Summary
遷移文化にフィーダーフリー条件への継続的な努力にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESCの）の導出と文化がマウス胚性フィーダー細胞（MEF）と共培養に大きく依存して残っている。ここでは、急速に、実験開始までにhESCの文化からフィーダを除去するための新規な方法を示しています。
Abstract
マウス胚線維芽細胞（MEF）は胚盤胞の分離1の後に、ヒト胚性幹細胞（hESC）文化を確立するために使用されていました。このフィーダシステムは、細胞膨張時に自発的分化を受けてからのヒトES細胞を維持しています。しかし、この共培養法は、労働集約的で高度に訓練された人材を必要とし、利回りが低いのhESC純度4。多くの研究室では、hESCの培養におけるフィーダー細胞の数（ すなわち、マトリックスコートディッシュや他のフィーダー細胞タイプ5-8を組み込む）を最小化しようとしました。これらの改変された培養系では、いくつかの約束を示しているが、hESCの文化の不要な自発的分化を遅らせるために、マイトマイシンC処理したマウスembyronic線維芽細胞とヒトES細胞を培養するための標準的な方法を取って代わられていない。したがって、hESCの拡張に使用されるフィーダー細胞は、分化実験中に除去されるべきである。いくつかの手法がhESCのCOを浄化するために利用可能であるがフィーダからlonies（FACS、MACS、または薬剤耐性ベクターの使用）は、これらの技術は、集中的な高価な、そして/またはhESCのに破壊的労働である。このプロジェクトの目的は、ヒトES細胞の純粋な人口の収穫を可能に精製する方法を考案しました。我々は、コンフルエントhESCの文化では、MEFの人口はMEFのシートの簡便かつ迅速な吸引を用いて除去することができることを観察した。この除去は、 "横細胞から細胞へのスチレン培養皿に低い結合親和性を持っているMEFの結合し、独自の生成中に線維芽細胞が外側にプッシュする幹細胞コロニーの能力など、いくつかの要因に依存していますニッチ "。 hESCの多能性は、その後の維持を確保するため、MEFを除去した後の10日に、SSEA-4、Oct3 / 4の発現およびTRA 1から81までを調べた。また、hESCのコロニーはhESCの拡張の追加レベルを提供し、MEFを除去した後に大規模な地層中への成長を続けることができました。
Protocol
1。マウス胚性フィーダーの準備
- ヒトES細胞の共培養に使用されるMEFには、以前に分裂を受けてから細胞を阻害するための放射線照射またはマイトマイシン-Cで扱われるべきである。
- MEFの播種前に二時間、コートは各60mmのプラズマは、0.05％ゼラチン2mlの培養皿を治療した。
- 〜20,000細胞/ cm 2で治療を受けたMEFとプレートのバイアルを解凍します。
- 細胞が一晩付着することができます。
2。 MEFの上に共同播種hESCの
- 新しい植民地は、以下のように、新しいMEFコートディッシュ上に凍結保存培養または継代培養から現在開始されてもよい。
- 温めておいた1×PBS 3mlで1回継代する大型のhESCコロニーを含むプレートを洗浄してください。
- コラゲナーゼIV / PBS溶液（1 mg / ml）を3 mlを添加し、37℃で5〜10分間インキュベート℃、 （注：細胞がアップトリプシンで見られるように異なるか、ボールになることはありません）。
- 細胞は、まだですがコラゲナーゼ、5 mlのピペットチップのエッジを使用して、小さな細胞塊に分割するか、コロニーのグリッドパターンを作成します。
- 表面からのすべてのセルを外れ、培養プレートの底をこすり取る際にピペットチップの先端を（培養プレートに垂直方法で保持）を使用します。
- 5分間（1000 rpm）でファルコンチューブとスピンに細胞を回収する。
- 遠心分離後、ファルコンチューブに細胞ペレットを残して、培地を吸引除去する。
- メッキされたMEFに前日からのMEF培地を吸引する。
- 再プレート原版から1:3の割合で細胞、hESCの培地3mlを持つフィード
3。共培養からMEFを枯渇させる
注：ヒトESCの培養は、通常の文化の10と14日の間で、高密度でなければなりません。
- プレートの端で吸引ピペットの先端を入れ、吸引優しくMEFのシートの端をプルアップすることができます。
- R皿からメディアを残したまま削除し、先端が細胞シートをキャッチして、徐々にプレートの上円弧形で先端を移動することができます。注：シートは、ピペットの先端に詰まらせることがありますが、それは手動で培養皿の表面からシートを引っ張ってからユーザーを防ぐべきではありませんので、これは問題ではありません。細胞はアスピレーターの最後に立ち往生している場合は、完全な吸引のための細胞シートを分割する培養皿の上部を使用することができます。
- 直ちにhESCの培地を交換し、インキュベーターにバックプレートを置く。
4。代表的な結果
MEFの除去プロセスの最終結果は、小さな平穏なhESCの多能メーカー、SSEA-4の発現を維持しながら、非常に大規模なコロニー（ 図2）に大幅な拡大を受けることができるコロニー（ 図1D）、10月¾、およびTRA 1から81（ 図を生成3）。
図1。 ESCのコロニー形態MEFの除去前と後の培養皿上に播種後）1日目とB）2日目でのヒト胚性幹細胞のコロニー。C）の高密度 MEFに囲まれたヒト胚性幹細胞のコロニー（H7）。 2 hESCのコロニーが赤くダッシュで概説されています。D）が記載され吸引法を用いてのMEFを除去した後、我々は、無傷のコロニーを取り巻く非常に少数のMEFを持つ絶縁hESCの植民地が残されています。
図2。 10日のMEF除去後ESCコロニー拡張。直ちにMEFの枯渇した後、元のhESCコロニー（左）は、非常に大きなコロニー（右）が適切に展開するために許可されているximately800μmで、10倍。元植民地が複合コロニーと同じ倍率（10倍）に結像されることに注意してください。
図3。 MEFの欠乏のhESCコロニーの免疫染色。アップコロニーの免疫同定が10日にMEFの枯渇はコロニーが10月¾、SSEA-4、TRA-1-81染色により明らかなように多能性マーカーの発現を維持することを示した後。さらに、これらのhESCコロニーはFLK-1の不在によって示されるように、中胚葉の運命に向かって分化を示さない。A、E、I、およびM）immunoflouscentlyステンドコロニーの透過光画像、20、10、10と2倍であり、それぞれA、B、F、J、およびN）の核を示す- 。免疫蛍光染色されたコロニーのDAPI染色された細胞を、20、10、10、2xを、それぞれCD）の発現を示すヒト幹細胞マーカーのみ 、SSEA-4、コンポジット映像、20倍になったGH）のみ¾ヒト幹細胞マーカー10月の発現を示し、合成画像、10倍。KL）ヒト幹細胞マーカーの発現を示すトラ1から81のみ、コンポジット映像、10倍。MP）最後の行は、イメージがこの倍率、2x、およびこれらのコロニーで見られる典型的な滑らかな境界線を描いたコロニーを描いている場合ではない急行O）Flk-1を、中胚葉分化の初期マーカー、またやったんでしたDDR2の染色の欠如によって示されるように、彼らはP）は 、任意の線維芽細胞が含まれています。
補足ビデオ。シート吸引によって線維芽細胞を削除しています。 ムービーを見るにはここをクリック 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本稿で提示した方法は、ヒト胚性細胞培養物から線維芽細胞フィーダー細胞を除去するための迅速かつ安価な代替手段を提供しています線維芽細胞の除去に成功し、より長い幹細胞培養に発症、これらの細胞のコンフルエントな単層しっかりの存在に依存しています。 7-10日後に、成長のhESCコロニーはコロニー間のますます密線維芽細胞単層を生成し、外方向にフィーダー線維芽細胞をプッシュします。線維芽細胞の単層内で強い細胞から細胞への添付細胞シートとしての迅速な除去を可能にします。これは精製技術が先行ルーチン拡大培養に利用だけではなく、実験へのhESCからMEFの除去の方法として使用するために提案されていることを慎重に留意すべきである。
それは質の悪い幹細胞コロニーを救うために、この精製技術を利用することも可能である。高品質のhESCコロニーはdistiを示すべき自身とフィーダー細胞間の境界をNCT。しかし、幹細胞のコロニーが少なく、明確に定義された植民地の境界線を示す、部分的な差別を受けている場合、このメソッドはまた、しかし、MEFの細胞シートと一緒のhESCコロニーが物理的に分離されて部分的に分化hESCのコロニーを除去するために使用されるかもしれませんピペットチップは、不要な分化細胞またはMEFで任意のhESCの接続を分離する必要があるかもしれません。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、再生医療（RN2-00921から1）、およびNIHの資金国立研究賞（F32-HL104924）カリフォルニア工科大学から新しい教員賞IIによって賄われていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
