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Medicine

Desenvolvimento de bronquiolite obliterante em um modelo murino de transplante de pulmão ortotópico

doi: 10.3791/3947 Published: July 10, 2012

Summary

Bronquiolite obliterante é o impedimento-chave para a sobrevivência a longo prazo de transplantados de pulmão e à falta de um modelo robusto pré-clínica impede examinar imunopatogênese bronquiolite obliterante. Ao contrário de outros transplantes de órgãos sólidos, o transplante de pulmão vascularizado do mouse tem apenas recentemente foram desenvolvidos. Aqui nós mostramos o nosso modelo de bronquiolite obliterante desenvolvida de forma independente após murino de transplante de pulmão único-ortotópico.

Abstract

Transplante de pulmão ortotópico em ratos foi primeiramente relatada por Asimacopoulos e colegas em 1971 1. Actualmente, este método é bem aceite e padronizada não só para o estudo de alo-rejeição, mas também entre as estirpes singeneicos para o exame de mecanismos de isquemia-reperfusão após o transplante de pulmão. Embora a aplicação do rato e modelo animal outra grande 2 contribui significativamente para a elucidação destes estudos, o âmbito de aplicação destas investigações é limitada pela escassez de knockout e ratos transgénicos. Devido a não terapias eficazes para bronquiolite obliterante, a principal causa de morte em pacientes de transplante de pulmão, tem havido uma intensa busca por modelos pré-clínicos que reproduzem bronquiolite obliterante. O modelo do enxerto traqueal é o mais usado e pode reproduzir algumas das características histopatológicas de bronquiolite obliterante 3. No entanto, a falta de um vasculat intactaure sem conexão com vias aéreas de condução do destinatário, e incompletos características patológicas da bronquiolite obliterante limitar a utilidade do modelo 4. Ao contrário de outros transplante de órgãos sólidos, transplantes de pulmão de rato vascularizados só recentemente foram relatados por Okazaki e colaboradores, pela primeira vez em 2007 5. Aplicando os princípios básicos do transplante de pulmão de rato, o nosso laboratório iniciou o modelo de bronquiolite obliterante com menores histoincompatible antígenos murinos ortotópicos transplantes único pulmão esquerdo que permite o estudo mais aprofundado da imunopatogenia bronquiolite obliterante 6.

Protocol

1. Procedimento de Doadores

  1. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados utilizando técnica estéril. Sem antibióticos são dadas para o dador eo ratos receptores.
  2. A indução da anestesia do rato dador é iniciado com 5% de isoflurano.
  3. O rato é orotraquealmente entubados com um cateter de calibre 20 intravenosa e, em seguida, colocado num ventilador de roedor, utilizando 100% de oxigénio, a uma taxa de 125 respirações / minuto e cerca de 0,5 ml de volume corrente (2% do seu peso corporal).
  4. A anestesia é mantida com inalado 1-2% de isoflurano.
  5. O rato doador é colocado em decúbito dorsal, preparado com álcool 70%.
  6. Laparosternotomy é realizado como uma linha média combinado e incisão transversal.
  7. A heparina a 100 U / kg é injectado na veia cava inferior (IVC), a partir de apenas abaixo do fígado.
  8. O diafragma é cortada ao longo da ligação ventral costal para a coluna, e da cavidade torácica é exposta através do corte ambos os lados do peitoparede para o pescoço.
  9. Após uma incisão na veia cava inferior ao nível do diafragma, a aurícula direita é cortado e os pulmões lavada com 2 ml de solução arrefecida (4 ° C) de injecção de Lactato de Ringer e 0,1 ml de heparina por meio de uma incisão transversal na raiz da artéria pulmonar ( PA tronco).
  10. Prendendo a ventilação, dois terços de final de corrente de inflação, o bloco de coração-pulmão é excisada e armazenadas em gelo (4 ° C).
  11. O pulmão esquerdo do doador está preparado para o destinatário mediante a anexação de algemas. O ligamento pulmonar é incisada até a veia pulmonar (PV). O hilo é trazido para fora através da remoção de esôfago e aorta.
  12. Identificar o PA, localizado no aspecto mais cranial do hilo, bem como os brônquios principais anexas (Br). Dissecar cuidadosamente a PA do brônquio.
  13. Manguito PA é feita a partir de uma 24-bitola intravenosa cateter (IV) e cortar a 0,5 mm de comprimento com uma extensão de 0,7 mm.
  14. A totalidade da superfície da braçadeira é então raspada para facilitar anastomoseMOSIS.
  15. A braçadeira para o brônquio é derivado de um cateter IV de calibre 20, e cortado em comprimento de 1,0 mm com uma extensão de 0,7 mm.
  16. Usando os mesmos materiais, a braçadeira PV varia de acordo com o peso do rato dador. Especificamente, para ratinhos 24-27 gramas o tamanho da braçadeira é de 22 gauge, 0,7 mm de comprimento com uma extensão de 0,7 mm. Para ratinhos pesando 27-32 gramas, os estudos utilizou um cateter de calibre 20 que é de 0,7 mm de comprimento com uma extensão de 0,7 mm.
  17. As bainhas são inseridos nas extremidades distais dos, PA PV e Br e fixado com uma sutura 9-0.
  18. O pulmão dador é lavada e lavada com solução salina estéril com heparina estéril antes da armazenagem. O pulmão doador é então enrolado com uma gaze estéril embebida em soro fisiológico estéril em gelo (4 ° C), que mantém o pulmão muito limpo e estéril.
  19. Uma braçadeira de microvasos é colocada sobre os brônquios para impedir a entrada de Lactato de Ringer para a via aérea.

2. Procedimento destinatário

  1. A indução de anestesiaral e ventilação mecânica são os mesmos conforme descrito acima para o doador.
  2. A parede torácica esquerda é raspada e preparada com álcool 70% e do campo cirúrgico é coberto.
  3. Uma incisão é feita toracotomia no terceiro espaço intercostal esquerdo, estendendo-se a incisão dorsalmente perto da coluna vertebral, e uma pinça de microvasos colocado sobre os vasos pulmonares esquerdas e brônquios adjacentes ao coração. Você pode ver PA, no aspecto cranial, PV no final do caudal do hilo e Br entre eles.
  4. Usando a tração suave na pinça hemostática para causar tensão leve no, PA Br e PV, o pulmão esquerdo é puxado para fora da cavidade torácica, deixando as estruturas hilares centrais preso.
  5. O PA, PV e Br são isolados por dissecção romba, seguido pela colocação de uma sutura 9-0 posicionado frouxamente ao redor do, PA e PV Br.
  6. Após dissecção do PA completamente a partir da sua bainha adventícia, de uma pequena incisão transversal de cerca de um quarto da circunferência do navio éfeita na parede anterior, deixando a continuação da parte dorsal da artéria intacta.
  7. O pulmão doador, enrolado em frio gaze de algodão, de Lactato de Ringer-embebida e preparada como descrito acima, é então posicionado na cavidade torácica, e punhos inserido no receptor PA, PV e Br e fixado com 9-0 sutura.
  8. A braçadeira cruzada hilar é removido permitindo a reperfusão e ventilação.
  9. Depois de posicionar o pulmão transplantadas de volta para o tórax do destinatário, a incisão é fechada toracotomia usando uma sutura 5-0.
  10. O mouse é permitido recuperar da anestesia. A buprenorfina (0,05-0,15 mg / kg) é administrado imediatamente após a cirurgia, e para cada 8 horas durante 2-3 dias pós-cirurgia.

3. Os resultados representativos

Nossa experiência nos ensinou que requer vários meses de prática repetida para se tornar proficientes no modelo de transplante de pulmão do rato. Depois de proficiência é obtido, temos umchieved uma taxa de sobrevivência de 96% (96/100 cirurgias consecutivas) perioperatório com mortes ocorrendo dentro de sete dias pós operatório. Duas mortes foram devido ao sangramento que começou no intra-operatório, e pneumothraces foram a causa de morte nos outros dois camundongos. Para todos os procedimentos, o tempo de isquemia quente foi de 14,32 ± 3,14 minutos, e tempo de isquemia fria foi de 58,51 ± 18.06 minutos. Três grupos de transplante ortotópico de pulmão foram estudados: isoenxerto: C57BL / 6 → C57BL / 6, aloenxerto: C57BL/10 → C57BL / 6 e C57BL / 6 → C57BL/10. Utilizou-se apenas ratinhos macho mas a nossa técnica pode ser também aplicado a ratinhos fêmea, porque não há diferença significativa entre os sexos anatómica.

A classificação da rejeição patologia foi conduzido de forma cega, utilizando critérios padronizados para transplante de pulmão clínica 7 (Tabela 1). Considerando observamos rejeição leve ou nenhuma isoenxerto (C57BL / 6 → C57BL / 6), ambas as combinações aloenxerto desenvolvido comparejeição aguda ou crónica comparável (Figura 1). Em contraste, OB foi significativamente mais freqüente no C57BL/10 → C57BL / 6 do que C57BL / 6 → grupo C57BL/10 por day28 (Tabela 1).

C57BL / 6 →
C57BL / 6
C57BL/10 →
C57BL / 6
C57BL / 6 →
C57BL/10
P-valor
Rejeição de Patologia
"A" Scores no dia 28
0,67 ± 0,89 * 3,33 ± 0,82 * 3,29 ± 0,76 * P> 0,05
OB / mice total no dia 21 e 28 0/24 (0%) ** 14/34 (42,1%) ** 2/16 (12,5%) ** P <0,05

Tabela 1. Escores histológicos de rejeição aguda e prevalência de bronquiolite obliterante pós transplante. A pontuação de rejeição aguda ("A" Scores) por padrão critérios como descrito nos resultados representativos. Os dados representam a média ± SD de "a" Scores nos dias pós-transplante 28. Os dados representam a quantidade ea percentagem de ratinhos em cada grupo que desenvolveu OB no dia 21 e 28 após a transplantação.

A Figura 1
Figura 1. Achados macroscópicos e histopatológicos em 28 dias após o transplante de pulmão. Painel 1A representam achados macroscópicos e H & E pulmão isoenxerto manchado e pulmão direito ingênuo. Painel 1B e 1C representa H & E e enxerto de Masson pulmão Trichrome manchado BL/10 transplantadas para BL / 6 destinatário mouse, que desenvolveu OB OB e não, respectivamente. A seta branca 1B identifica lesões de OB. 1D Painel mostra BL / 6 enxerto de pulmão transplantado para BL/10 destinatário mouse.

Resolução de problemas durante o processo principal foram os seguintes.

  1. Distúrbio do fluxo sanguíneo: pulmão doador de embutir, atéa cor torna-se na cor branca. A utilização de excesso de pressão poderia induzir edema pulmonar. Mas não empurrar demais para evitar o edema após o transplante.
  2. Dificuldade de inserção braçadeira para o doador: Determinar que a vasculatura é de comprimento suficiente e livre de gordura e tecidos anexas conjuntivo.
  3. Hemorragia no local da anastomose: Use Q dicas para aplicar pressão no local afetado para aproximadamente 5 minutos.
  4. Destinatário PA obstrução do fluxo sangüíneo: Principalmente causada pela torção do punho durante a inserção. Se o ar é observada dentro do PA, em seguida, voltar a fazer da anastomose é necessário.
  5. Anastomose PV difícil: Membrana de PV é muito fina e facilmente lágrimas. Selecione o tamanho do manguito adequado e insira direto para o PV do destinatário muito delicadamente.
  6. Destinatário PV obstrução do fluxo sangüíneo: Certifique-se a posição ea direção do manguito. Solte a compressão do manguito brônquica.
  7. Pneumotórax: Isto pode ser causado por uma perfuração brônquica, devido à manipulation da via aérea, ou perfuração da superfície pulmonar devido a trauma associado com o procedimento do transplante. O anterior é tratado com o fechamento cirúrgico do buraco dentro da parede das vias aéreas, e este último é tratado por luva o vazamento sobre a superfície pulmonar, utilizando 10-0 sutura de nylon.

Discussion

Transplante de pulmão em camundongos ortotópico é um desafio devido às exigências de microcirurgia e extrema fragilidade dos tecidos. Introdução da técnica de manguito tem permitido o uso generalizado do transplante pulmonar ortotópico em ratos 8. Isto tornou-se a base para o desenvolvimento do modelo ortotópico de pulmão transplante em ratinhos no nosso laboratório. Em ratinhos e ratos, ao contrário dos humanos, o pulmão esquerdo contém apenas um lobo e faz-se apenas 25% da massa total do pulmão. Isto faz com que a esquerda de um único transplante de pulmão viável no modelo murino sem a necessidade de um sistema de suporte circulatório.

Nossas cirurgias preliminares revelaram que a ventilação e perfusão do pulmão transplantado era altamente dependente do tamanho do PV anastomose. Específico PV tamanho do manguito anastomose foram utilizados para combinar com doadores e destinatários conforme relatado 9. Inadequado do manguito dimensionamento resultou em qualquer atelectasia do pulmão transplantado ou deiscência da anast PVomosis. Okazaki et al relataram o uso da ligadura dos vasos combinado e recorte o 5 brônquio. No estudo atual, usamos um clipe de aneurisma para todas as estruturas hilares, que sugerimos pode encurtar o tempo de isquemia quente. Uma limitação do transplante ortotópico de pulmão esquerdo no modelo murino é que os animais receptores podem sobreviver após aloimune mediada necrose dos seus aloenxertos 5. Portanto, estudos de sobrevivência não são viáveis ​​e avaliação do enxerto depende de exame histológico do pulmão transplantado 10.

Usando esta técnica, temos desenvolvido um modelo pré-clínico bronquiolite obliterante em camundongos. Especificamente, o rato dador é C57BL/10 eo receptor é C57BL / 6. Isto sugere que o papel de menor, e não principais antigénios, de histocompatibilidade na patogénese bronquiolite obliterante 6. Além disso, têm relatado neutralização da IL-17 impede bronquiolite obliterante no modelo murino. Este modol representa uma ferramenta de pesquisa inovadora para o exame do transplante de pulmão e do avanço de transplantes clínicos.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Fontes de financiamento: Este trabalho apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde subsídios HL067177 e HL096845 e P01AI084853 a DSW

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Opmi 6SFC-1880 Prescott’s Inc PMZ014
Harvard Rodent Ventilator Harvard Apparatus 55-7058
20-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100510D
22-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 081015S
24-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100522A
9/0 Meth Blue Virgin Silk Ashaway Line Twine Mfg. CO MBVS-90
10-0 Alcon Surgical Suture Alcon Laboratories, Inc 8065-192101
Black Braided Silk 5-0/18inches Henry Schein M652630
Heparin Sodium 1000 units/ml APP Pharmaceuticals 407156
Betadine Solution Purdue Product 67618-150
Lactated Ringer's injection Hospira NDC 0409-7953-03
C57BL/10 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor
C57BL/6 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor or recipient

Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment.

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References

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Cite this Article

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).More

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

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