Summary
على الرغم من الجهود الجارية لثقافات الانتقال إلى شروط التغذية الحرة، والاشتقاق وثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) لا تزال تعتمد إلى حد كبير على الثقافات بالتعاون مع مغذيات الماوس الجنينية (MEFs). هنا، وتبين لنا منهجية جديدة لإزالة بسرعة من مغذيات الثقافات hESC قبل التجريب.
Abstract
واستخدمت الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) لتأسيس الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بعد عزل الثقافات الكيسة 1. هذا النظام يحافظ على وحدة التغذية من hESCs تمر التمايز عفوية خلال توسيع الخلية. ومع ذلك، هذا الأسلوب المشارك الثقافة هي كثيفة العمالة، يتطلب موظفين مدربين تدريبا عاليا، وعوائد منخفضة النقاء hESC 4. وقد حاول العديد من المختبرات لتقليل عدد الخلايا المغذية في الثقافات hESC (أي مصفوفة تتضمن الأطباق المغلفة أو غيرها من أنواع الخلايا المغذية 5-8). وقد أظهرت هذه الأنظمة ثقافة تعديل بعض الأمل، ولكن لم محل الطريقة المعيارية لزراعة hESCs مع C المعالجة الخلايا الليفية الماوس ميتوميسين embyronic من أجل إعاقة التمايز عفوية غير المرغوب فيها من الثقافات hESC. ولذلك، يجب إزالة الخلايا المغذية المستخدمة في التوسع خلال التجارب hESC التمايز. على الرغم من أن العديد من التقنيات المتوفرة لتنقية شارك hESClonies (FACS، MACS، أو استخدام ناقلات المقاوم للأدوية) من مغذيات، هذه التقنيات هي كثيفة العمالة ومكلفة و / أو المدمرة إلى hESC. كان الهدف من هذا المشروع هو ابتكار وسيلة لتنقية تمكن حصاد يبلغ عدد سكانها أكثر نقاء من hESCs. وقد لاحظنا أنه في ثقافة hESC متموجة، يمكن إزالة السكان MEF باستخدام تطلع بسيطة وسريعة من ورقة MEF. هذا يعتمد على إزالة عدة عوامل، بما في ذلك ملزم الخلية الى خلية الوحشي للMEFs التي لديها أقل تقارب ملزمة إلى الطبق الثقافة الستايرين، وقدرة المستعمرات الخلايا الجذعية لدفع الخلايا الليفية إلى الخارج خلال جيل من تلقاء نفسها " المتخصصة ". تم فحص ثم hESC لOct3، SSEA-4/4 وترا التعبير 1-81 تصل إلى 10 أيام بعد إزالة MEF لضمان الحفاظ على تعدد القدرات. وعلاوة على ذلك، كانت مستعمرات hESC قادرة على مواصلة النمو في أكبر تشكيلات من بعد إزالة MEF، وتوفير مستوى إضافي من التوسع hESC.
Protocol
1. إعداد الطاعمون الماوس الجنينية
- ينبغي MEFs المستخدمة في الثقافة المشتركة للتعامل hESCs من قبل التشعيع أو ميتوميسين C-لمنع الخلايا من الانقسام تمر.
- ساعتين قبل البذر MEF، ومعطف كل البلازما 60 مم تعامل مع الثقافة طبق 2 مل من 0.05٪ الجيلاتين.
- ذوبان الجليد قارورة من MEFs المعالجة واللوحة في الخلايا 20000 ~ / سم 2.
- السماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها.
2. شارك في بذر hESCS على MEFs
- ويمكن الشروع في مستعمرات جديدة من ثقافات cryopreserved أو الركض على الثقافات الحالية الأطباق MEF المغلفة جديدة، على النحو التالي.
- غسل لوحة تحتوي على مستعمرات كبيرة hESC أن passaged 1 مرة مع 3 مل من 1X PBS حرارة.
- أضف 3 مل من كولاجيناز IV / حل PBS (1 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 ° C. (ملاحظة: لن تصبح خلايا مميزة أو حتى ينظر إليها على أنها الكرة مع التربسين).
- في حين أن الخلايا لا تزال فيكولاجيناز، استخدم ميزة من طرف الماصة 5 مل، إنشاء نمط الشبكة على المستعمرات، وكسر لهم في كتل الخلايا الصغيرة.
- استخدام نهاية غيض الماصة (عقد بطريقة عمودية على لوحة الثقافة) لكشط الجزء السفلي من لوحة الثقافة وطرد جميع الخلايا من السطح.
- جمع الخلايا في أنبوب فالكون وتدور في (1000 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق.
- بعد الطرد المركزي، نضح المتوسطة، وترك بيليه الخلية في أنبوب فالكون.
- نضح المتوسط MEF من اليوم MEFs ومطلي من قبل.
- إعادة لوحة الخلايا في نسبة 01:03 من لوحة أصلية، والأعلاف مع 3 مل من المتوسط hESC
3. MEFs أوزون من ثقافة المشارك
ملاحظة: الإنسان الثقافات ESC يجب ان تكون على كثافة عالية، وعادة ما بين 10 و 14 يوما من الثقافة.
- وضع غيض من الماصة الشفط على حافة اللوحة والسماح للشفط لسحب بلطف حتى حافة ورقة MEF.
- R emove وسائل الإعلام من الطبق، والسماح للطرف للقبض على خلية ورقة والتحرك ببطء غيض بطريقة مقوس الظهر فوق لوحة. ملاحظة: قد تسد ورقة في غيض من الماصة، ولكن هذه ليست مشكلة لأنه يجب أن لا يمنع المستخدم من سحب ورقة يدويا من سطح لوحة الثقافة. إذا تمسك الخلايا إلى نهاية الشافطة، يمكنك استخدام الجزء العلوي من طبق الثقافة لتفريق رقة خلية لتطلع كاملة.
- استبدال المتوسطة hESC على الفور، ووضع لوحة العودة إلى الحاضنة.
4. ممثل النتائج
النتيجة النهائية لعملية الإزالة MEF تنتج الصغيرة المستعمرات دون عائق hESC (1D الشكل) قادرة على الخضوع لتوسع كبير في مستعمرات كبيرة جدا (الشكل 2) مع الحفاظ على تعدد القدرات لصانعي التعبير SSEA-4 أكتوبر ¾، وترا 1-81 (الشكل 3).
هين صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. ESC مستعمرة الصرف قبل وبعد إزالة MEF. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات يوم) 1 وB) يوم 2 بعد البذر على الأطباق الثقافة. C) عالية الكثافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المستعمرات (H7) محاطة MEFs. وترد المستعمرات hESC اثنين في شرطات الحمراء. D) بعد إزالة MEF باستخدام تقنية الشفط وصفها، نحن مع اليسار مستعمرة معزولة hESC مع عدد قليل جدا من MEFs المحيطة مستعمرة سليمة.
الشكل 2. ESC توسيع مستعمرة 10 أيام بعد إزالة MEF. المستعمرة hESC الأصلي مباشرة بعد استنفاد MEF (يسار) ويسمح للتوسع في مستعمرة كبيرة جدا (يمين) APPROximately 800 ميكرون، 10X. لاحظ أنه يتم تصوير مستعمرة الأصلي في نفس التكبير (10X)، ومستعمرة مركب.
الشكل 3. المناعية من المستعمرات hESC MEF-المنضب. تحديد مناعي من المستعمرات تصل إلى 10 يوما بعد استنفاد MEF تبين أن الحفاظ على المستعمرات التعبير عنها من علامات تعدد القدرات واضح من أول أكتوبر تشرين ¾، SSEA-4، وتلطيخ ترا-1-81. وأشارت وعلاوة على ذلك، فإن هذه المستعمرات hESC لا يحمل التمايز نحو مصير أرومية متوسطة، وذلك لعدم وجود FLK-1. A، E، I، وM) عبارة عن صور انتقال الضوء الملون من المستعمرات immunoflouscently، 20، 10، 10 و 2X، على التوالي B، F، J، وN) تظهر نواة - دابي الخلايا الملون من المستعمرات الملون immunofluorescently، 20، 10، 10 و 2X على التوالي CD) يظهر التعبير عنعلامة الإنسان الخلايا الجذعية SSEA-4 فقط، والصورة المركبة، 20X. GH) تظهر التعبير عن الإنسان الخلايا الجذعية علامة أكتوبر ¾ فقط، والصورة المركبة، KL 10X.) تظهر التعبير عن الإنسان علامة الخلية الجذعية ترا فقط 1-81 ، والصورة المركبة، 10X. MP) الصف الأخير إذا تصور هذه المشاهد تصور مستعمرة نموذجية الحدود على نحو سلس ينظر في هذا التكبير، 2X، والمستعمرات هذه لم يبد O) FLK-1، علامة مبكرة من تمايز الأديم المتوسط، كما لم انهم P) تحتوي على أي الخلايا الليفية كما يتضح من عدم وجود تلطيخ DDR2.
فيديو التكميلي. إزالة الخلايا الليفية عن طريق شفط ورقة. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب الواردة في هذا المخطوط يوفر بديلا سريعا وأقل تكلفة للقضاء على الخلايا الليفية المغذية من مزارع الخلايا الجنينية البشرية. إزالة الخلايا الليفية بنجاح يتوقف على وجود أحادي الطبقة متموجة بإحكام هذه الخلايا التي تطور الثقافات في أطول الخلايا الجذعية. بعد 7-10 أيام، سيكون المستعمرات hESC المتزايد دفع الخلايا الليفية المغذية في اتجاه الخارج، مما يولد أحادي الطبقة الليفية الكثيفة على نحو متزايد بين المستعمرات. القوي الخلية الى خلية المرفقات داخل الخلايا الليفية أحادي الطبقة تسمح زواله السريع كورقة الخلية. وينبغي بعناية أشار إلى أن يقترح هذه التقنية للاستخدام تنقية كوسيلة من وسائل إزالة MEF من hESC قبل التجريب فقط، وليس استخدامها لتوسيع الثقافة الروتينية.
ومن الممكن أيضا للاستفادة من هذه التقنية لإنقاذ الفقراء تنقية المستعمرات الخلية الجذعية الجودة. وينبغي أن يكون hESC جودة عالية مستعمرة يحمل distiNCT الحدود بينها وبين الخلايا المغذية. إذا، ومع ذلك، فقد خضعت المستعمرات تمايز الخلايا الجذعية جزئية، واظهار حدود مستعمرة أقل واضحة المعالم، ثم يمكن أيضا أن تستخدم هذا الأسلوب لإزالة المستعمرات hESC متباينة جزئيا مع خلية ورقة MEF، ومع ذلك، الفصل المادي بين المستعمرات hESC مع تلميح قد يكون من الضروري الماصة فصل أية اتصالات مع خلايا hESC متباينة غير المرغوب فيها أو MEF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كلية II جائزة جديدة من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (RN2-00921-1)، والمعاهد الوطنية للصحة التي تمولها جائزة القومي للبحوث (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
