 1971 1. حاليا، وهذه الطريقة مقبولة بشكل جيد وموحدة، ليس فقط لدراسة غرابة الرفض ولكن أيضا بين السلالات مسانج لدراسة آليات من نقص التروية، ضخه الاصابة بعد زرع الرئة. على الرغم من أن تطبيق هذه الفئران وغيرها من نموذج حيواني كبيرة 2 ساهمت بشكل كبير في توضيح هذه الدراسات، ويقتصر نطاق تلك التحقيقات التي تقوم بها قلة من خروج المغلوب والفئران المعدلة وراثيا. بسبب عدم علاجات فعالة لالتهاب القصيبات مسد، والسبب الرئيسي للوفاة في مرضى زرع الرئة، وكان هناك بحث مكثفة لمرحلة ما قبل السريرية النماذج التي تحاكي التهاب القصيبات مسد. نموذج طعم خيفي القصبة الهوائية هو الأكثر استخداما على نطاق واسع، وربما إعادة إنتاج بعض ملامح histopathologic من التهاب القصيبات مسد 3. ومع ذلك، فإن عدم وجود vasculat سليمةلدى عودتهم لا علاقة لشركة الخطوط الجوية المستلم إجراء، وميزات مرضية غير مكتملة من التهاب القصيبات مسد تحد من فائدة من هذا النموذج 4. خلافا لزرع الأعضاء الصلبة الأخرى، ومؤخرا فقط تم زرع أوعية دموية رئة الفأر التي أبلغ عنها أوكازاكي وزملاؤه للمرة الأولى في 2007 5. تطبيق المبادئ الأساسية لزرع رئة الفئران، بدأ مختبر لدينا نموذج التهاب القصيبات مسد استخدام قاصر مستضد الفئران متنافر نسيجيا orthotopic زرع رئة واحدة لليسار الذي يسمح للمزيد من الدراسة من إمراض مناعي التهاب القصيبات مسد 6.
Protocol
1. المانحة الداخلي
- تم تنفيذ جميع العمليات الجراحية باستخدام تقنية معقمة. لا يتم إعطاء المضادات الحيوية لكلا الجهات المانحة والمتلقية الفئران.
- يبدأ التخدير من الفأرة المانحة مع 5٪ Isoflurane.
- ومدخل أنبوب orotracheally الماوس مع قسطرة 20-مقياس الوريد ثم وضعت على جهاز التنفس الصناعي القوارض، وذلك باستخدام 100٪ أكسجين بمعدل من 125 الأنفاس / دقيقة، وحوالي 0.5 مل حجم المد والجزر (2٪ من وزنه).
- ويحتفظ التخدير مع Isoflurane 1-2٪ استنشاقه.
- هيأهم يتم وضع الماوس المانحة في موقف ضعيف، مع الكحول 70٪.
- يتم تنفيذ Laparosternotomy بمثابة خط الوسط مجتمعة وشق عرضي.
- يتم حقن الهيبارين على 100 كجم / ش إلى الوريد الأجوف السفلي (IVC)، من أسفل الكبد.
- وقطع الحجاب الحاجز على طول تعلق ضلعي بطني نحو العمود الفقري، ويتعرض التجويف الصدري عن طريق خفض كلا الجانبين من الصدرجدار في الرقبة.
- بعد عمل قطع في IVC على مستوى الحجاب الحاجز، ويتم قطع ذيل حق الأذيني ومسح الرئتين مع 2 مل من المبرد (4 درجة مئوية) Lactated رينغر حقن و 0.1 مل من الهيبارين عن طريق شق عرضي في جذر الشريان الرئوي ( السلطة الفلسطينية) الجذع.
- إلقاء القبض على تهوية في ثلثي نهاية المد والجزر التضخم، ورفعه كتلة القلب والرئة وتخزينها على الجليد (4 درجة مئوية).
- يتم إعداد الرئة اليسرى المانحة للمتلقي من قبل المرفق من الأصفاد. يتم شق رباط رئوي حتى الوريد الرئوي (PV). يتم جلب نقير خارج عن طريق إزالة المريء والشريان الأورطي.
- التعرف على السلطة الفلسطينية، التي تقع في الجانب الأكثر الجمجمة من نقير، فضلا عن قصبة المرفق الرئيسي (BR). بعناية تشريح للسلطة الفلسطينية من الشعب الهوائية.
- تتكون السلطة الفلسطينية صفعة من قسطرة 24 المقياس (الرابع) عن طريق الوريد، وخفض إلى 0.5 ملم في الطول مع ملحق من 0.7 مم.
- ومن ثم تسبب تآكل كامل سطح الكفة لتسهيل anastomosis.
- مشتق صفعة للقصبة من قسطرة الرابع 20-قياس، وخفض في طول 1.0 مم مع ملحق من 0.7 مم.
- باستخدام نفس المواد، والكفة الكهروضوئية يختلف مع الوزن من الفأرة المانحة. على وجه التحديد، بالنسبة للفئران 24-27 غراما من حجم الكفة هو 22 عيار 0.7 ملم في الطول مع ملحق مم 0.7. بالنسبة للفئران وزنها 27-32 جرام، والاستفادة من الدراسات قسطرة 20-قياس هذا هو 0.7 ملم في الطول مع ملحق مم 0.7.
- تندس في الأصفاد إلى نهايات البعيدة للالكهروضوئية، والسلطة الفلسطينية، والأخ، وتشتمل على خياطة 9-0.
- يتم مسح الرئة من الجهات المانحة وغسلها بمحلول ملحي معقم مع الهيبارين معقم قبل التخزين. يتم تغليف ثم الرئة المانحة مع شاش معقم غارقة في المياه المالحة عقيمة على الجليد (4 درجة مئوية)، والتي تحافظ على رئة نظيفة جدا وعقيم.
- يتم وضع المشبك microvessel على قصبة لمنع دخول Lactated قارع الأجراس في مجرى الهواء.
2. المتلقي الداخلي
- تحريض anesthesia والتهوية الميكانيكية هي نفسها كما هو موضح لالمانحة أعلاه.
- وحلق جدار الصدر الأيسر وهيأهم مع الكحول 70٪ ورايات مجال الجراحة.
- يتم إجراء شق بضع الصدر في الفضاء اليسار وربي الثالث، توسيع شق وثيق ظهريا في العمود الفقري، والمشبك microvessel المفروضة على السفن وقصبة الرئة اليسرى المحاذية للقلب. يمكنك ان ترى السلطة الفلسطينية في الجانب الجمجمة، الكهروضوئية في نهاية الذيلية من نقير والأخ بينهما.
- باستخدام الجر لطيف على مرقئ إلى إحداث توتر معتدل على الأخ، والسلطة الفلسطينية، والكهروضوئية، يتم سحبها من الرئة اليسرى من التجويف الصدري في حين ترك هياكل نقيري المركزية فرضت.
- يتم عزل، والسلطة الفلسطينية الكهروضوئية والأخ من قبل تشريح حادة تليها وضع خياطة 9-0 وضعه فضفاضة حول الكهروضوئية والسلطة الفلسطينية وبرازيلي.
- بعد تشريح السلطة الفلسطينية تماما من غمده براني، شق صغير عرضية من ما يقرب من ربع محيط السفينة هوتقدم الى الجدار الأمامي، وترك استمرار الجزء الظهري من الشريان سليمة.
- ثم يتم وضعه في الرئة المانحة، ملفوفة في و، Lactated الباردة الشاش القطن قارع الأجراس بالدماء، وأعدت على النحو الموصوف أعلاه، في التجويف الصدري، والأصفاد إدراجها في PV المتلقي والسلطة الفلسطينية والأخ وتأمينها مع خياطة 9-0.
- يتم إزالة المشبك عبر نقيري السماح لضخه والتهوية.
- بعد تحديد المواقع في الرئة المزروعة مرة أخرى في صدر المتلقي، يتم إغلاق شق بضع الصدر باستخدام خياطة 5-0.
- ولا يسمح للماوس على التعافي من التخدير. ويدير البوبرينورفين (0،05-0،15 ملغ / كلغ) على الفور بعد عملية جراحية، ومقابل كل 8 ساعات لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة.
3. ممثل النتائج
وقد علمتنا تجربتنا أنه يتطلب عدة أشهر من الممارسة المتكررة ليبرعوا في عملية زرع رئة الفأر نموذج. بعد أن يتم تحقيق الكفاءة، لديناchieved أن 96٪ (96/100 عملية جراحية على التوالي) معدل البقاء على قيد الحياة المحيطة بالجراحة مع الوفيات التي حدثت في آخر الأيام السبعة الجراحة. وكانت وفاة شخصين بسبب النزيف الذي بدأ intraoperatively، وpneumothraces كان سبب الوفاة في الفئران اثنين آخرين. لجميع الإجراءات، وهذه هي المرة الإسكيمية دافئ 14.32 ± 3.14 دقيقة، والباردة مرة الإسكيمية كان 58.51 ± 18.06 دقيقة. وتمت دراسة ثلاثة زرع رئة orthotopic مجموعات: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6، طعم خيفي: C57BL/10 → C57BL / 6 و C57BL / 6 → C57BL/10. كنا الفئران الذكور فقط ولكن يمكن لنا تقنية ينطبق أيضا على إناث الفئران، لأنه لا يوجد فرق كبير تشريحية بين الجنسين.
وقد أجريت الدرجات من الأمراض الرفض بأسلوب أعمى استخدام المعايير القياسية لزرع رئة سريرية 7 (الجدول 1). في حين لاحظنا رفض معتدل أو لا في isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6)، وكلاهما معا طعم خيفي المتقدمة يحتمrable الرفض الحاد أو المزمن (الشكل 1). في المقابل، كان OB بشكل ملحوظ أكثر تواترا في C57BL/10 → C57BL / 6 من C57BL / 6 → C57BL/10 مجموعة من day28 (الجدول 1).
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | C57BL/10 → C57BL / 6 | C57BL / 6 → C57BL/10 | ف قيمة | |
| رفض علم الأمراض "A" العشرات في اليوم 28 | 0.67 ± 0.89 | * 3.33 ± 0.82 | * 3.29 ± 0.76 | * P> 0.05 |
| OB / الفئران المجموع في يوم 21 و 28 | 0/24 (0٪) | ** 14/34 (42.1٪) | ** 2/16 (12.5٪) | ** P <0.05 |
الجدول رقم 1. عشرات نسيجية من الرفض الحاد وانتشار التهاب القصيبات زرع مسد آخر. التهديف من الرفض الحاد ("A" العشرات) من قبل المركز الجهوي للاستثمار قياسيteria كما هو موضح في نتائج ممثل. البيانات تمثل متوسط ± التنمية المستدامة من عشرات "A" في زرع أيام آخر 28. البيانات تمثل الكمية والنسبة المئوية من الفئران في كل مجموعة التي وضعت OB في أيام 21 و 28 زرع آخر.
الشكل 1. نتائج عياني والتشريح المرضي في 28 يوما آخر زرع رئة. لوحة تمثل 1A نتائج العيانية و H & E الرئة Isograft الملون والرئة السذاجة حق. 1B 1C الفريق ويمثل H & E وماسون وثلاثي الألوان الملون طعم خيفي الرئة BL/10 زرعها في المتلقي الماوس BL / 6، التي وضعت OB OB وغير، على التوالي. السهم الأبيض في 1B يحدد آفات OB. 1D لوحة يظهر BL / 6 طعم خيفي الرئة زرعها في المتلقي الماوس BL/10.
وكانت أهم مشكلة اطلاق النار أثناء إجراء على النحو التالي.
- اضطراب تدفق الدم: فلوش الرئة المانحة حتىاللون يصبح لونه ابيض. ويمكن استخدام الضغط المفرط لحث ذمة رئوية. ولكن لا يدفع الكثير للحيلولة دون وذمة بعد الزرع.
- صعوبة إدخال الكفة إلى الجهة المانحة: التأكد من أن الأوعية الدموية هو من طول كافية وخالية من الدهون والأنسجة المرفقة الضام.
- نزيف في موقع تفاغري: استخدام نصائح س لممارسة الضغط على موقع المتضررة لحوالي 5 دقائق.
- المتلقي عرقلة تدفق الدم للسلطة الفلسطينية: وهو ينجم أساسا عن التواء من خلال الإدراج الكفة. إذا لاحظ الهواء داخل السلطة الفلسطينية ثم إعادة فعل من التفمم ضروري.
- من الصعب PV مفاغرة: غشاء الكهروضوئية رقيقة جدا والدموع بسهولة. تحديد الحجم المناسب وإدراج صفعة مباشرة الى PV المستلم بلطف جدا.
- المستفيد من تدفق الدم PV إعاقة: تأكد من موقف واتجاه الكفة. الافراج عن ضغط من صفعة الشعب الهوائية.
- استرواح الصدر: قد يكون سبب هذا إما عن طريق ثقب الشعب الهوائية بسبب تلاعبن من مجرى التنفس، أو ثقب من سطح الرئة بسبب الصدمة المرتبطة إجراء عملية زرع. يتم التعامل مع السابق مع إغلاق جراحي لثقب في جدار الشعب الهوائية، ويتم التعامل مع هذا الأخير من قبل oversewing تسرب على سطح الرئة باستخدام 10-0 خاط النايلون.
Discussion
زرع مثلي الرئة في الفئران ويتحدى بسبب مطالب المجهرية والهشاشة البالغة للأنسجة. وقد سمح إدخال تقنية صفعة للاستخدام على نطاق واسع من زرع الرئة في الفئران orthotopic 8. وأصبح هذا الأساس لتطوير نموذج زرع رئة orthotopic في الفئران في المختبر. في الفئران والجرذان، وخلافا للبشر، الرئة اليسرى يحتوي على واحد فقط، والفص لا تشكل سوى 25٪ من مجموع كتلة الرئة. وهذا يجعل من اليسار واحد زرع رئة الممكنة في نموذج الفئران من دون الحاجة إلى وجود نظام دعم الدورة الدموية.
وكشفت عملية جراحية لدينا الأولية التي والتهوية، ونضح من الرئة المزروعة كانت تعتمد بشكل كبير على حجم مفاغرة الكهروضوئية. واستخدمت محددة الكفة تفاغري الكهروضوئية لتتناسب مع حجم المانحين والمتلقين كما ذكرت 9. غير ملائم التحجيم الكفة أسفرت إما انخماص الرئة المزروعة أو تفزر من anast الكهروضوئيةomosis. وذكرت أوكازاكي وآخرون استخدام ربط السفينة مجتمعة، وتقليم 5 القصبات الهوائية. وفي الدراسة الحالية التي نستخدمها مقطع أم الدم لجميع هياكل نقيري، التي نقترح قد يختصر الوقت الدماغية دافئ. واحد الحد من زراعة الرئة اليسرى orthotopic في نموذج الفئران أن الحيوانات المتلقي يمكن البقاء على قيد الحياة بعد منيع للمستضد الخيفي بوساطة تنخر allografts بهم 5. ولذلك، دراسات البقاء على قيد الحياة غير ممكن، وتقييم الكسب غير المشروع يعتمد على الفحص النسيجي في الرئة المزروعة 10.
باستخدام هذه التقنية، قمنا بتطوير نموذج ما قبل السريرية التهاب القصيبات مسد في الفئران. على وجه التحديد، الماوس المانحة C57BL/10 وكان المستفيد C57BL / 6. هذا يشير إلى دور قاصر، وليس رئيسيا مستضدات التوافق النسيجي، في التسبب التهاب القصيبات مسد 6. وعلاوة على ذلك، أفادت نحن تحييد IL-17 يمنع التهاب القصيبات مسد في نموذج الفئران. هذا الوضعل يمثل أداة بحث جديدة لفحص زرع الرئة والنهوض زرع رئة السريرية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
مصادر التمويل: وهذا العمل كما هو معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL067177، HL096845، وP01AI084853 إلى DSW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Opmi 6SFC-1880 | Prescott’s Inc | PMZ014 | |
| Harvard Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7058 | |
| 20-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100510D | |
| 22-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 081015S | |
| 24-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100522A | |
| 9/0 Meth Blue Virgin Silk | Ashaway Line Twine Mfg. CO | MBVS-90 | |
| 10-0 Alcon Surgical Suture | Alcon Laboratories, Inc | 8065-192101 | |
| Black Braided Silk 5-0/18inches | Henry Schein | M652630 | |
| Heparin Sodium 1000 units/ml | APP Pharmaceuticals | 407156 | |
| Betadine Solution | Purdue Product | 67618-150 | |
| Lactated Ringer's injection | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
| C57BL/10 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor |
| C57BL/6 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor or recipient |
Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment. |
|||
References
- Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
- Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
- McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
- Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
- Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
- Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
- Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
- Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).
