Summary
Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.
Abstract
Muis embryonale fibroblasten (MEF) werden gebruikt om menselijke embryonale stamcellen (hESC ') culturen vastgesteld na blastocyst isolatie 1. Deze feeder systeem houdt hESC 's uit die een spontane differentiatie tijdens celexpansie. Echter, deze co-cultuur methode is arbeidsintensief, vereist hoog opgeleid personeel, en de opbrengst lage hESC zuiverheid 4. Vele laboratoria hebben getracht het aantal voedercellen in hESC culturen (dwz waarin matrix beklede schalen of feeder cell types 5-8) te minimaliseren. Deze gemodificeerde kweeksystemen is enige belofte, maar nog niet verdrongen de standaard methode voor het kweken van hESC 's met mitomycine C behandelde muizen embyronic fibroblasten om ongewenste spontane differentiatie van de hESC culturen vertragen. Daarom moet de voedingscellen in hESC expansie worden verwijderd tijdens differentiatie experimenten. Hoewel verschillende technieken beschikbaar voor het zuiveren van hESC colonies (FACS, MACS, of het gebruik van resistente vectoren) van feeders, deze technieken zijn arbeidsintensief, duur en / of destructief voor de hESC. Het doel van dit project was om een methode van zuivering dat de oogst van een zuiverder bevolking van hESC 's maakt uitvinden. We hebben gezien dat in een confluente hESC cultuur, de MEF bevolking kan worden verwijderd met behulp van een eenvoudige en snelle aspiratie van de MEF vel. Deze verwijdering is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder laterale cell-to-cell binding van MEFs dat een lagere bindingsaffiniteit voor de styreen kweekschaal hebben en het vermogen van de stamcellen koloniën fibroblasten buiten drukken tijdens de generatie van hun eigen " niche ". De hESC werden daarna onderzocht SSEA-4, Oct3 / 4 en Tra 1-81 tot expressie 10 dagen na verwijdering MEF onderhoud van pluripotentie waarborgen. Bovendien hESC kolonies in staat waren om te blijven groeien uit tot grotere formaties na MEF verwijdering, het verstrekken van een extra niveau van hESC expansie.
Protocol
1. Voorbereiding van muis embryonale Feeders
- De MEF's die in de co-cultuur van hESC 'vooraf worden behandeld door bestraling of mitomycine-C om de cellen beletten ondergaan splitsing.
- Twee uur voor MEF zaaien, vacht elke 60 mm plasma behandeld kweekschaal met 2 ml van 0,05% gelatine.
- Ontdooien een flesje behandeld MEF en plaat bij ~ 20.000 cellen / cm 2.
- Laat de cellen een nacht hechten.
2. Co-zaaien hESC 's op MEF
- Nieuwe kolonies kan worden gestart vanaf gecryopreserveerd culturen of passage huidige culturen op nieuwe MEF-gecoate gerechten, zoals hieronder.
- Was de plaat met de grote hESC kolonies worden gepasseerd 1 keer met 3 ml van verwarmde 1x PBS.
- 3 ml collagenase IV / PBS oplossing (1 mg / ml) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. (Opmerking: De cellen zullen niet worden onderscheiden of bal gezien met trypsine).
- Terwijl de cellen nog in decollagenase, gebruik maken van een rand van een 5 ml pipet tip, maak een rasterpatroon op de koloniën, breken ze in kleine cel klonten.
- Met de voorzijde van de pipet (gehouden in een loodrechte wijze in de petrischaal) aan de onderzijde van de petrischaal schrapen, loskomen alle cellen van het oppervlak.
- Verzamel de cellen in een Falcon buis en draaien op (1000 rpm) gedurende 5 minuten.
- Na centrifugatie zuigen het medium, waardoor de celpellet in het Falcon buis.
- Zuig het MEF medium van de MEF geplateerde de dag ervoor.
- Re-plate de cellen in een 1:3 verhouding van de oorspronkelijke plaat en feed met 3 ml van medium hESC
3. Afbrekende MEFs van de Co-cultuur
Opmerking: Human ESC, mogen er bij hoge dichtheid gewoonlijk tussen 10 en 14 dagen kweken.
- Plaats de punt van een aspiratie pipet aan de rand van de plaat en laat de zuigkracht om voorzichtig omhoog te trekken aan de rand van de MEF vel.
- Rerwijder de media van de schotel, en laat de tip om de cellaag te vangen en langzaam de punt te verplaatsen in een boog wijze boven de plaat. Opmerking: Het vel kan verstoppen in de punt van de pipet, maar dit is niet problematisch, aangezien het dient de gebruiker niet verhinderen handmatig trekken het vel van het oppervlak van de petrischaal. Als de cellen zitten vast aan het einde van de aspirator, kunt u gebruik maken van de top van de cultuur schotel te breken van de cellaag voor volledige aspiratie.
- Onmiddellijk te vervangen hESC medium, en zet de plaat in de incubator.
4. Representatieve resultaten
Het eindresultaat van de MEF verwijderingsproces produceert kleine ongestoord hESC kolonies (figuur 1D) in staat om aanzienlijke uitbreiding ondergaan in zeer grote kolonies (figuur 2) met behoud van de expressie van pluripotentie makers SSEA-4, Oct ¾ en Tra 1 tot 81 (figuur 3).
Figuur 1. ESC Colony Morfologie Before and After MEF verwijderen. Menselijke embryonale stamcellen Kolonies op A) dag 1 en B) dag 2 na het zaaien op cultuur gerechten. C) met hoge dichtheid Menselijke embryonale stamcellen Koloniën (H7), omringd door MEFs. De twee hESC kolonies worden geschetst in het rood streepjes. D) Na het MEF verwijderen met behulp van de beschreven aspiratie techniek, zijn we vertrokken met een geïsoleerde hESC kolonie met zeer weinig MEFs rond de intacte kolonie.
Figuur 2. ESC Colony Uitbreiding 10 dagen na MEF verwijderen. De oorspronkelijke hESC kolonie onmiddellijk na MEF uitputting (links) is toegestaan om uit te breiden in een zeer grote kolonie (rechts) gebatterijvak ongeveer 800 urn, 10x. Merk op dat de oorspronkelijke kolonie wordt afgebeeld bij dezelfde vergroting (10x) als de samengestelde kolonie.
Figuur 3. Immunokleuring van MEF-verarmde hESC kolonies. Immunofluorescente identificatie van de kolonies tot 10 dagen na de uitputting MEF blijkt dat kolonies hun expressie van pluripotentie markers zoals duidelijk door oktober ¾, SSEA-4, en Tra-1-81 kleuring behouden. Bovendien zijn deze hESC kolonies vertonen geen differentiatie naar een mesodermale lot, aangegeven door de afwezigheid van Flk-1. A, E, I en M) zijn doorgelaten licht beelden van de immunoflouscently gekleurde kolonies, 20, 10, 10 en 2x, . respectievelijk B, F, J, N en) laten nuclei -. DAPI gekleurde cellen van de immunofluorescently gekleurde kolonies, 20, 10, 10 en 2x respectievelijk CD) tonen de expressie vanmenselijke stamcellen marker SSEA-4 alleen, en samengesteld beeld, 20x. GH) tonen de uitdrukking van menselijke stamcellen marker oktober ¾ alleen, en samengesteld beeld, 10x. KL) tonen de uitdrukking van menselijke stamcellen marker Tra een-eenentachtig alleen , en samengesteld beeld, 10x. MP) De laatste rij als afbeeldingen tonen een kolonie uitbeelden van de typische gladde grenzen zien op deze vergroting, 2x, en deze kolonies niet express O) Flk-1, een vroege marker van mesoderm differentiatie, noch zij P) bevatten fibroblasten zoals blijkt uit afwezigheid van DDR2 kleuring.
Aanvullende Video. Verwijderen Fibroblasten door Gezinsblad Aspiration. Klik hier om naar de film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode die in dit manuscript biedt een snelle en minder kostbaar alternatief voor het elimineren van fibroblast feeder-cellen uit menselijke embryonale cel culturen. De succesvolle verwijdering van fibroblasten is afhankelijk van het bestaan van een strak confluente monolaag van deze cellen dat zich ontwikkelt in meer stamcelculturen. Na 7-10 dagen, zal de groeiende hESC kolonies druk op de feeder fibroblasten in buitenwaartse richting, het genereren van een steeds dichter wordende fibroblast monolaag tussen kolonies. De sterke cel-cel bijlagen in de fibroblast monolaag maken snelle verwijdering ervan als cellaag. Opgemerkt zorgvuldig dat deze zuiveringstechniek is voorgesteld voor gebruik als methode MEF verwijderen van hESC voor experimenten, en niet gebruikt voor routine expansie cultuur.
Het is ook mogelijk om deze zuiveringstechniek gebruiken om slechte kwaliteit stamcellen kolonies redden. Een hoge kwaliteit hESC kolonie moet vertonen distiNCT grenzen tussen zichzelf en de feeder-cellen. Indien echter zijn de stamcellen kolonies ondergaan gedeeltelijke differentiatie vertonen minder goed gedefinieerde randen kolonie, dan kan deze methode ook worden gebruikt om de gedeeltelijk gedifferentieerde hESC kolonies te verwijderen samen met de MEF cellaag echter fysieke scheiding van hESC kolonies een pipet tip zou kunnen worden genomen om eventuele hESC verbindingen met de ongewenste gedifferentieerde cellen of MEF scheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een New Faculty Award II van het California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), en een NIH-gefinancierde National Research Award (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
