Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Hurtig Fibroblast fjernelse fra High Density humane embryonale stamceller Cultures

Published: October 28, 2012 doi: 10.3791/3951

Summary

Trods den stadige bestræbelser på at overgangen kulturer til feeder-fri betingelser, forbliver afledning og dyrkning af humane embryonale stamceller (hESC) i høj grad afhængig af co-kulturer med muse embryonale foderautomater (MEF). Her viser vi en ny metode til hurtigt at fjerne foderautomater fra hESC kulturer før eksperimenteren.

Abstract

Muse embryonale fibroblaster (MEF) blev anvendt til at etablere humane embryonale stamceller (hESCs) kulturer efter blastocyst isolering 1. Denne feeder system opretholder hESCs fra undergår spontan differentiering under celleekspansion. Men denne co-dyrkningsmetode er arbejdskrævende, kræver højt uddannet personale, og renterne lave hESC renhed 4. Mange laboratorier har forsøgt at minimere antallet af fødeceller i hESC kulturer (dvs. inkorporering matrix-coatede skåle eller andre feeder celletyper 5-8). Disse modificerede kultursystemer har vist nogle lovende, men har ikke fortrængt standard fremgangsmåde til dyrkning hESCs med mitomycin C-behandlede muse embyronic fibroblaster for at forsinke uønsket spontan differentiering af hESC kulturer. Derfor bør feeder celler anvendt i hESC ekspansion fjernes under differentiering eksperimenter. Skønt adskillige teknikker er tilgængelige til oprensning af hESC colonies (FACS, Mac, eller brug af resistente vektorer) fra foderautomater, disse teknikker er arbejdskrævende, omkostningskrævende og / eller ødelæggende for hESC. Formålet med dette projekt var at opfinde en metode til oprensning, der muliggør høst af en renere population af hESCs. Vi har observeret, at i en konfluent hESC kultur kan MEF populationen fjernes med en enkel og hurtig aspiration af MEF arket. Denne fjernelse er afhængig af flere faktorer, herunder lateral celle-til-celle-binding af MEF'er, som har en lavere bindingsaffinitet til styren dyrkningsskål, og evnen hos stammen cellekolonier at skubbe fibroblasterne udad under dannelsen af ​​deres egen " niche ". The hESC blev derefter undersøgt for SSEA-4, Oct3 / 4 og Tra 1-81 ekspression op til 10 dage efter MEF fjernelse for at sikre opretholdelse af pluripotency. Desuden hESC kolonier var i stand til at fortsætte med at vokse fra i større formationer efter MEF fjernelse, hvilket giver et ekstra niveau af hESC ekspansion.

Protocol

1. Fremstilling af muse embryonale Feeders

  1. The MEF'er anvendt i co-kultur af hESCs bør tidligere behandlet ved bestråling eller mitomycin-C at inhibere cellerne i at undergå deling.
  2. To timer før MEF såning, belægge hver 60 mm plasma behandlet dyrkningsskål med 2 ml 0,05% gelatine.
  3. Optø et hætteglas med behandlet MEF'er og plade på ~ 20.000 celler / cm 2.
  4. Tillader cellerne at adhærere natten over.

2. Co-seeding hESCS over på MEF

  1. Nye kolonier kan iværksættes fra kryopræserverede kulturer eller passage nuværende kulturer på nye MEF-belagte skåle, som beskrevet nedenfor.
  2. Vask pladen indeholdende de store hESC kolonier at blive passeret en gang med 3 ml warmed 1x PBS.
  3. Tilsæt 3 ml collagenase IV / PBS-opløsning (1 mg / ml), og der inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C. (Bemærk: Cellerne vil ikke blive adskilt eller kugle op som ses med trypsin).
  4. Mens cellerne stadig er icollagenase, anvendes en kant af en 5 ml pipettespids, skaber et gittermønster på kolonierne, bryde dem i små celleklumper.
  5. Brug enden af ​​pipettespidsen (holdt i en vinkelret måde til agarpladen) at skrabe bunden af ​​dyrkningspladen, dislodging alle cellerne fra overfladen.
  6. Opsamle cellerne i et Falcon-rør og centrifugering i (1000 rpm) i 5 min.
  7. Efter centrifugering aspireres mediet, forlader cellepelleten i Falcon-rør.
  8. Aspirer MEF medium fra MEF belagt dagen før.
  9. Re-plade cellerne i forholdet 1:3 fra den oprindelige plade, og foder med 3 ml hESC medium

3. Nedbrydende MEF'er fra Co-kultur

Bemærk: Humane ESC kulturer skal være høj densitet, sædvanligvis mellem 10 og 14 dages dyrkning.

  1. Placér spidsen af ​​en opsugning pipette på kanten af ​​pladen og tillader sugning forsigtigt trække kanten af ​​MEF arket.
  2. Remove medierne fra fadet, og lad spidsen for at fange celle ark og langsomt bevæge spidsen på en buet måde over pladen. Bemærk: Arket kan tilstoppe i spidsen af ​​pipetten, men dette er ikke problematisk, da det ikke bør forhindre brugeren i manuelt at trække arket fra overfladen af ​​dyrkningspladen. Hvis cellerne er fastgjort til enden af ​​sugeindretningen, kan man bruge toppen af ​​dyrkningsskålen at opbryde cellelaget til fuldstændig aspiration.
  3. Udskift hESC medium umiddelbart, og sætte pladen tilbage i inkubatoren.

4. Repræsentative resultater

Slutresultatet af MEF fjernelse proces producerer små uforstyrrede hESC kolonier (figur 1D), som har undergået en markant ekspansion i meget store kolonier (Figur 2), medens ekspression af pluripotency beslutningstagere SSEA-4, oktober ¾ og Tra 1-81 (figur 3).


Figur 1. ESC kolonimorfologi Før og Efter MEF Removal. Humane embryonale stamceller kolonier på A) dag 1 og B) dag 2 efter podning på dyrkningsskåle. C) High Density Humane embryonale stamceller kolonier (H7) omgivet af MEF. De to hESC kolonier er skitseret i røde streger. D) Efter MEF fjernelse ved hjælp af aspiration beskrevne teknik, står vi tilbage med en isoleret hESC koloni med meget få MEF omgiver den intakte koloni.

Figur 2
Figur 2. ESC Colony Expansion 10 dage efter MEF Removal. Den oprindelige hESC koloni umiddelbart efter MEF depletion (venstre) tillades at ekspandere til en meget stor koloni (højre) hensigtsximately 800 um, 10x. Bemærk, at den oprindelige koloni afbildes med samme forstørrelse (10x) som det sammensatte koloni.

Figur 3
Figur 3. Immunfarvning af MEF-udtømte hESC kolonier. Immunfluorescens identifikation af kolonier op til 10 dage efter MEF depletion viser, at kolonier bevarer deres ekspression af pluripotency markører som tydeligt ved oktober ¾, SSEA-4 og Tra-1-81 farvning. Hertil kommer, at disse hESC kolonier ikke udviser differentiering mod en mesodermal skæbne, angivet ved fravær af Flk-1. A, E, I og M) er transmission lyse billeder af de immunoflouscently farvede kolonier, 20, 10, 10 og 2x, . henholdsvis B, F, J og N) viser kernerne -. DAPI farvede celler af de immunofluorescently farvede kolonier, 20, 10, 10 og 2x henholdsvis CD) viser ekspressionen afmenneskelige stamceller markør SSEA-4 alene, og sammensat billede, 20x. GH) viser ekspressionen af humane stamceller markør oktober ¾ udelukkende, og sammensat billede, 10x. KL) viser ekspressionen af humane stamceller markør Tra 1-81 kun , og sammensat billede, 10x. MP) Den sidste række, hvis billederne viser en koloni portrættere de typiske glatte grænser ses på denne forstørrelse, 2x, og disse kolonier ikke udtrykkelig O) Flk-1, en ​​tidlig markør for mesoderm differentiering, og heller ikke de P) indeholder fibroblaster som vist ved fravær af DDR2 farvning.

Supplerende Video. Fjernelse Fibroblaster ved Sheet Aspiration. Klik her for at se film .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremgangsmåden præsenteres i dette manuskript tilbyder en hurtig og mindre kostbart alternativ til at fjerne fibroblast-feeder-celler fra humane embryoniske cellekulturer. Den vellykkede fjernelse af fibroblaster er afhængig af tilstedeværelsen af ​​en tæt konfluent monolag af disse celler, der udvikler sig i længere stamcellekulturer. Efter 7-10 dage vil de voksende hESC kolonier skubbe feeder fibroblaster i en udadgående retning, genererer en stadig tæt fibroblast monolag mellem kolonier. De stærke celle-til-celle vedhæftede inden for fibroblast monolaget tillader en hurtig fjernelse som en cellelaget. Det bør omhyggeligt bemærkes, at denne oprensningsteknik foreslås til anvendelse som en fremgangsmåde til MEF fjernelse fra hESC før eksperimenteren alene, og ikke anvendes til rutinemæssig ekspansion kultur.

Det er også muligt at udnytte denne oprensningsteknik at redde dårlig kvalitet stamceller kolonier. En høj kvalitet hESC koloni bør udvise distiNCT grænser mellem sig selv og feeder-celler. Hvis den derimod har stamceller kolonier undergået partiel differentiering, udviser mindre veldefinerede koloni grænser, så er denne fremgangsmåde kan også anvendes til at fjerne de delvist differentierede hESC kolonier sammen med MEF cellelaget, imidlertid fysisk adskillelse af hESC kolonier med en pipettespids kan være nødvendigt at adskille eventuelle hESC forbindelser med de uønskede forskellige celler eller MEF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af et nyt fakultet Award II fra California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00.921-1), og en NIH-finansieret National Research Award (F32-HL104924)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DDR2 Santa Curz 7555 Fibroblast Marker
Dapi Calbiochem 268298 Cell Nucleus Marker
SSEA-4 Millipore MAB4304 Human ESC Marker
Oct 3/4 Santa Cruz 9081 Human ESC Marker
Flk-1 BD Pharma 555307 Early Differentiation Marker
Tra-1-81 Acris AM20377AF4-S Human ESC Marker
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
  5. Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
  6. Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
  7. McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
  8. Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  9. Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
  10. Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.

Tags

Cellular Biology humane embryonale stamceller Cell Culture Cell Isolation Oct Cell Purification MEF Removal SSEA-4
Hurtig Fibroblast fjernelse fra High Density humane embryonale stamceller Cultures
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, W. S., McCloskey, K. E.More

Turner, W. S., McCloskey, K. E. Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures. J. Vis. Exp. (68), e3951, doi:10.3791/3951 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter