Summary
संक्रमण संस्कृतियों फीडर मुक्त शर्तों के लिए चल रहे प्रयासों के बावजूद, और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) की व्युत्पत्ति संस्कृति माउस भ्रूणीय भक्षण (MEFs) के साथ सह संस्कृतियों पर काफी हद तक निर्भर रहते हैं. यहाँ, हम तेजी से hESC संस्कृतियों से भक्षण प्रयोग करने से पहले हटाने के लिए एक उपन्यास पद्धति दिखाते हैं.
Abstract
माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) ब्लास्टोसिस्ट 1 अलगाव के बाद मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) संस्कृतियों की स्थापना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. यह फीडर प्रणाली सेल विस्तार के दौरान सहज भेदभाव के दौर से गुजर से hESCs रखता है. हालांकि, इस पद्धति सह संस्कृति श्रम गहन है, उच्च प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता है, और पैदावार कम hESC 4 पवित्रता. कई प्रयोगशालाओं hESC संस्कृतियों में फीडर कोशिकाओं की संख्या (यानी मैट्रिक्स लेपित व्यंजन या अन्य फीडर सेल 5-8 प्रकार शामिल) को कम करने का प्रयास किया है. इन संशोधित संस्कृति प्रणालियों कुछ वादा दिखाया है, लेकिन mitomycin सी का इलाज माउस embyronic fibroblasts के साथ संवर्धन hESCs क्रम में hESC संस्कृतियों के अवांछित सहज भेदभाव मंदबुद्धि के लिए मानक विधि supplanted नहीं. इसलिए, फीडर hESC विस्तार में इस्तेमाल किया कोशिकाओं भेदभाव प्रयोगों के दौरान हटाया जाना चाहिए. हालांकि कई तकनीकों hESC सह सफ़ाई के लिए उपलब्ध हैंभक्षण से lonies (FACS, एमएसीएस, या दवा प्रतिरोधी वैक्टर का उपयोग), इन तकनीकों श्रम गहन, महंगा है और / या hESC के लिए विनाशकारी हैं. इस परियोजना का उद्देश्य शोधन का एक तरीका है कि hESCs के एक purer जनसंख्या की कटाई के लिए सक्षम बनाता है आविष्कार किया गया था. हमने देखा है कि एक सहधारा hESC संस्कृति में MEF जनसंख्या MEF पत्रक के एक सरल और तेजी से आकांक्षा का उपयोग कर हटाया जा सकता है. इस हटाने MEFs के पार्श्व बंधन सेल करने वाली कोशिका है, कि एक कम styrene संस्कृति डिश के लिए बाध्य संबंध है और स्टेम सेल कालोनियों की क्षमता के लिए अपनी खुद की पीढ़ी के दौरान जावक fibroblasts धक्का सहित कई कारकों पर निर्भर करता है. " "आला. hESC तो Oct3 SSEA-4, 4 / और Tra 1-81 अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई MEF हटाने के बाद 10 दिनों के लिए pluripotency के रखरखाव सुनिश्चित करने के. इसके अलावा, hESC कालोनियों MEF हटाने के बाद बड़े संरचनाओं में से बढ़ रही है, hESC विस्तार का एक अतिरिक्त स्तर प्रदान जारी रखने के लिए सक्षम थे.
Protocol
1. माउस भ्रूणीय भक्षण की तैयारी
- HESCs के सह संस्कृति में इस्तेमाल MEFs पहले विकिरण या mitomycin सी विभाजन के दौर से गुजर से कोशिकाओं को बाधित द्वारा इलाज किया जाना चाहिए.
- MEF बोने से पहले दो घंटे, कोट प्रत्येक 60 मिमी प्लाज्मा 0.05% जिलेटिन की 2 मिलीलीटर के साथ संस्कृति डिश इलाज.
- इलाज MEFs की एक शीशी और ~ 20,000 कोशिकाओं / 2 सेमी में थाली पिघलना के.
- कोशिकाओं रातोंरात पालन करने के लिए अनुमति दें.
2. MEFs पर सह बोने hESCs
- नई कालोनियों नए MEF लेपित व्यंजन पर cryopreserved संस्कृतियों या passaging वर्तमान संस्कृतियों से शुरू किया जा सकता है नीचे के रूप में.
- बड़े hESC गर्म 1x पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ 1 समय passaged इन कालोनियों युक्त थाली धो लें.
- Collagenase चतुर्थ / पीबीएस समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) की 3 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 में 5-10 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस (नोट: कोशिकाओं अलग या गेंद ऊपर trypsin साथ देखा नहीं हो जाएगा).
- जब कोशिकाओं में अभी भी कर रहे हैंकोलैजिनेज, 5 मिलीग्राम pipet टिप के एक किनारे का उपयोग करें, कालोनियों पर एक ग्रिड पैटर्न बनाने के लिए, उन्हें छोटे सेल clumps में तोड़.
- Pipet टिप (संस्कृति की थाली के लिए एक सीधा तरीके से आयोजित) के अंत का उपयोग करने के लिए संस्कृति की थाली के नीचे परिमार्जन, सतह से सभी कोशिकाओं dislodging.
- एक बाज़ ट्यूब और स्पिन में (1000 आरपीएम) में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा.
- Centrifugation के बाद, मध्यम aspirate, बाज़ ट्यूब में सेल गोली छोड़ने.
- MEFs मढ़वाया पहले दिन से MEF मध्यम Aspirate.
- पुन प्लेट मूल की थाली से 01:03 अनुपात में कोशिकाओं और hESC माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ फ़ीड
3. सह - संस्कृति से MEFs क्षयकारी
नोट: मानव ESC संस्कृतियों उच्च घनत्व संस्कृति के 10 और 14 दिनों के बीच आम तौर पर किया जाना चाहिए.
- थाली के किनारे पर एक aspirating pipet टिप प्लेस और चूषण धीरे MEF चादर के किनारे खींच देते हैं.
- आरपकवान से मीडिया emove, और टिप सेल शीट को पकड़ने के लिए और धीरे धीरे प्लेट के ऊपर एक arced तरीके में टिप को स्थानांतरित करने की अनुमति है. नोट: चादर pipet की नोक में रोकना हो सकता है, लेकिन इस समस्या के रूप में यह स्वयं संस्कृति की थाली की सतह से चादर खींच से उपयोगकर्ता को रोकने के लिए नहीं चाहिए नहीं है. यदि कोशिकाओं वातशोषक के अंत में फंस रहे हैं, आप संस्कृति डिश के ऊपर का उपयोग करने के लिए पूरा आकांक्षा के लिए सेल चादर तोड़ सकते हैं.
- HESC मध्यम तुरंत बदलें, और थाली इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया.
4. प्रतिनिधि परिणाम
MEF हटाने की प्रक्रिया के अंत परिणाम (चित्रा 1D) छोटे undisturbed hESC कालोनियों बहुत बड़ी कालोनियों (2 चित्रा) में महत्वपूर्ण विस्तार से गुजरना जबकि pluripotency SSEA-4 निर्माताओं की अभिव्यक्ति को बनाए रखने में सक्षम है, अक्टूबर ¾, और 1-81 Tra (चित्रा ) 3.
चित्रा 1. ESC कालोनी morphology पहले और बाद में MEF निकालना संस्कृति व्यंजन पर बोने के बाद मानव भ्रूण स्टेम सेल कालोनियों) 1 दिन और बी) 2 दिन में. सी) उच्च घनत्व मानव भ्रूण स्टेम सेल कालोनियों (H7) MEFs से घिरा हुआ है. दो hESC कालोनियों लाल डैश में रेखांकित कर रहे हैं डी MEF आकांक्षा वर्णित तकनीक का उपयोग कर हटाने के बाद), हम बहुत कुछ MEFs के साथ एक अलग hESC कॉलोनी बरकरार कॉलोनी के आसपास के साथ छोड़ दिया जाता है.
चित्रा 2. ESC MEF हटाने के बाद 10 दिनों कॉलोनी विस्तार. MEF रिक्तीकरण के तुरंत बाद मूल hESC कॉलोनी (बाएं) (दाएं) एक बहुत बड़ी कॉलोनी appro में विस्तार करने की अनुमति दी हैximately 800 सुक्ष्ममापी, 10x. ध्यान दें कि मूल कॉलोनी समग्र कॉलोनी के रूप में एक ही बढ़ाई (10x) में imaged है.
चित्रा 3. MEF समाप्त hESC कालोनियों के कालोनियों के Immunofluorescent पहचान immunostaining MEF रिक्तीकरण के बाद 10 दिनों के लिए पता चलता है कि कालोनियों अक्टूबर ¾, SSEA-4 अपनी स्पष्ट रूप pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति है, और धुंधला हो Tra-1-81 को बनाए रखने. इसके अलावा, इन कालोनियों hESC भेदभाव एक mesodermal भाग्य की ओर प्रदर्शन नहीं करते हैं, FLK-1 के अभाव से संकेत ए, ई, मैं, और एम) संचरण immunoflouscently दाग कालोनियों, 20, 10, 10, और 2x प्रकाश छवियों हैं, क्रमशः बी, एफ, जम्मू, और एन) नाभिक दिखाने immunofluorescently दाग कालोनियों, 20, 10, 10, और 2x, क्रमशः सीडी) के DAPI दाग कोशिकाओं की अभिव्यक्ति दिखानेमानव स्टेम सेल मार्कर ही SSEA-4, और समग्र छवि, 20x GH) मानव स्टेम सेल मार्कर अक्टूबर की अभिव्यक्ति दिखाने ¾ केवल, और समग्र छवि, 10x. के.एल.) 1-81 केवल मानव स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति Tra दिखाने , और समग्र छवि, 10x. सांसद) अंतिम पंक्ति अगर चित्र एक ठेठ चिकनी इस बढ़ाई, 2x, और इन कालोनियों में देखा सीमाओं चित्रित कॉलोनी को दर्शाती है और न ही हे एक्सप्रेस) FLK-1, mesoderm भेदभाव का एक प्रारंभिक मार्कर, नहीं किया था पी वे) किसी भी fibroblasts होते रूप में DDR2 धुंधला हो जाना के अभाव दिखाया.
पूरक वीडियो. शीट आकांक्षा द्वारा Fibroblasts हटाना. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि मानव भ्रूण कोशिका संस्कृतियों से fibroblast फीडर कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए एक तेजी से और कम महंगा विकल्प प्रदान करता है. fibroblasts के सफल हटाने इन कोशिकाओं है कि अब स्टेम सेल संस्कृतियों में विकसित की एक कसकर सहधारा monolayer के अस्तित्व पर निर्भर है. 7-10 दिनों के बाद एक जावक दिशा में बढ़ रही है, hESC कालोनियों फीडर fibroblasts धक्का, कालोनियों के बीच एक तेजी से सघन fibroblast monolayer पैदा होगा. fibroblast monolayer भीतर मजबूत सेल करने वाली सेल संलग्नक अपने एक सेल शीट के रूप में तेजी से हटाने की अनुमति देते हैं. यह सावधानी से ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस शोधन तकनीक MEF hESC से हटाने की एक विधि के रूप में प्रयोग ही नहीं, और नियमित विस्तार संस्कृति के लिए उपयोग करने से पहले उपयोग के लिए सुझाव दिया है.
यह भी संभव है इस शोधन तकनीक का उपयोग करने के लिए गरीब गुणवत्ता स्टेम सेल कालोनियों बचाव. एक उच्च गुणवत्ता hESC कॉलोनी disti एक्ज़िबिट चाहिएखुद को और फीडर कोशिकाओं के बीच राष्ट्रीय राजधानी क्षेत्र सीमाओं. अगर, हालांकि, स्टेम सेल कालोनियों आंशिक भेदभाव आया है, कम अच्छी तरह से परिभाषित कॉलोनी सीमाओं, तो इस विधि को भी MEF सेल की चादर के साथ आंशिक रूप से विभेदित hESC कालोनियों को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, hESC कालोनियों के भौतिक जुदाई का प्रदर्शन एक pipet टिप अवांछित विभेदित कोशिकाओं या MEF के साथ किसी भी hESC कनेक्शन को अलग करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक नई संकाय पुरस्कार द्वितीय द्वारा पुनर्योजी चिकित्सा के कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (RN2 - ००९२१ 1), और एक NIH पोषित राष्ट्रीय अनुसंधान पुरस्कार (F32 HL104924) से वित्त पोषित किया गया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
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