Summary
Este artigo vai descrever o procedimento para a síntese de uma membrana Nafion hidrofobicamente modificado imobilização de enzimas e como para imobilizar proteínas e / ou enzimas no interior da membrana e testar a sua actividade específica.
Abstract
Durante a última década, tem havido uma riqueza de aplicação para as enzimas imobilizadas e estabilizadas incluindo biocatálise, biossensores, e células de biocombustível. 1-3 Em aplicações mais bioelectrochemical, enzimas ou organelas são imobilizados sobre uma superfície do eléctrodo com a utilização de algum tipo de polímero de matriz. Este andaime polímero deve manter as enzimas estável e permitir a difusão fácil de moléculas e iões dentro e para fora da matriz. A maioria dos polímeros utilizados para este tipo de imobilização são baseados em poliaminas ou poliálcoois - polímeros que imitam o ambiente natural das enzimas que eles encapsular e estabilizar a enzima através de hidrogénio ou ligações iónicas. Outro método para a estabilização de enzimas envolve o uso de micelas, que contêm regiões hidrofóbicas que podem encapsular e estabilizar as enzimas 4,5. Em particular, o grupo Minteer desenvolveu um polímero baseado em micelar Nafion comercialmente disponível. 6,7 Nafionem si é um polímero micelar que permite a difusão de canal-assistida de protões e de outros catiões pequenas, mas as micelas e os canais são extremamente pequeno e que o polímero é muito ácida, devido às cadeias sulfónicos lado ácido, o que é desfavorável para a imobilização de enzimas. No entanto, quando Nafion é misturado com um excesso de hidrofóbicos sais de amónio de alquilo tais como brometo de tetrabutilamónio (TBAB), os catiões de amónio quaternário substituir os protões e tornar-se os contra-iões para os grupos sulfonato sobre as cadeias laterais de polímero (Figura 1). Isto resulta em maiores micelas e canais dentro do polímero que permitem a difusão de grandes substratos e iões que são necessários para a função enzimática, tais como dinucleótido adenina nicotinamida (NAD). Este modificado Nafion polímero tem sido usado para imobilizar muitos tipos diferentes de enzimas, bem como as mitocôndrias para uso em biossensores e células de biocombustível. 8-12 Este documento descreve um novo processo para fazer este microfoneEllar polímero membrana imobilização de enzimas que podem estabilizar as enzimas. A síntese da membrana micelar enzima imobilização, o procedimento para a imobilização de enzimas dentro da membrana, e os ensaios para estudar a actividade enzimática específica da enzima imobilizada são detalhados abaixo.
Protocol
1. Modificação do Nafion com sais de amónio quaternário
- Agitar uma garrafa de suspensão Nafion 5% w / v vigorosamente durante aprox. 30 segundos para assegurar que Nafion é suspenso uniformemente na solução.
- Pipetar fora 2 mL da Nafion agora re-suspenso em um frasco de vidro (volume frasco pode conter de 2,5 mL a 10 mL).
- Medir um excesso de 3 vezes molar (em relação aos grupos de ácido sulfónico no polímero Nafion) do sal de amónio de alquilo brometo de (massas adequadas são mostrados na Tabela 1) e adicionar este ao frasco contendo o 2 mL de Nafion.
- Vortex do frasco a 1500 rpm por 10-15 minutos.
- Despeje a solução viscosa em uma bandeja de plástico pesando que mede aprox. 3 x 3 polegadas, e usar uma pipeta para transferir qualquer solução residual a partir do frasco para a bandeja de pesagem.
- Permitir que os solventes para evaporar para fora do barco pesar, deixando um amarelo / castanho película transparente, sobre a parte inferior da bandeja de pesagem (Figura 2). A taxa de evaporação de solvente deve ser tal que é necessário mais do que 6 horas para todo o solvente se evapore. Se o solvente evapora muito rápido, um material branco duro vai formar, em vez de um filme transparente, indicando que a estrutura micelar do polímero foi destruído, e você deve re-iniciar o procedimento. Se a evaporação de solventes, é muito lento, um de-umidificador pode ser necessário, porque muito lento de evaporação normalmente leva a um gel, brega laranja e você deve re-iniciar o procedimento. Gamas de temperatura típicas para a evaporação do solvente são de 20 - 37 ° C. As condições reais de secagem são uma função da humidade relativa e à temperatura da sala, mas é importante que a secagem ser lento para manter a estrutura micelar, mas não demasiado lenta para permitir a formação do gel.
- Encher o barco com pesar 18M Ωcm água deionizada (10-20 mL de água), tampe e deixe de molho por 12-24 horas para remover o excesso de sais de amônio alquílicos de brometo e HBr.
- Permitir que a bandeja de pesagem para sentar descoberto até que o polímero é completamente seca Neste ponto, o polímero deve ser uma película transparente e um pouco quebradiço plástico. Novamente, se o ar é muito húmido, um de-humidificador pode ser necessário para completar a evaporação de uma forma atempada.
- Usando uma espátula, cuidadosamente remover o filme seco a partir da bandeja de pesagem e transferi-lo para um frasco de vidro limpo.
- Adicionar 2 mL de etanol e 3 cerâmicos grânulos de mistura, e vórtice durante 4 horas ou até que a película de polímero é completamente re-suspenso.
2. Imobilização de enzimas em TBAB-Modified Nafion para ensaios de atividade
- Para uma enzima seca, pesam-se 1-10 mg da enzima em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e adicionar 1 mL de tampão de fosfato 100 mM pH 7 para criar um 1-10 mg / mL de solução enzimática. For uma enzima que está em solução, usar um ácido bicinconínico (BCA) ensaio de 13 para determinar a quantidade de proteína, e adicionar uma quantidade apropriada de tampão fosfato 100 mM para trazer a concentração de proteína para 1-10 mg / mL. ML mg / 1-10 geralmente corresponde a 1-50 nanomoles / mL.
- Para 120 uL de 1 mg / mL solução de enzima, adicionar 60 uL da solução de Nafion alquilo-amónio modificada, e vórtice durante 10 segundos. (Esta mistura pode ser aumentado para um grande número de repetições. Mantenha a razão de solução de enzima a-polímero em 2:1.)
- Pipetar 60 da solução de enzima / polímero para o fundo de 3 separadas 1 cm 2 cuvetes, e permitir que a secar durante a noite.
3. Ensaio da enzima desidrogenase NAD-dependente Imobilizado
- Para a cuvete, adicionar 1,3 mL de 50 mM de pirofosfato de sódio (pH 8,8), 1,5 mL de 15 mM NAD (recentemente preparado), e 0,1 mL de água.
- Coloque a cuvete num espectrofotómetro UV / Vis (Evolut ThermoScientific ieion 260 Bio e Thermo Spectronic Genesys 20) ajustado para um comprimento de onda de 340 nm.
- Zerar o espectrômetro, e depois adicionar 0,1 ml de etanol. Misturar os reagentes suavemente pipetando a solução cima e para baixo 5 vezes. Para um espaço em branco, usar 0,1 mL de água adicional, em vez do 0,1 mL de etanol.
- Ler a absorvância a 340 nm a 5 minutos após os reagentes foram adicionados à cuvete e 20 minutos depois. Traçar os dois pontos de dados para obter uma inclinação que pode ser usado para os cálculos da actividade.
4. Ensaio de Imobilizados PQQ-dependentes Desidrogenases
- Para a cuvete, adicionar 1,5 mL de fosfato de sódio (pH 7,3) e 200 uL de 600 PMS uM.
- Coloque a cuvete num espectrofotómetro UV / Vis definido para um comprimento de onda de 600 nm e, em seguida, zero, o espectrómetro.
- Adicionar 100 uL de 700 uL DCIP e 200 uL do substrato de interesse (etanol, acetaldeído, glicerol, glucose, gliceraldeído ou), e misturar os reagentes suavemente pipetando a solutião cima e para baixo 5 vezes. Para um espaço em branco, usar 200 uL de água em vez do substrato de interesse.
- Ler a absorvância a 600 nm a 5 minutos após os reagentes foram adicionados à cuvete e 20 minutos depois.
5. Ensaio de glucose oxidase imobilizada
- Para a cuvete, adicionar 2,0 mL de uma solução contendo 0,2 M de ácido p-hidroxibenzóico, azida de sódio 0,02% (w / v), 128 U de peroxidase, 0,3 mM de 4-aminoantipirina, 1 M de fosfato de potássio, e 50 mM de glucose. Misturar a solução pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
- Coloque a cuvete de um conjunto espectrofotómetro UV / Vis para um comprimento de onda de 510 nm.
- Ler a absorvância a 510 nm a 5 minutos após os reagentes foram adicionados à cuvete e, novamente, em 20 minutos depois.
6. Os resultados representativos
A estrutura micelar do polímero Nafion modificada pode ser interrompido por secagem do sal original / polímero co-fundido filme muito fast A Figura 2 mostra uma mistura de sal / polímero que tenha sido seca correctamente resultando em um filme transparente castanho, luz. Um filme que seca muito rápido pode resultar em opacos, flocos brancos de polímero devido ao facto de o processo de secagem pode destruir a estrutura micelar.
Uma vez que o Nafion modificado polímero e enzima foram misturados e co-moldada sobre o fundo de uma cuvete, ensaios de actividade enzimática pode ser usado para avaliar a estabilidade da enzima dentro do filme de polímero. Tabelas 2-4 mostram os resultados do ensaio de duas enzimas desidrogenase e glicose oxidase imobilizada em vários filmes de Nafion modificados, respectivamente. Note-se a maior actividade das enzimas que são imobilizadas vs as enzimas em solução tampão, mostrando que os polímeros Nafion modificadas podem efectivamente aumentar a actividade de certas enzimas (chamado superactivity). Outras enzimas têm limitações de transporte que diminuem a sua actividade específica quando imobilizá-los no polímero (celulases e amilases ou seja, cujos substratos são macromoléculas bastante grandes).
| Sal de amônio quaternário usado | 3 vezes superior |
| T3A (brometo de tetrapropilamónio) | 32,37 mg / ml |
| TBAB (brometo de tetrabutilamónio) | 39,19 mg / ml |
| TPAB (brometo de tetrapentylammonium) | 46,01 mg / ml |
| TEHA (brometo de triethylhexylammonium) | 32,37 mg / ml |
| AHMT (brometo de trimethylhexylammonium) | 27,25 mg / ml |
| TMOA (brometo de trimethyloctylammonium) | 30,66 mg / ml |
| TMDA (brometo de trimethyldecylammonium) | 34,07 mg / ml |
| TMDDA (brometo de trimethyldodecylammonium) | 37,48 mg / ml |
| TMTDA (brometo de trimethyltetradecylammonium) | |
| TMHDA (brometo de trimethylhexadecylammonium) | 44,31 mg / ml |
| TMODA (brometo de trimethyloctadecylammonium) | 47,71 mg / ml |
Tabela 1. Quantidades de sais de tetra-alquil amónio a utilizar para Nafion modificação de polímeros.
| Tipo de Nafion | A actividade enzimática (U / g) |
| Tampão (sem polímero) | 16,63 ± 8,11 |
| Nafion (un-mod.) | 9,25 ± 2,21 |
| TMTDA | 3,23 ± 2,92 |
| TBAB | 3,93 ± 3,33 |
| TMDDA | 4,19 ± 1,04 |
| TMOA | 3,51 ± 1,11 |
| TMDA | 8,00 ± 4,53 |
| AHMT | 1,68 ± 1,39 |
| TMHDA | 4,83 ± 0,99 |
| TMODA | 10,45 ± 3,20 |
Tabela 2 NAD-dependente actividade de desidrogenase de glucose imobilizada em seleccionados polímeros modificados Nafion (nota: actividade imobilizada é uma função da actividade específica inicial da enzima)..
| Tipo de Nafion | A actividade enzimática (mU / g) |
| Tampão (sem polímero) | 7,18 ± 0,51 |
| Nafion (un-mod.) | 70,1 ± 0,5 |
| TMTDA | 133 ± 6 |
| TBAB | 244 ± 4 |
| TMDDA | 221 ± 6 |
| TMOA | 1,78 ± 0,63 |
| TMDA | 206 ±5 |
| TEHA | 40,1 ± 50,6 |
| TMHDA | 0 |
| TMODA | 1,45 ± 0,06 |
Tabela 3 PQQ-dependente actividade de desidrogenase de glucose imobilizada em seleccionados polímeros modificados Nafion (nota: actividade imobilizada é uma função da actividade específica inicial da enzima)..
| Tipo de Nafion | A actividade enzimática (U / g) | ||
| Tampão (sem polímero) | 103,61 ± 3,15 | ||
| Nafion (un-mod.) | 19,93 ± 10,10 | ||
| TMTDA | 247,25 ± 12,49 | ||
| TBAB | 152,27 ± 5,29 | ||
| TMDDA | 262,05 ± 6,26 | ||
| TMOA | 129,18 ± 2,31 | TMDA | 141,23 ± 1,97 |
| AHMT | 131,75 ± 2,89 | ||
| TMHDA | 132,50 ± 1,18 | ||
| TMODA | 136,50 ± 0,96 |
. Tabela 4 representativas actividade de oxidase de glicose específica imobilizado na seleccionados polímeros modificados Nafion (nota: actividade imobilizada é uma função da actividade específica inicial da enzima).
Figura 1. Esquemática da incorporação TBAB em Nafion polímero e subsequente utilização na imobilização de enzimas.
Figura 2. Fotografia óptica de um primeiro co-cast filmes de Nafion e TBAB. Retardar a secagem produz um transparente, filme castanho claro cobrindo o bottom da bandeja de pesagem.
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Discussion
No processo descrito, os sais de tetra-alquil amónio são utilizados para modificar Nafion comercial para criar polímeros micelares que podem ser usados para imobilizar e estabilizar as enzimas. Os ensaios descritos no procedimento revelam que o polímero pode ser usado para imobilizar uma grande variedade de enzimas com uma elevada retenção de actividade. Se a enzima de interesse tem uma actividade muito baixa ou é impuro, uma concentração mais elevada pode ser necessária e não deve afectar o processo de imobilização, a menos que a imobilização de enzimas, em concentrações superiores a 10 mg / ml. A simplicidade do processo separa-lo a partir de técnicas de imobilização de enzimas outros em que não etapas sintéticas (tais como polímero de síntese ou cross-linking) são necessários. Além disso, estes passos sintéticos freqüentemente desnaturar proteínas ou diminuir drasticamente a sua actividade. A concentração de proteína de 1mg/mL é meramente uma concentração sugerida para carregamento enzima elevada. As concentrações mais baixas de enzima pode sempre ser empregues,mas irá resultar em menor actividade volumétrica catalítico. Em teoria, as concentrações mais elevadas de enzimas pode ser usado, desde que a enzima se dissolve.
Porque os polímeros são solúveis em álcoois alifáticos inferiores tais como metanol, etanol e propanol, uma elevada percentagem de álcool deve estar presente quando a mistura do polímero com uma suspensão de enzima. Em muitos casos, este não é um problema, desde que o etanol é evaporado de uma forma atempada uma vez que a película enzima encapsulada é moldado. No entanto, uma limitação do presente imobilização pode ocorrer se uma enzima não é de todo o álcool-tolerantes e desnatura ou precipitados mediante a adição da suspensão de Nafion modificado. Em casos raros, enzimas será precipitado ou desnaturar quando misturado com a suspensão de Nafion modificada, normalmente, indicando que a enzima se tornou desnaturado e não funcionará. É possível para diminuir o teor de álcool na suspensão por ressuspensão dos polímeros em álcool / água misturas, Mas álcoois alifáticos inferiores são necessários em concentrações significativas (> 25%) na solução de ressuspensão, de modo esta técnica de imobilização não funciona para as enzimas / soluções enzimáticas que não podem tolerar estas concentrações de álcool.
Os ensaios enzimáticos para cada um dos polímeros com cada uma das três enzimas mostram que as tendências da actividade específica relativa em comparação com enzima em solução é uma função do sistema de enzima. Isto é esperado, uma vez que cada uma das enzimas é de um tamanho diferente, pI diferente, pH óptimo diferente, bem como o facto de que PQQ-dependente desidrogenase de glucose é uma proteína de membrana associada e, portanto, necessita de um microambiente química muito diferente que as proteínas citosólicas. Portanto, o Nafion hidrofobicamente modificado micelar dá uma membrana mais procura-ambiental para a estabilização da glucose desidrogenase activa PQQ-dependente do que o buffer e mostra superactivity, que é raro em enzimas imobilizadas. Another questão a considerar é a de que as membranas de polímero diminuir o transporte de moléculas grandes e, embora de glicose (o substrato para todos os três testes aqui mostradas) é pequena, a NAD coenzima necessita de se difundir para dentro e para fora da membrana para NAD-dependentes desidrogenases e este diminui a observada atividade enzimática. No geral, é importante notar que o polímero exacta necessária para cada enzima tem que ser optimizado, por causa das diferenças na carga, tamanho, pH óptimo, e transporte de substrato / cofactores para cada um dos sistemas enzimáticos.
Outros ensaios de enzima imobilizada, a aplicação principal que tem sido explorada com o presente método de imobilização de enzimas é a fabricação de biossensores enzimáticos e células de biocombustível. Quando os polímeros Nafion modificado contendo encapsulados enzimas redox são expressos em superfícies de eléctrodos, os processos bioelectrocatalytic pode ocorrer na presença de substratos adequados e os cofactores, produzindo uma corrente eléctrica respOnse. Bioanodes fabricados com Nafion modificada têm sido utilizados em células de biocombustível que utilizam etanol, metanol, piruvato e de glicerol, tal como descrito na introdução.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem o Escritório de Pesquisa Naval, United Soybean Board, e Fundação Nacional de Ciência para o financiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a | |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 | |
| Vortex Genie | |||
| Analytical balance |
References
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