Summary
Til tross for pågående arbeidet med å overgangen kulturer til mater-frie forhold, avledning og kultur av menneskelige embryonale stamceller (hESC) fortsatt i stor grad avhengig av co-kulturer med mus embryonale feeders (MEFs). Her viser vi en ny metodikk for raskt å fjerne feeders fra hESC kulturer før eksperimentering.
Abstract
Mus embryonale fibroblaster (MEFs) ble brukt til å etablere menneskelige embryonale stamceller (hESCs) kulturer etter blastocyst isolasjon en. Dette matesystem opprettholder hESCs fra gjennomgår spontan differensiering under celle ekspansjon. Imidlertid er denne co-dyrkning arbeidsintensiv, krever høyt utdannet personell, og gir nede hESC renhet 4. Mange laboratorier har forsøkt å minimere antall mater celler i hESC kulturer (dvs. innlemme matrise-belagte retter eller andre mater celletyper 5-8). Disse modifiserte kulturer har vist noen lover, men har ikke fortrengt standard metode for dyrking hESCs med mitomycin C-behandlede mus embyronic fibroblaster for å forsinke uønsket spontan differensiering av hESC kulturer. Derfor bør materen celler brukes i hESC ekspansjon fjernes under differensiering eksperimenter. Selv om flere teknikker er tilgjengelige for å rense hESC colonies (FACS, Mac, eller bruk av resistente vektorer) fra feeders, disse teknikkene er arbeidskrevende, kostbar og / eller ødeleggende for hESC. Målet med dette prosjektet var å oppfinne en metode for rensing som gjør at høsting av en renere befolkning på hESCs. Vi har observert at i en konfluent hESC kultur, kan MEF befolkningen fjernes med en enkel og rask aspirasjon av MEF arket. Denne fjerningen er avhengig av flere faktorer, inkludert lateral celle-til-celle binding av MEFs som har en lavere bindingsaffinitet til styren kultur parabol, og evnen av stamcelle koloniene å presse fibroblaster utover under generering av sin egen " nisje ". Den hESC ble deretter undersøkt for SSEA-4, Oct3 / 4 og Tra 1-81 uttrykk opptil 10 dager etter MEF fjerning å sikre opprettholdelsen av pluripotency. Videre var hESC kolonier i stand til å fortsette å vokse fra i større formasjoner etter MEF fjerning, som gir et ekstra nivå av hESC ekspansjon.
Protocol
1. Utarbeidelse av mus embryonale Feeders
- Den MEFs brukt i co-kultur av hESCs bør tidligere behandlet ved bestråling eller Mitomycin-C for å inhibere cellene fra gjennomgår divisjon.
- To timer før MEF seeding, pels hver 60 mm plasma behandlet kultur tallerken med 2 ml 0,05% Gelatin.
- Tine en ampulle med behandlet MEFs og plate på ~ 20000 celler / cm 2.
- La cellene å overholde natten.
2. Co-seeding hESCS bort på MEFs
- Nye kolonier kan initieres fra fryses ned kulturer eller passaging dagens kulturer på nye MEF-belagte retter, som vist nedenfor.
- Vask platen inneholder de store hESC koloniene skal passaged 1 gang med 3 ml warmed 1x PBS.
- Tilsett 3 ml av kollagenase IV / PBS-løsning (1 mg / ml) og inkuber i 5-10 min ved 37 ° C. (Merk: Cellene vil ikke bli tydelig eller ball opp som sett med trypsin).
- Mens cellene er fortsatt icollagenase, bruk en kant av en 5 ml pipettespiss, lage et rutenett mønster på koloniene, bryte dem opp i små celle klumper.
- Bruk enden av pipettespiss (holdt i en vinkelrett måte til dyrkingsplate) å skrape bunnen av dyrkingsplate, løsner alle cellene fra overflaten.
- Samle cellene inn i en Falcon rør og sentrifugering ved (1000 opm) i 5 min.
- Etter sentrifugering Aspirer mediet forlater cellepelleten i Falcon-røret.
- Aspirer MEF medium fra MEFs belagt dagen før.
- Re-plate cellene ved en 1:03 forhold fra den opprinnelige plate, og feed-med 3 ml hESC medium
3. Tappe MEFs fra Co-kulturen
Merk: Menneskestemmer ESC kulturer må ha høy densitet, vanligvis mellom 10 og 14 dagers kultur.
- Plasser på spissen av en aspirere pipetten på kanten av tallerkenen og tillate sug til forsiktig trekke opp kanten av MEF arket.
- Remove media fra fatet og la spissen for å fange cellen ark og beveg spissen i en bue måte over platen. Merk: Arket kan tette i tuppen av pipetten, men dette er ikke problematisk som det ikke skal hindre at brukeren manuelt trekke arket fra overflaten av kulturen plate. Hvis cellene er fast til enden av aspirator kan du bruke toppen av kulturen parabolen å bryte opp celle arket for fullstendig aspirasjon.
- Erstatt hESC medium umiddelbart, og sette platen tilbake i inkubatoren.
4. Representant Resultater
Sluttresultatet av MEF fjerningen produserer små uforstyrret hESC kolonier (figur 1D) i stand til å gjennomgå en betydelig utvidelse i svært store kolonier (figur 2) og samtidig opprettholde uttrykk for pluripotency beslutningstakere SSEA-4, okt ¾ og Tra 1-81 (Figur 3).
Figur 1. ESC Colony Morfologi Før og etter MEF fjerning. Menneskelig embryonale stamceller Colonies på A) dag 1 og B) Dag 2 Etter seeding på kultur retter. C) High Density Menneskelige embryonale stamceller Colonies (H7) omgitt av MEFs. De to hESC koloniene er skissert i rødt streker. D) Etter MEF fjerning ved hjelp av aspirasjon teknikken beskrevet, står vi igjen med en isolert hESC koloni med svært få MEFs rundt intakt kolonien.
Figur 2. ESC Colony Expansion 10 dager etter MEF fjerning. Den opprinnelige hESC kolonien umiddelbart etter MEF uttømming (til venstre) er lov til å ekspandere inn i en svært stor koloni (til høyre) hensiktsximately 800 mikrometer, 10x. Merk at den opprinnelige kolonien avbildes ved samme forstørrelse (10x) som den sammensatte kolonien.
Figur 3. Farging av MEF-utarmet hESC kolonier. Immunofluorescerende identifisering av kolonier opp til 10 dager etter MEF uttømming viser at kolonier opprettholde sin uttrykk for pluripotency markører som tydelig ved oktober ¾, SSEA-4, og Tra-1-81 farging. Dessuten gjør disse hESC kolonier ikke oppviser differensiering mot en mesodermal skjebne, indikert ved fravær av Flk-1. A, E, I og M) er overføring lette bilder av immunoflouscently farget koloniene, 20, 10, 10 og 2x, . henholdsvis B, F, J og N) viser kjerner -. DAPI fargede celler av immunofluorescently farget koloniene, 20, 10, 10 og 2x, henholdsvis CD) viser uttrykket avhuman stamcelleforskningen markør SSEA-4 bare, og sammensatt bilde, 20x. GH) viser uttrykk for menneskelig stamcelle markør oktober ¾ bare, og sammensatt bilde, 10x. KL) viser uttrykk for menneskelig stamceller markør Tra 1-81 bare , og sammensatt bilde, 10x. MP) Den siste raden hvis bilder skildrer en koloni portretterer de typiske glatte grenser sett på dette forstørrelse, 2x, og disse koloniene ikke uttrykke O) Flk-1, en tidlig markør for mesoderm differensiering, heller ikke de P) inneholde fibroblaster som vist ved fravær av DDR2 farging.
Supplerende Video. Fjerne Fibroblaster av skjema Aspirasjon. Klikk her for å se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden presentert i dette manuskriptet tilbyr rask og mindre kostnadskrevende alternativ til eliminere fibroblast mater celler fra humane embryonale cellekulturer. Vellykket fjerning av fibroblaster er avhengig av eksistensen av en tett konfluent monolag av disse cellene som utvikler seg i lengre stilk cellekulturer. Etter 7-10 dager vil den voksende hESC kolonier skyve mater fibroblaster i en ytre retning, genererer en stadig tett fibroblast monolayer mellom koloniene. De sterke celle-til-celle vedlegg i fibroblast monolayer la sin raske fjerning som en celle ark. Det bør spesielt bemerkes at denne rensing teknikken er foreslått for bruk som en fremgangsmåte for fjerning fra MEF hESC før eksperimentering bare, og ikke benyttes til rutinemessig ekspansjon kultur.
Det er også mulig å benytte denne teknikk for å rensing redde dårlig kvalitet stamcelleforskningen kolonier. En høy kvalitet hESC koloni skal fremvise distiNCT grenser mellom seg selv og mater celler. Hvis imidlertid, har stamcelle koloniene gjennomgått delvis differensiering, oppviser mindre veldefinerte colony grenser, så denne metoden kan også benyttes til å fjerne de delvis differensierte hESC kolonier sammen med MEF cellen arket, imidlertid, fysisk separasjon av hESC kolonier med en pipettespiss kan være nødvendig å skille eventuelle hESC forbindelser med de uønskede differensierte celler eller MEF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en New fakultet Award II fra California Institute of regenerativ medisin (RN2-00921-1), og en NIH-finansiert National Research Award (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
