Summary
Trots pågående insatser övergångsregler kulturer till feeder-fria förhållanden, härledning och kultur av mänskliga embryonala stamceller (hESC) i stort sett är beroende av co-kulturer med mus embryonala matare (MEF). Här visar vi en ny metod för att snabbt avlägsna matare från hESC kulturer före experiment.
Abstract
Mus embryonala fibroblaster (MEF) användes för att fastställa mänskliga embryonala stamceller (hESCs) kulturer efter blastocyst isolering 1. Denna feeder systemet upprätthåller hESCs från att genomgå spontan differentiering under cellens expansion. Emellertid är detta samarbete odlingsmetod arbetsintensiv, kräver välutbildad personal, och ger låg hESC renhet 4. Många laboratorier har försökt minimera antalet matarceller i hESC kulturer (dvs. innefattande matris-belagda skålar eller andra feeder celltyper 5-8). Dessa modifierade odlingssystem har visat några löften, men har inte ersatt standardmetoden för odling hESCs med mitomycin C-behandlade fibroblaster mus embyronic i syfte att fördröja oönskad spontan differentiering av hESC kulturer. Därför bör feeder celler som används i hESC expansionen avlägsnas under differentiering experiment. Även om flera tekniker finns tillgängliga för att rena hESC colonies (FACS, Mac eller användning av läkemedelsresistenta vektorer) från matare, dessa tekniker är arbetsintensiva, kostsamma och / eller destruktiv för hESC. Syftet med detta projekt var att uppfinna en metod för rening som möjliggör skörden av en renare population av hESCs. Vi har observerat att i en sammanhängande hESC kultur kan MEF befolkningen tas bort med hjälp av en enkel och snabb aspiration av MEF arket. Detta avlägsnande är beroende av flera faktorer, inklusive laterala cell-till-cell-bindning av MEF som har en lägre bindningsaffinitet till styren odlingsskålen, och förmågan hos kolonierna stamceller att driva fibroblasterna utåt under alstringen av sin egen " nisch ". Den hESC undersöktes sedan för SSEA-4, Oct3 / 4 och Tra 1-81 uttryck upp till 10 dagar efter MEF bort för att säkerställa upprätthållandet av pluripotens. Dessutom var hESC kolonier kunna fortsätta växa från i större formationer efter MEF bort, vilket ger ytterligare en nivå av hESC expansion.
Protocol
1. Beredning av Mouse Embryonala matare
- Den MEF används i samodling av hESCs bör tidigare behandlats genom bestrålning eller mitomycin-C för att inhibera att cellerna från att genomgå delning.
- Två timmar före MEF sådd, päls var 60 mm plasmabehandlas kultur skålen med 2 ml 0,05% gelatin.
- Tina en flaska behandlad MEF och plattan vid ~ 20.000 celler / cm 2.
- Tillåta cellerna att vidhäfta över natten.
2. Co-sådd hESCs PÅ MEF
- Nya kolonier kan initieras från kryokonserverade kulturer eller passage nuvarande kulturer på nya MEF-belagda rätter, enligt nedan.
- Tvätta plattan innehållande de stora hESC kolonierna att passera 1 gång med 3 ml uppvärmd 1x PBS.
- Tillsätt 3 ml kollagenas IV / PBS-lösning (1 mg / ml) och inkubera under 5-10 minuter vid 37 ° C. (Obs! Cellerna blir inte distinkta eller bollen sett med trypsin).
- Medan cellerna är fortfarande ikollagenas, använda en kant av en 5 ml pipett spets, skapa ett rutmönster på kolonierna, bryta dem i små cellklumpar.
- Använd änden av pipettspetsen (hölls i ett vinkelrätt sätt till odlingsplattan) att skrapa botten av odlingsplattan, lossnar alla celler från ytan.
- Samla cellerna i en Falcon-rör och centrifugera vid (1000 rpm) under 5 minuter.
- Efter centrifugering, aspirera mediet, lämnar cellpelleten i Falcon-rör.
- Aspirera MEF mediet från MEF pläterade dagen innan.
- Re-platta cellerna vid en 1:3-förhållande från den ursprungliga plattan och foder med 3 ml hESC-medium
3. Förbruka MEF från Co-kulturen
Obs: Human ESC kulturer måste vara hög densitet, vanligen mellan 10 och 14 dagars odling.
- Placera spetsen på en aspirerande pipett vid kanten av plattan och låt sug att försiktigt dra upp kanten på MEF arket.
- REFlytta media från skålen och låt spetsen att fånga cellskiktet och för sakta spetsen i en båge sätt ovanför plattan. Obs: Arket kan täppa i spetsen på pipett, men detta är inte problematisk, eftersom det inte bör hindra användaren från att manuellt dra arket från ytan på odlingsplattan. Om cellerna fastnat i slutet av aspiratorn, kan du använda den övre delen av odlingsplattan för att bryta upp cellarket för fullständig aspiration.
- Byt hESC medium omedelbart, och sätta plattan tillbaka i inkubatorn.
4. Representativa resultat
Slutresultatet av MEF borttagningen producerar små ostörda hESC kolonier (Figur 1D) som kan genomgå betydande expansion i mycket stora kolonier (Figur 2) samtidigt som uttryck av pluripotens beslutsfattare SSEA-4, oktober ¾ och Tra 1-81 (figur 3).
Figur 1. ESC kolonimorfologi Före och efter MEF borttagning. Mänskliga embryonala stamceller Kolonier på A) dag 1 och B) dag 2 efter sådd på odlingsskålar. C) High Density Mänskliga embryonala stamceller kolonier (H7) omgiven av MEF. De två hESC kolonierna beskrivs i röda streck.) D Efter MEF borttagande med hjälp av aspiration beskriven, är vi kvar med en isolerad hESC koloni med mycket få MEF kring den intakta kolonin.
Figur 2. ESC Colony Expansion 10 dagar efter MEF Removal. Den ursprungliga hESC kolonin direkt efter MEF utarmning (vänster) får expandera till en mycket stor koloni (höger) lämpligaximately 800 um, 10x. Notera att den ursprungliga kolonin avbildas med samma förstoring (10x) som den sammansatta kolonin.
Figur 3. Immunfärgning av MEF-utarmade hESC kolonier. Immunofluorescerande identifiering av kolonier på upp till 10 dagar efter MEF utarmningen visar att kolonierna upprätthåller deras uttryck av pluripotens markörer som uppenbar genom oktober ¾, SSEA-4 och Tra-1-81 färgning. Dessutom har dessa hESC kolonier inte uppvisar differentiering mot en mesodermal öde, indikeras av frånvaron av Fik-1. A, E, I och M) är överföring ljusa bilder av immunoflouscently färgade kolonierna, 20, 10, 10 och 2x, . respektive B, F, J och N) visar kärnorna -. Dapi infärgade celler av de immunofluorescently färgade kolonierna, 20, 10, 10 och 2x respektive CD) visar uttrycket avmänskliga stamceller markör SSEA-4 enbart, och sammansatt bild, 20x. GH) visar expressionen av humana stamceller markör oktober ¾ endast, och sammansatt bild, 10x. KL) visar uttrycket av humana stamceller markör Tra 1-81 endast och sammansatt bild, 10x. MP) Den sista raden om bilder skildrar en koloni porträtterar de typiska mjuka gränser ses vid denna förstoring, 2x, och dessa kolonier uttryckte inte O) Flk-1, en tidig markör för mesoderm differentiering heller De P) innehåller några fibroblaster vilket framgår av frånvaron av DDR2 färgning.
Kompletterande video. Bort fibroblaster genom Sheet aspiration. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteras i detta manuskript erbjuder en snabb och mindre kostsamt alternativ till att eliminera celler fibroblast feeder från humana embryonala cellkulturer. Den framgångsrika avlägsnandet av fibroblaster är beroende av förekomsten av ett tätt sammanflytande monoskikt av dessa celler som utvecklas i längre stamcellskulturer. Efter 7-10 dagar, kommer de växande hESC kolonierna skjuta feeder fibroblaster i riktning utåt, vilket ger en allt tätare fibroblast monolager mellan kolonier. De starka cell-till-cell bilagor inom fibroblast monoskiktet tillåta ett snabbt avlägsnande som en cellskiktet. Det bör noggrant noteras att denna reningsteknik föreslås för användning som en metod för MEF avlägsnande från hESC före experimentering enbart, och inte utnyttjas för rutinmässig expansionen kultur.
Det är också möjligt att utnyttja denna teknik för rening för att rädda dålig kvalitet kolonier stamceller. En hög kvalitet hESC koloni bör uppvisa distiNCT gränserna mellan sig själva och cellerna feeder. Men om har stamceller kolonierna genomgått partiell differentiering, uppvisar mindre väldefinierade koloni gränser, då denna metod kan också användas för att ta bort de delvis differentierade hESC kolonier tillsammans med MEF cellarket, men fysiska separationen av hESC kolonier med en pipettspets kan vara nödvändigt att segregera eventuella hESC anslutningar med de oönskade differentierade celler eller MEF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av en ny fakultet Award II från California Institute of regenerativ medicin (RN2-00.921-1), och en NIH-finansierad Forsknings Award (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
