Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ortotopik Akciğer Transplantasyonu bir Mürin Modelinde Obliteratif Bronşiolit Gelişimi

doi: 10.3791/3947 Published: July 10, 2012

Summary

Obliteratif bronşiolit akciğer transplantasyonu uzun süreli yaşam için anahtar engel ve sağlam bir preklinik model eksikliği obliteratif bronşiolit immünopatogenezi inceleyerek engellemektedir. Diğer solid organ nakli aksine, vaskülarize fare akciğer transplantasyonu vardır ancak son zamanlarda geliştirilmiştir. Burada fare ortotopik tek-akciğer transplantasyonu sonrası bağımsız geliştirilen obliteratif bronşiolit modeli gösterilmektedir.

Abstract

Sıçanlarda ortotopik akciğer nakli ilki 1971 1 Asimacopoulos ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir. Şu anda, bu yöntem iyi kabul ve allo-reddedilme çalışma için değil, aynı zamanda akciğer transplantasyonu sonrası iskemi-reperfüzyon hasarının mekanizmaları incelemek için singeneik suşlar arasında sadece standartlaştırılmıştır. Sıçan ve diğer büyük bir hayvan modeli 2 uygulanması bu çalışmaların aydınlatılması önemli ölçüde katkıda rağmen, bu araştırmaların kapsamı eleme ve transjenik farelerin azlığı ile sınırlıdır. Obliteratif bronşiolit, akciğer nakli hastalarında önde gelen ölüm nedeni için etkili tedaviler nedeniyle, obliteratif bronşiolit çoğaltmak klinik öncesi modeller için yoğun araştırmalar olmuştur. Trakeal allogreft modeli en yaygın olarak kullanılan ve obliteratif bronşiolit 3 histopatolojik bazı özellikleri çoğaltabilir olduğunu. Bununla birlikte, bozulmamış bir vasculat eksikliğiAlıcının kenliği ve obliteratif bronşiolit eksik patolojik özelliklerine hiçbir bağlantısı ile ure bu model 4 programını sınırlamak. Diğer katı organ nakli aksine, vaskülarize fare akciğer nakli sadece son 2007 5 yılında ilk kez Okazaki ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir. Sıçan akciğer nakli temel ilkelerini uygulamak, laboratuar obliteratif bronşiolit immünopatogenezi 6 ileri çalışma izin küçük histoincompatible antijen murin ortotopik tek-sol akciğer nakli kullanarak obliteratif bronşiolit modeli başlattı.

Protocol

1. Donör Prosedürü

  1. Tüm cerrahi prosedürleri steril tekniği kullanılarak yapıldı. Hiçbir antibiyotik donör ve alıcı fareler hem de verilmiştir.
  2. Donör farenin anestezi indüksiyonu% 5 İsofluranın başlatılır.
  3. Fare tarafından orotrakeal 20 gauge intravenöz kateter ile entübe ve ardından 125 solunum / dakika ve yaklaşık 0.5 ml tidal volüm (Vücut ağırlığının% 2) oranında% 100 oksijen kullanarak, bir kemirgen ventilatör yerleştirilir.
  4. Anestezi inhale% 1-2 izofluran ile korunur.
  5. Donör fare yatar pozisyonda yerleştirilir,% 70 alkol ile prepped.
  6. Laparosternotomy kombine bir orta hat ve enine kesi olarak gerçekleştirilir.
  7. 100 u / kg Heparin sadece karaciğer alttan, inferior vena kava (IVC) enjekte edilir.
  8. Diyafram omurganıza doğru ventral kostal eki boyunca kesilir ve göğüs boşluğu göğüs her iki kesim tarafından gösterilenboyun duvar.
  9. Diyafram düzeyinde IVK insizyon sonra, sağ atriyal apendiks soğutmalı 2 ml kesilerek akciğerler temizlendi (4 ° C) pulmoner arter kökünde (bir transvers insizyon ile Ringer enjeksiyonu ve heparin 0,1 ml PA) gövde.
  10. Endtidal enflasyonun üçte ikisi de havalandırma tutuklanmasının, kalp-akciğer bloğu çıkarıldı ve buz (4 ° C) saklanır.
  11. Donör sol akciğer kolluklar eki tarafından alıcı için hazırlanmıştır. Pulmoner ligament Pulmoner Ven (PV) kadar insize edilir. Hilusu yemek borusu ve aort kaldırarak getirilir.
  12. Hilumun en-boy kafa bulunan PA, yanı sıra, ekteki ana bronş (Br) tanımlar. Bronş gelen PA dikkatlice incelemek.
  13. PA kaf 24-gauge intravenöz (IV) kateter yapılan ve 0.7 mm bir uzantısı olan uzunluğu 0.5 mm kesilir.
  14. Manşetin tüm yüzeyine daha sonra anastomoz kolaylaştırmak için Aşınmışilave sütürlerle.
  15. Bronş için kaf 20-gauge IV kateter türetilen ve 0.7 mm bir uzantısı olan 1.0 mm uzunluğunda kesilir.
  16. Aynı materyaller kullanılarak, PV manşon donör fare ağırlığı ile değişir. Özellikle, fareler için manşon büyüklüğü 24-27 gram 22 ayar, bir 0.7 mm uzantılı uzunluğu 0.7 mm. 27-32 gram ağırlığındaki fareler için, çalışmaları, 0.7 mm uzunluğunda uzantısı ile 0,7 mm olan bir 20-gauge kateter kullanılmıştır.
  17. Kolluklar PA, PV ve Br distal uçlarında içine yerleştirilir ve 9-0 sütür ile sabitlenir.
  18. Donör akciğer boşaltıldı ve depolama önce steril heparin ile steril salin ile yıkanır. Donör akciğer sonra akciğer çok temiz ve steril tutar buz üzerinde steril serum fizyolojik ile ıslatılmış steril gazlı bez (4 ° C) ile sarılır.
  19. A mikrodamar kelepçe hava yolu içine Ringer giriş önlemek için bronş üzerine yerleştirilir.

2. Alıcı Prosedürü

  1. Anestezi indüksiyonuYukarıda donör için tarif edildiği gibi thesia ve mekanik havalandırma aynıdır.
  2. Sol göğüs duvarı traş ve% 70 alkol ve cerrahi alan bol dökümlü bir ile prepped edilir.
  3. Bir torakotomi insizyonu omurga dorsale yakın kesi ve kalp bitişik sol akciğer damarları ve bronşları üzerine yerleştirilen bir mikrovasküler klemp uzanan, sol üçüncü interkostal yapılır. Sen PV aralarında hilusun ve Br kaudal sonunda, kranial yönü de PA görebilirsiniz.
  4. Merkezi hiler yapılara kenetlenmiş bırakırken PA, Br ve PV hafif gerginlik neden hemostat nazik traksiyon kullanarak, sol akciğer göğüs boşluğundan dışarı çekilir.
  5. PA, PV ve Br PA, PV ve Br etrafında gevşek yerleştirilmiş 9-0 sütür koyarak takip künt diseksiyon ile izole edilir.
  6. Onun adventisyal kılıf, geminin çevresi yaklaşık dörtte biri küçük bir insizyonla tamamen PA diseksiyon sonra isearterin dorsal kısmının devamı zedelemeden, ön duvarı haline getirilmiştir.
  7. Soğuk, Ringer-batırılmış pamuk gazlı bez sarılmış ve yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan donör akciğer, sonra göğüs boşluğuna yerleştirilmiş ve manşetler alıcı PA, PV ve Br içine yerleştirilir ve 9-0 dikiş ile sabitlenir.
  8. Hiler kros klemp reperfüzyon ve havalandırma için izin kaldırılır.
  9. Alıcının toraks içine geri nakledilen akciğer yerleştirdikten sonra torakotomi insizyonu 5-0 dikiş kullanılarak kapatıldı.
  10. Fare anestezi kurtarmak için izin verilir. Buprenorfin (0,05-0,15 mg / kg) cerrahi hemen sonra tatbik edilebilir ve 2-3 gün ameliyat sonrası için her 8 saat boyunca edilir.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Deneyimlerimiz bunu tekrar uygulama birkaç ay fare akciğer nakli modeli yeterliliğine gerektirdiğini öğretti. Yeterliliği elde edildikten sonra, birölümlerin operasyon yedi gün sonrası içinde meydana gelen bir% 96 (96/100 ardışık ameliyatları) perioperatif sağkalım oranı chieved. İki ölüm intraoperatif başladı kanama nedeniyle idi ve pneumothraces diğer iki farelerde ölüm nedeni idi. Tüm işlemler için, sıcak iskemi süresi ± 3.14 dakika 14.32 idi ve soğuk iskemi zamanı 58,51 ± 18.06 dakika idi. Üç ortotopik akciğer transplantasyonu grupları incelendi: isograft: 6 / C57BL → C57BL / 6, allogreft: C57BL/10 → C57BL / 6 ve C57BL / 6 → C57BL/10. Sadece erkek fareler kullanılmaktadır ancak cinsler arasında anlamlı bir fark vardır anatomik çünkü bizim teknik aynı zamanda, dişi fareler için uygulanabilir.

Ret patoloji Sınıflandırma klinik akciğer nakli 7 (Tablo 1) için standart kriterler kullanarak bir kör olarak yapıldı. Bu isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6) hafif veya hiç rejeksiyonu gözlenen ise, hem allogreft bileşimleri geliştirilmiştir compaBunun yanısıra daimi akut ya da kronik rejeksiyon (Şekil 1). Buna karşılık, OB C57BL/10 anlamlı olarak daha sık idi day28 (Tablo 1) C57BL / 6 → C57BL/10 grubuna göre → C57BL / 6.

C57BL / 6 →
C57BL / 6
C57BL/10 →
C57BL / 6
C57BL / 6 →
C57BL/10
P-değeri
Reddetme Patoloji
28. günde de "A" Skorlar
0.67 ± 0.89 * 3.33 ± 0.82 * 3.29 ± 0.76 * P> 0.05
OB / gün 21 ve 28. Toplam fareler 0/24 (0%) ** 14/34 (% 42.1) ** 2/16 (% 12.5) ** P <0.05

Tablo 1. Rejeksiyon ve obliteratif bronşiolit sonrası nakli sıklığı histolojik skorları. Standart cri tarafından rejeksiyon skoru ("A" Skorlar)Teria olarak temsili sonuçları açıklanmıştır. Veri gün 28 transplantasyon sonrası "A" skorları ortalama ± SD temsil eder. Veri gün 21 ve 28 sonrası nakli azından OB geliştirilmiş her grupta farelerin miktar ve oranını temsil etmektedir.

Şekil 1
Şekil 1. 28 gün sonrası akciğer nakli de makroskopik bulgular ve histopatoloji. Panel 1A makroskobik bulgular ve H & E boyalı Isograft akciğer ve sağ akciğer naif temsil eder. Panel 1B ve 1C H & E ve sırasıyla, OB ve olmayan OB geliştirilen BL / 6 fare alıcı, nakledilen Masson Trikrom lekeli BL/10 akciğer allogreft temsil eder. 1B beyaz ok OB lezyonları tanımlar. Panel 1D BL/10 fare alıcıya nakledilmektedir BL / 6 akciğer allogreft gösterir.

İşlem sırasında ana sorun çekim şöyleydi.

  1. Kan akımı bozukluğu: Bol donör akciğer kadarrenk beyaz olur. Aşırı basınç kullanımı pulmoner ödem neden olabilir. Ama nakil sonrası ödem önlemek için çok fazla zorlamayın.
  2. Donör içine manşet ekleme Zorluk: damarsal yeterli uzunlukta ve bağlı yağ ve bağ dokusu ücretsiz olduğunu emin olunmalıdır.
  3. Anastomoz yerinde kanama: yaklaşık 5 dakika boyunca etkilenen yerinde baskı uygulamak için Q ipuçlarını kullanın.
  4. Alıcı PA kan akımının tıkanması: Temelde manşet yerleştirme sırasında torsiyonu kaynaklanır. Hava PA içinde görülürse anastomoz gerekli olduğunu daha sonra yeniden yapmak.
  5. Zor PV anastomoz: PV Membran çok ince ve kolayca gözyaşlarıdır. Uygun manşet boyutunu seçin ve çok yavaşça alıcının PV doğrudan takın.
  6. Alıcı PV kan akımının tıkanması: manşetin yerini ve yönünü emin olun. Bronşiyal kaf gelen sıkıştırma bırakın.
  7. Pnömotoraks: Bu manipulatio nedeniyle ya bronş perforasyonu neden olabilirhava yolu veya nakil işlemi ile ilişkili travma nedeniyle akciğer yüzeyinin delinmesi n. Eski hava yolu duvarındaki deliğin cerrahi olarak kapatılması ile tedavi edilir; ve ikincisi 10-0 naylon dikiş kullanılarak akciğer yüzeyinde kaçak sutüre ile tedavi edilir.

Discussion

Farelerde ortotopik akciğer nakli mikrocerrahi talep ve dokuların aşırı kırılganlık nedeniyle zordur. Manşet tekniğinin tanıtılması sıçanlarda 8 ortotopik akciğer naklinin yaygın kullanımı için izin verdi. Bu laboratuarımızda farelerde ortotopik akciğer nakli modelinin geliştirilmesi için temel oldu. Farelerde ve sıçanlarda, insanlarda farklı olarak, sol akciğer tek lob içeren ve solunum toplam kütlesinin sadece% 25 kadar kılar. Bu, sol-tek akciğer nakli, bir dolaşım destek sistemi için gerek kalmadan mürin modelinde mümkün kılar.

Bizim ön ameliyatları nakledilen akciğer ventilasyon ve perfüzyon PV anastomoz boyutu son derece bağlı olduğunu ortaya çıkardı. Özgül PV anastomoz manşon büyüklüğü donör maç için kullanılan ve alıcıları olarak 9 bildirildi. Sakıncalı manşet boyutlandırma PV anast Nakledilen akciğer veya ayrışma ya atelektazi sonuçlandıomosis. Okazaki ark kombine damar ligasyonu kullanımı rapor ve bronş 5 kırpma. Bu çalışmada biz sıcak iskemi süresi kısalabilir öneririz tüm hiler yapılar için anevrizma klibi, kullanın. Fare modelinde ortotopik sol akciğer nakli bir kısıtlaması alıcı hayvanlar allogreftler 5 Alloimmun aracılı nekroz sonra hayatta olmasıdır. Bu nedenle, yaşam çalışmaları mümkün değildir ve greft değerlendirmesi nakledilen akciğer 10 histolojik bağlıdır.

Bu tekniği kullanarak, farelerde bir preklinik obliteratif bronşiolit modeli geliştirdik. Spesifik olarak, fare donör C57BL/10 ve alıcı C57BL / 6 'dir. Bu küçük rolü değil, obliteratif bronşiolit patogenezinde 6 büyük, doku uygunluk antijenleri göstermektedir. Ayrıca, IL-17 fare modelinde obliteratif bronşiolit önler nötralize bildirdin. Bu modl akciğer transplantasyonu klinik muayene ve akciğer nakli ilerlemesi için yeni bir araştırma aracı temsil eder.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Finansman Kaynakları: Sağlık hibe HL067177, HL096845 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen olarak bu çalışma ve DSW için P01AI084853

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Opmi 6SFC-1880 Prescott’s Inc PMZ014
Harvard Rodent Ventilator Harvard Apparatus 55-7058
20-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100510D
22-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 081015S
24-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100522A
9/0 Meth Blue Virgin Silk Ashaway Line Twine Mfg. CO MBVS-90
10-0 Alcon Surgical Suture Alcon Laboratories, Inc 8065-192101
Black Braided Silk 5-0/18inches Henry Schein M652630
Heparin Sodium 1000 units/ml APP Pharmaceuticals 407156
Betadine Solution Purdue Product 67618-150
Lactated Ringer's injection Hospira NDC 0409-7953-03
C57BL/10 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor
C57BL/6 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor or recipient

Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
  2. Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
  3. McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
  4. Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
  5. Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
  6. Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
  7. Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
  8. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
  9. Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
  10. Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (2010).
Ortotopik Akciğer Transplantasyonu bir Mürin Modelinde Obliteratif Bronşiolit Gelişimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).More

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter