Summary
この資料では、疎水性修飾ナフィオン酵素固定化膜方法と膜内のタンパク質および/または酵素を固定化とその特異的活性をテストするを合成するための手順を説明します。
Abstract
過去10年間、生体触媒、バイオセンサー、バイオ燃料細胞を含む固定し、安定した酵素を、アプリケーションの豊富がありました。最もbioelectrochemicalアプリケーションでは1-3、酵素や細胞小器官は、いくつかのタイプのを利用して電極表面に固定化されているポリマーマトリックス。このポリマー足場は、酵素の安定性を維持し、マトリックスの内と外の分子やイオンの容易な拡散を可能にする必要があります。彼らは水素原子またはイオン結合を介して酵素をカプセル化し、安定させることが酵素の自然環境を模倣ポリマー - 固定化のこのタイプに使用されるほとんどのポリマーは、ポリアミンまたはポリアルコールに基づいています。別の安定化酵素の方法酵素をカプセル化し、安定させることができる疎水性領域を含むミセルの使用を含む。特に、4,5、Minteerグループは、市販のナフィオンに基づくミセルポリマーを開発しました。6,7ナフィオン自体は、陽子や他の小さな陽イオンチャネルアシスト拡散することができミセル重合体であるが、ミセルとのチャネルは非常に小さいとポリマーが酵素固定化のために不利であるスルホン酸側鎖のために非常に酸性である。しかしながら、ナフィオンはそのような臭化テトラブチルアンモニウム（TBAB）のような疎水性のアルキルアンモニウム塩の過剰と混合されたときに、第四級アンモニウムカチオンは、プロトンを交換し、ポリマーの側鎖（ 図1）スルホン酸基のカウンターイオンとなる。このようなニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）などの酵素機能するために必要な大型基板とイオンの拡散を可能にするポリマー内でより大きなミセルとチャネルでこの結果。この変更されたナフィオンポリマーは、バイオセンサーやバイオ燃料のセルで使用するために、さまざまな酵素の種類と同様にミトコンドリアを固定するために使用されています。8月12日本論文では、このマイクを行うための新たな手順を説明します酵素を安定させることができるellarポリマーの酵素固定化膜。ミセルの酵素固定化膜の合成、膜内に酵素を固定化するための手順、及び固定化酵素の酵素比活性を研究するためのアッセイは、以下に詳述されています。
Protocol
1。第四級アンモニウム塩とナフィオンの変更
- 約のために精力的に5パーセントw / vのナフィオン懸濁液のボトルを振ります。ナフィオン溶液中で均一にサスペンドされていることを保証するために30秒。
- ガラスバイアル（バイアル量は2.5 mLから10 mLに含まれている可能性があり）になりました再懸濁したナフィオン2 mLのピペットを。
- アルキルアンモニウム臭化物塩の3倍モル過剰（ナフィオンポリマーにスルホン酸基からの相対パス）（適切な質量を表1に示す）を測定し、ナフィオンの2 mLを含むバイアルにこれを追加します。
- 渦10〜15分間1500rpmでバイアル。
- 約を測定するプラスチック製秤量トレイに粘性溶液を注ぐ。 3インチ×3、計量トレイにバイアルからの残液を転送するためにピペットを使用しています。
- 溶剤計量トレイの底部（Fiの黄色/茶色、透明フィルムを残して、重船外に蒸発することができますグレ2）。溶媒の蒸発速度は、それが蒸発するすべての溶媒に6時間以上がかかるようにすべきである。溶媒が蒸発が速すぎる場合は、白、無愛想な材料は、ポリマーのミセル構造が破壊されたことを示す透明フィルムの代わりに形成され、このプロシージャを再起動する必要があります。溶媒の蒸発が遅すぎる場合は、蒸発の速度が遅すぎる典型的に粘着性の、オレンジ色のゲルにつながるとは、プロシージャを再起動する必要がありますので、デ加湿器は、必要があるかもしれません。 37℃ - 溶媒蒸発のための典型的な温度範囲は20です。乾燥の実際の条件は、部屋の相対湿度と温度の関数であるが、それはゲル形成を可能にするためにミセル構造を維持するために、低速ではなく、人間が遅すぎて乾燥することが重要です。
- 18MΩcmで脱イオン水（水の10〜20 mL）で船の重量を量る記入し、カバーし、過剰なアルキルアンモニウム臭化物塩およびHBrを削除するには、12〜24時間浸漬することができます。
- ポリマーは、この時点で完全に乾燥するまで明らかに座って秤量トレイを許可する、ポリマーは、はっきりとやや脆いプラスチックフィルムでなければなりません。空気が非常に湿度が高い場合は、再度、デ加湿器は、適時に蒸発を完了する必要があるかもしれません。
- へらを使用して、慎重に計量トレイから乾燥したフィルムを除去してクリーンなガラスバイアルにそれを転送します。
- エタノール2 mLの3セラミックの混合ビーズ、4時間またはポリマーフィルムが完全に再懸濁されるまでボルテックスする。
2。活性アッセイのためにTBAB-Modifiedのナフィオンに酵素の固定化
- 乾燥した酵素を、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに酵素1-10ミリグラムを量る、1〜10 mg / mLの酵素液を作成するには、100mMのpH7のリン酸緩衝液1 mLを加える。フォーrは溶液中にある酵素は、タンパク質の量を決定するためにビシンコニン酸（BCA）アッセイ13を使用して、1から10 mg / mlにタンパク質濃度をもたらすために、100mMのリン酸緩衝液の適切な量を追加します。 1から10 mg / mLのは、通常、1から50ナノモル/ mLに相当します。
- 1 mg / mLの酵素溶液120μLに、アルキルアンモニウム修飾ナフィオン溶液と、10秒間ボルテックスを60μLを追加します。 （この混合物を複製し、多数のためにスケールアップすることができます。2:1に酵素·ツー·ポリマー溶液の比率を保持します。）
- ピペット60 3別の1cm 2のキュベットの底に酵素/ポリマー溶液のμL、一晩乾燥させます。
3。固定化NAD-依存性脱水素酵素のアッセイ
- キュベットに、50mMのピロリン酸ナトリウム液（pH 8.8）1.3 mLを、15mMのNAD（新たに調製）、0.1 mLの水1.5 mLを加える。
- UV / VIS分光光度計（すなわちThermoScientific Evolutにキュベットを配置イオン260バイオ·サーモジェネシスSpectronic 20）340 nmの波長に設定されています。
- 分光計をゼロにし、0.1mLのエタノールを加える。穏やかに5回ダウンソリューションをピペッティングにより試薬を混ぜる。空白の場合は、追加の水0.1 mLの代わりにエタノール0.1 mLを使用しています。
- 試薬をキュベットに添加し、20分後にされた後5分で340 nmの吸光度を記録します。アクティビティの計算に使用することができるスロープを得るために2つのデータポイントをプロットします。
4。固定PQQ依存性脱水素酵素のアッセイ
- キュベットに、リン酸ナトリウム1.5mLの液（pH7.3）、600μMPMSの200μLを追加します。
- 600nmの波長に設定UV / VIS分光光度計で、キュベットを配置し、分光計をゼロに。
- 700μLDCIPの100μLと関心のある基板（エタノール、アセトアルデヒド、グリセロール、グルコース、またはグリセルアルデヒド）の200μLを追加し、優しくsolutをピペッティングにより試薬を混ぜてイオン上下に5回。空白の場合は、200μLの水の代わりに、興味のある基板を使用しています。
- 試薬をキュベットに添加し、20分後にした5分後に600 nmの吸光度を記録します。
5。固定化グルコースオキシダーゼのアッセイ
- キュベットに、0.2 M のp-ヒドロキシ安息香酸、0.02％（w / v）のアジ化ナトリウム、128 Uペルオキシダーゼ、0.3mMの4 -アミノアンチピリン、1 Mリン酸カリウム、50 mMグルコースを含む溶液の2.0 mLを加える。 5回上下にピペッティングして溶液を混合。
- 510 nmの波長に設定UV / VIS分光光度計ではキュベットを配置します。
- 試薬は20分後に再びキュベットに添加した後5分で、510nmで吸光度を記録します。
6。代表的な結果
変更されたナフィオンポリマーのミセル構造は、オリジナルの塩/ポリマーの共キャストフィルムもFasを乾燥させることにより破壊することができるトン。 図2は、正しく、透明淡褐色膜に生じる乾燥させた塩/ポリマー混合物を示しています。乾燥が速すぎて乾燥プロセスはミセル構造を破壊することができるという事実のためにポリマーの不透明な、白色のフレークにつながることができるフィルム。
変更されたナフィオンポリマーと酵素を混合し、キュベットの底面に共存キャストされた後、酵素活性アッセイは、ポリマー膜内の酵素の安定性を評価するために使用することができます。 テーブルは、2つのデヒドロゲナーゼ酵素の2-4はアッセイの結果とグルコースオキシダーゼは、それぞれ、さまざまな変更されたナフィオン膜に固定化した。変更されたナフィオンポリマーが実際に特定の酵素（superactivityと呼ばれる）の活性を高めることができることを示す、緩衝液中の酵素対固定されている酵素の活性が高いことに注意してください。他の酵素は、ポリマーにそれらを固定するときに、その特定の活性を低下させる輸送の制限があります（その基板）非常に大きい巨大分子である、すなわちセルラーゼおよびアミラーゼ、。
| 使用される第四級アンモニウム塩 | 3倍過剰 |
| T3A（テトラブロミド） | 32.37 mg / mlの |
| TBAB（テトラブチルアンモニウムブロマイド） | 39.19 mg / mlの |
| TPAB（テトラペンチブロマイド） | 46.01 mg / mlの |
| TEHA（triethylhexylammoniumブロマイド） | 32.37 mg / mlの |
| TMHA（trimethylhexylammoniumブロマイド） | 27.25 mg / mlの |
| TMOA（trimethyloctylammoniumブロマイド） | 30.66 mg / mlの |
| TMDA（trimethyldecylammoniumブロマイド） | 34.07 mg / mlの |
| TMDDA（trimethyldodecylammoniumブロマイド） | 37.48 mg / mlの |
| TMTDA（trimethyltetradecylammoniumブロマイド） | |
| TMHDA（trimethylhexadecylammoniumブロマイド） | 44.31 mg / mlの |
| TMODA（trimethyloctadecylammoniumブロマイド） | 47.71 mg / mlの |
表1。ナフィオンポリマー改質に使用するテトラアルキルアンモニウム塩の量。
| ナフィオンのタイプ | 酵素活性（U / g）を |
| バッファ（NOポリマー） | 16.63±8.11 |
| ナフィオン（un-mod.） | 9.25±2.21 |
| TMTDA | 3.23±2.92 |
| TBAB | 3.93±3.33 |
| TMDDA | 4.19±1.04 |
| TMOA | 3.51±1.11 |
| TMDA | 8.00±4.53 |
| TMHA | 1.68±1.39 |
| TMHDA | 4.83±0.99 |
| TMODA | 10.45±3.20 |
表2選択され変更されたナフィオンポリマー（注：固定化活性は酵素の初期比活性の関数である）に固定化したNAD依存性グルコース脱水素酵素活性。
| ナフィオンのタイプ | 酵素活性（MU / g）を |
| バッファ（NOポリマー） | 7.18±0.51 |
| ナフィオン（un-mod.） | 70.1±0.5 |
| TMTDA | 133±6 |
| TBAB | 244±4 |
| TMDDA | 221±6 |
| TMOA | 1.78±0.63 |
| TMDA | 206±5 |
| TEHA | 40.1±50.6 |
| TMHDA | 0 |
| TMODA | 1.45±0.06 |
表3 PQQ依存性グルコース脱水素酵素活性は、（注：固定化活性は酵素の初期比活性の関数である）を選択して変更されたナフィオンポリマーに固定化した。
| ナフィオンのタイプ | 酵素活性（U / g）を | ||
| バッファ（NOポリマー） | 103.61±3.15 | ||
| ナフィオン（un-mod.） | 19.93±10.10 | ||
| TMTDA | 247.25±12.49 | ||
| TBAB | 152.27±5.29 | ||
| TMDDA | 262.05±6.26 | ||
| TMOA | 129.18±2.31 | TMDA | 141.23±1.97 |
| TMHA | 131.75±2.89 | ||
| TMHDA | 132.50±1.18 | ||
| TMODA | 136.50±0.96 |
表4代表的なグルコースオキシダーゼ比活性は、選択され変更されたナフィオンポリマー（：固定化活性が酵素の初期比活性の関数であり、注意してください）に固定することができる。
図1ナフィオンポリマーと酵素の固定化のその後の使用にTBABの取り込みの模式図。
図2ナフィオンとTBABの最初の共同キャストフィルムの光学写真。遅乾収量boを覆う透明な、ライトブラウンフィルム秤量トレイのttom。
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Discussion
記載されている手順では、テトラアルキルアンモニウム塩は酵素を固定化と安定化するために使用することができミセルポリマーを作成するために商業的なナフィオンを変更するために使用されています。アッセイは、ポリマーは活性の高い保持と酵素の多種多様を固定するために使用することができる手順番組で説明しています。興味のある酵素が非常に低い活性を有する、または不純であれば、より高い濃度が必要になることがありますおよび10 mg / mL以上の濃度の酵素を固定化しない限り、固定化のプロセスに影響を与えるべきではありません。手続きの簡素化は合成の手順は（このようなポリマー合成や架橋など）を必要としないされているという点で、他の酵素固定化技術からそれを分離します。また、これらの合成の手順では、頻繁にタンパク質を変性または劇的に活性を低下させる。 1mg/mLのタンパク質濃度は、単に高い酵素ローディングのための提案された濃度である。低い酵素濃度は、常に用いることができる、しかし、以下の体積触媒活性になります。理論的には、高い酵素濃度は限り酵素は溶解として使用することができます。
ポリマーは、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等の低級脂肪族アルコールに可溶であるため、酵素とポリマー懸濁液を混合するとき、アルコールの割合が高いが存在しなければなりません。多くの場合、これは酵素でカプセル化されたフィルムがキャストされた後、エタノールが適時に蒸発されている限り問題ではありません。酵素はすべてのアルコール耐性と変性ではないか、または変更されたナフィオン懸濁液の添加により沈殿ただし、この固定化のいずれかの制限が発生する可能性があります。まれなケースでは、酵素が変更されたナフィオン懸濁液と混合沈殿物または変性は、通常、酵素は変性になっていると機能しないことを示します。アルコール/水混合物中でポリマーを再懸濁することにより懸濁液中のアルコール含有量を減少させることが可能です。しかし、低級脂肪族アルコールは、懸濁液中で有意な濃度（> 25％）で必要とされるので、この固定化技術は、アルコールのこれらの濃度を許容できない酵素/酵素液では動作しません。
3つの酵素のそれぞれを有するポリマーのそれぞれの酵素アッセイは、溶液中の酵素に比べて相対的な比活性の傾向は、酵素システムの機能であることを示している。酵素のそれぞれは、異なるサイズ、異なるPI、別の至適pHと同様に、PQQ依存性グルコース脱水素酵素は膜結合タンパク質であり、したがって、非常に異なる化学物質の微小その細胞質タンパク質を必要としているという事実であるので、これは、期待されています。したがって、疎水性修飾ナフィオンミセルは、バッファよりアクティブPQQ依存性グルコース脱水素酵素を安定化するための多くの膜のような環境を提供し、固定化酵素はまれであるsuperactivityを示しています。 A考慮すべきnother問題は、ポリマー膜は大きな分子の輸送が減少し、グルコース（ここに示されているすべての3つのテスト用の基板）が小さいですが、補酵素NADはNAD-依存脱水素酵素の膜のうちで、拡散する必要があり、これが減少することです。酵素活性を観察した。全体的には、サイズの違い、電荷、至適pH、酵素システムの各基板/補因子の輸送のために、それぞれの酵素に必要な正確なポリマーを最適化する必要があることに注意する必要があります。
固定化酵素アッセイ以外に、この酵素固定化法で検討されている主なアプリケーションは、酵素のバイオセンサーやバイオ燃料電池の製造である。カプセル化された酸化還元酵素を含む変更されたナフィオンポリマーが電極表面にキャストされている場合、bioelectrocatalyticプロセスは電流RESPを生成し、適切な基質や補因子の存在下で発生する可能性がありますオンセ。導入で説明したように変更されたナフィオンを用いて製造さBioanodesは、バイオ燃料エタノールを利用して細胞を、メタノール、ピルビン酸、グリセロールで使用されています。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、米海軍研究、米国大豆ボード、および資金調達のために国立科学財団の事務所を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a | |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 | |
| Vortex Genie | |||
| Analytical balance |
References
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