Abstract
Tumörer skapa en unik immunosuppressiv mikromiljö (tumör mikromiljö, TME) där leukocyter har rekryterats i tumören av olika kemokiner och tillväxtfaktorer 1,2. Emellertid, en gång i TME, dessa celler förlorar förmågan att främja antitumörimmunitet och börjar att stödja tumörtillväxt och nedreglera anti-tumör-immunsvar 3-4. Studier på tumör-associerade leukocyter har främst fokuserat på celler som isolerats från tumör-dränerande lymfkörtlar eller mjälte på grund av de inneboende svårigheterna att få tillräckligt cellantal och renhet från den primära tumören. Och identifiera de mekanismer för cell-aktivering och människohandel via det lymfatiska systemet tumörbärande möss är viktigt och kan ge inblick i kinetiken av immunsvaret mot cancer, enligt vår erfarenhet, många leukocyter, inklusive dendritiska celler (DC), i tumör-dränering lymfkörtlar har en annan fenotyp än de som infiltrerar tumörer 5,6. Vidare har vi visat tidigare att adoptivt överförda-T-celler isolerade från tumör-dränerande lymfkörtlar inte toleranta och är kapabla att reagera på sekundär stimulering in vitro till skillnad från T-celler isolerade från TME, som är tolererad och oförmögna att proliferation eller cytokin produktion 7,8. Intressant nog har vi visat att förändra tumören mikromiljö, såsom att tillhandahålla CD4 + T-hjälparceller genom adoptiv överföring, befrämjar CD8 + T-celler att upprätthålla proinflammatoriska effektorfunktioner 5. Resultaten från vart och ett av de tidigare nämnda studierna demonstrerar betydelsen av att mäta cellulära svar från TME-infiltrerande immunceller i motsats till celler som finns kvar i periferin. För att studera funktionen av immunceller som infiltrerar tumörer med hjälp av Miltenyi Biotech isolationssystemet 9, har vi modifierade och optimeras denna antikropp-baserat förfarande för isolering för att erhålla höggradigt enriched populationer av antigenpresenterande celler och tumör-antigen-specifika cytotoxiska T-lymfocyter. Protokollet omfattar en detaljerad dissektion av murin prostata vävnad från en spontan prostatatumör modellen (transgena adenocarcinom i mus prostata-TRAMP) 10 och en subkutan melanom (B16) tumörmodellen följt av efterföljande rening av olika leukocytpopulationer.
Protocol
1. Isolering av myeloida celler från TRAMP prostatatumörer
- Alla förfaranden utfördes under ledning av ett djur Review Board. TRAMP-möss utvecklar spontant autoktona prostatatumörer som ett resultat av en transgen (SV40) som kontrolleras av promotorn probasin 10. Varje hanmus kan användas för detta förfarande. Medan TRAMP tumörer kan skördas i alla åldrar, bör det noteras att tramp prostatatumörer i allmänhet förblir små tills mössen når åldrarna är större än 20 veckor. Euthanize möss med CO 2 kvävning. Ta det urogenitala området (UGT), genom att klippa upp bukhålan och dra tillbaka fettvävnad. Fettvävnad är skummig, glittrande ser vävnad.
- Lokalisera blåsan, och det ligger direkt mellan de två stora vita sädesblåsor. Hålla fast blåsan med pincett. Att hålla saxen stängt släta ut fettvävnad och leta reda på urinröret. Skär ner på urethra så nära bäckengördeln som möjligt och avskilja vas deferens. Medan skära ner, samtidigt dra upp på blåsan. Detta kommer att frigöra hela UGT som nu kan vara mikro-dissekeras för att få var och en av loberna av prostata.
- Placera UGT i rumstemperatur PBS. Använd en dissektionsmikroskop att visualisera UGT och rensa bort överflödigt fettvävnad. Använd pincett, hålla fast urinröret och samla ventrala, laterala och främre lober av prostata. Placera vävnaden i PBS medan man samlar resten av loberna.
- Ta bort sädesblåsorna och kasta.
- Vända den kvarvarande vävnaden 180 °. Samla ampullary körteln och dorsala lober prostata.
- Använd pincett, retas isär prostatavävnad och placera den i matsmältningen (dissociation) buffert.
- Plats tumörvävnad i 1 ml dissociation buffert (100 U / ml kollagenas av typ IV och 100 pg / ml DNas i RPMI + 10% FBS). Varje tumör kan requIRE unika dissociationsbetingelser, för tramp prostatatumörer, använda 1 ml och för B16 tumörer, använd 5 ml (se nedan). Obs: graden av KoUagenas (I-IV) kommer att bero på cellpopulationen vara isolerad, myeloid cellisolering är bäst med typ IV, medan lymfocyter avkastningen är högre med typ I.
- Placera röret i 37 ° C inkubator under 30 minuter.
- Pipettera upp och ned med en 1 ml pipett för att få en lätt flyter enkelcellsuspension.
- Filtret suspensionen genom 70 ^ m filter och tvätta 3x med MAC separering buffert kompletterad med 10% FBS under myeloid cellisolering.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 400 xg under 10 min. Skölj pelleten med 10 ml MAC buffert och centrifugera igen med samma inställningar.
- Resuspendera cellpelleten i 100 | il MAC-buffert. Därefter tillsättes 1 pg anti-CD16/32 antikropp (Ab) per 10 8-celler (200 pl 2.4.G2 hybridomkultursupernatant) och inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter. Obs: than mängd av FcR-γ blockerande antikropp (Ab) som skall tillsättas kan variera beroende på frekvensen / antal FcR-y +-celler i vävnaden och den volym av cellsuspensionen, och därför kan detta steg kräver optimering.
- Tillsätt 100 pl av "Pan-DC" eller 10 ^ il av anti-CD11b, anti-CD11c eller anti-PDCA-1 Mikrokorn per 10 8 totala celler, beroende på den önskade cellpopulationen. OBS: mängden som krävs Mikropärlor kan variera beroende på frekvens / antalet celler av den önskade befolkningen i vävnaden och därför kan detta steg kräver optimering.
- Blanda väl genom att försiktigt vicka röret (Do Not Vortex) och inkubera under 15 minuter vid 4-8 ° C, skyddade från ljus. Inte inkubera inte på is.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml MAC-buffert. Centrifugera vid 400 x g under 10 minuter.
- Häll av supernatanten fullständigt och återsuspendera cellerna i 500 | il av MAC-buffert. Tumörcellinjer suspensioner strömma bättre genom LC kolonner. (Andraval: MS, LS, LD).
- Applicera en ny kolumn till magneten separatorn. Prime kolumnen genom att skölja med en lämplig mängd av Mac buffert för den markerade kolumnen: För LC och MS kolumner Använd 500 pl. För LS eller LD kolonner använder 1 ml. Efter att ha fyllt kolonnen, applicera cellsuspension på toppen av kolonnen. Använda en kolonn för varje 1 x 10 8-celler.
- Samla omärkta celler (pass-through) och tvätta kolonnen minst tre (upp till fem) gånger med 500 ^ volym för totalt 1,5-2,5 ml vätska tvätt. Utför tvättningen 1 genom tillsats av MAC-buffert på kolonnen, och det är viktigt att hålla spalten strömmar. Så snart kolumnen droppar sista droppen, tillsätt mer buffert. Låt inte kolumnen stå utan flöde eller låt den gå torrt (detta kan inte underskattas, eftersom torkning av kolonnen kan förstöra renhet och leda till betydande förlust av cellens livskraft.). För tvätt steg 2, skölj kolonnen med dissociation buffert mix (innehållande kollagenas + DNas som deskrivs i steg 1,7), vilket fungerar som en "hårdare" tvätt steg att spola ut klibbiga skräp från döda eller döende tumörceller. Utför tvätta steg 3 med Mac buffert, om flödet genom ser inte helt klar efter tvätt steg 3, fortsätta att tvätta i 2 ytterligare tvättsteg med Mac buffert (för totalt 5 tvättar). För stora subkutana tumörer (t.ex. B16 melanom), under det sista tvättsteget, tryck lätt med en behandskade fingertoppen till toppen av kolonnen, vilket frigör extra skräp för en renare, renat cellpopulation. Detta steg behövs inte för fasta vävnadsprover tumörer såsom prostata, utan att använda extra tvättsteg, tvättning totalt minst 5-6 gånger.
- Ta kolumn från den magnetiska separatorn och placera den på ett lämpligt insamlingssystem rör. Pipettera 2 ml av buffert på kolonnen. Samla upp magnetiskt märkta cellerna genom fast tillämpning kolven förses med kolonnen.
- Räkna antalet celler och bekräfta renhet för den valda cellen befolkningen genomflödescytometrisk analys. För identifiering av DC populationer föreslagna markörer inkluderar CD45, CD11c, PDCA-1, B220 och CD11b. Föreslagna makrofag markörer inkluderar CD45, CD11b, F4-80, och Ly6C.
2. Isolering av adoptivt överförd T-celler från subkutan B16 melanomtumörer
Detta protokoll fungerar bäst med tumörer som är 250 mm 2 eller mindre (beräknas genom att mäta tudelar diametrar på tumören).
- B16-tumörceller injicerades subkutant i C57BL / 6 möss och tumör mätningar registrerades var 2 dagar 8. Möss med tumörer som mäter 250 mm 2 avlivas genom kvävning med CO2. Användning autoklaverade kirurgiska instrument sköljdes med 70% ETOH, skars tumören i små (<3 mm) bitar och inkubera i 5 ml dissociation lösning (RPMI-medium kompletterat med 5% FBS, kollagenas typ I (200 U / ml) och DNas I (100 | ig / ml)) under 30 min vid 37 ° C, Pipettering (med användning av en 1000 μl pipettspetsen) och skakning var 10 minut under inkubationen. Om myeloidceller senare kommer att isoleras, ersätta 5% FBS och kollagenas typ I med 10% FBS och kollagenas typ IV (200 U / ml), respektive.
- Efter inkubation, passera cellsuspension genom en 70 m cellfilter och tvätta två gånger med 10 ml MAC buffert (beredd enligt tillverkarens anvisningar, Miltenyi Biotech). Valfri - för mycket stora tumörer (> 300 mm 2), kan inflammatoriska celler i förväg berikas med densitetsgradientcentrifugering (Percoll eller Ficoll).
- Aspirera tvätt supernatanten och tillsätt 1 pg anti-CD16/32 antibody/10 8 celler (200 pl klon 2.4.G2 kultursupernatant) och inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Utan tvättning, tillsätt 1 pg anti-Thy1.1 PE-antikropp per 10 8-celler, blanda väl genom att försiktigt knacka på röret och inkubera under 30 minuter på is, avskärmad från ljus.
- Tvätta cellerna för att avlägsna obundet priMary antikropp genom tillsats av 10 ml MAC-buffert och centrifugera vid 400 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 20 pl anti-PE mikrokulor (Miltenyi Biotech) per 10 7 totala antalet celler, enligt tillverkarens instruktioner.
- Blanda väl genom att försiktigt vicka rör (inte vortex) och inkubera vid 4 ° C (använd inte is) i 15 minuter, skyddade från ljus. Varning: vortexning kan minska integritet pärlorna.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml MAC-buffert och centrifugera vid 400 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 | il MAC-buffert. För tumörer i en större storlek (> 300 mm 2), använd 1 ml buffert.
- Plats en LC (stora celler) kolonn i magnetfältet separatorn. Tumör cellsuspensioner flöda bästa genom dessa spalter. Skölj kolonnen med 500 | il MAC-buffert för att prima kolonnen. De flesta tumörer kommer också strömma genom LS och LD kolumner, men kräver ytterligare rötning och mekanisk disruption för att uppnå den lämpliga nivån på enkelcellsuspension. Tvätta kolonnen med 1 ml MAC-buffert för att prima kolonnen.
- Tillämpas cellsuspension på kolonnen och tillåta att fullständigt flyta genom (utan att låta den kolonnkörning torr). Därefter tvätta med 500 pl MAC buffert och upprepa tvätt 3x. Bara lägga till nya buffert när kolumnen behållaren är tom, men låt inte kolonnen stå utan flöde. Detta kommer att orsaka igensättning och minskad renhet.
- Detta är ett kritiskt steg för stora subkutana tumörer: Efter det sista tvättsteget, med en handskförsedd fingertopp, försiktigt tryck på toppen av kolonnen medan den fortfarande på den magnetiska separatorn. Detta frigör extra skräp för en mer renodlat berikad befolkning. Därefter Tvätta kolumn 1 mer tid med 500 fil MAC buffert.
- Ta kolumn från separatorn och placera det i en ren 15 ml koniskt rör, tillsätt 2 ml MACs buffert i kolonnen. Spola ut magnetiskt-märkta CELÄr av ordentligt trycka in kolven i kolonnen.
- Centrifugera eluerade fraktionen vid 400 xg under 5 minuter. Renhet vid detta steg är typiskt mellan 75-80%. För att uppnå> 90% renhet, upprepa den magnetiska separationen förfarande som beskrivs i steg 1,10-1,12 användning av en ny MS kolonn. MS kolonnen är mindre och mer kompakt, så att suspensionen kommer att köras långsammare genom kolonnen, men kommer att ge ett högre antal och renhet hos cellen av intresse.
- Räkna antalet celler för ytterligare experiment och kontrollera renhet genom flödescytometrisk analys. För isolering av adoptivt överförda T-celler såsom de som beskrivs i detta protokoll, alleliska markörer för identifiering inkluderar CD45 och Thy1.1 (överförda celler) och Thy1.2 (värd-T-celler).
3. Representativa resultat
Utbytet av en särskild cellpopulation (dvs. makrofager, DC, T-cell, etc.) kommer att variera beroende på storleken av tumören och behandlingar som var administered under tumörtillväxt. En prostata från en obehandlad 14-16 veckor gamla möss TRAMP bör ge mellan 8x10 5-1x10 6 CD11c + / PDCA-1 + (DC)-celler vid 90-95% renhet eller 1x10 6-1.5x10 6 F4/80 + / CD11b + (makrofager) vid 80-90% renhet från 300 mg av vävnad efter isolering protokollet ovan såsom visas i figur 1. Antalet av var och en av dessa celler ökar något efter adoptiv överföring av tumör-antigen-specifika T-celler. Dålig renheten är oftast ett resultat av otillräcklig tvättning, vilket gör att kolumnen torka (vilket kan resultera i tumör skräp retention i kolumnen), eller otillräcklig Fc-receptorn blockeras.
På liknande sätt kommer de totala celler som isolerats från B16 tumörer varierar också beroende på tumörstorlek vid vävnaden skörd och adoptiv överföring av T-celler (överföring av 5x10 6) med eller utan DC-vaccin (överföring av 1x10 5). Mycket få antigen-SPEcifika T-celler infiltrerar tumörer såvida en antigen-pulsade DC-vaccin ges också en dag efter T-cell överföring. Om en DC vaccinet ges till en mus som bär en liten palpabel (<50 mm 2) tumör, en avkastning på cirka 3x10 5 Thy1.1 + T-celler, med en renhet av 80-85%, skulle vara en "bra "skörda såsom visas i figur 2A. Men om större tumörer skördas, kommer den totala utbytet och renhet minskas.
Makrofager (F4/80 + / CD11b +) är oftast en mindre andel av de totala cellerna i B16 tumörer. Figur 2B visar att utnyttja CD11b från en tumör som är 250 mm 2, ger ca 1x10 6 makrofager vid 90-95% renhet . Dessutom Figur 2B visar att den DC-populationen i B16 tumörer är heterogena. Till skillnad från prostatatumörer, två underpopulationer: CD11c + / PDCA-1 + (plasmacytoid DC) och CD11c+ / PDCA-1 - (konventionell DC) kan erhållas från B16 melanomtumörer. Uppskattningsvis 2x10 6 PDC och 4x10 6 CDC väntas från 250 mm 2 B16 tumörer på 80-90% renhet. Minskad renheten är oftast ett resultat av att inte rensa tumörceller från kolonnen. Steg 2,12 är ett kritiskt steg för att ta bort den lilla klump av melanomceller som kvarstår vid basen av kolonnen. Efter detta steg ökar effektiviteten av de tvättningssteg och resulterar i bättre renhet.
Figur 1. DCS (CD11c + / PDCA-1 +) och makrofager (F4/80 + / CD11b +) isolerades från ett TRAMP prostatatumör. Plot Värdena representerar procenten av celler av intresse före eller efter-rening.
Figur 2. (A) Adoptively överfördes Thy1.1 + / CD8 + T-celler och (B) myeloidceller innefattande CD11c + / PDCA-1 + plasmacytoid DCS, CD11c + / PDCA-1 - konventionella DC och F4/80 + / CD11b + makrofager isolerades från subkutan B16-melanom tumör från Thy1.2 + möss. Plot Värdena representerar procenten av celler av intresse före eller efter-rening.
Discussion
Detta protokoll kan ändras, baserat på storleken och källan av tumören (subkutan, spontan tumör eller ortotopisk tumörer). För större tumörer, är det rekommenderat att öka mängden av dissociations-buffert, MAC-buffert, och antalet tvättar. Den hjärtlighet av de isolerade celler kan bero på TME som de håller på att berikas. Exempelvis i vår erfarenhet, celler isolerades från spontana prostatatumörer kräver mildare dissociering än celler som isolerats från subkutana B16 melanomtumörer. Under dissektion av tumören, eliminera så mycket fett, hud eller annat skräp som kan hindra en effektiv enzymatisk dissociation. Det är kritiskt att helt smälta tumörmassor och erhålla en enda cellsuspension för att säkerställa korrekt Ab märkning och för att förhindra kolonner från tilltäppning. För myeloid cellisolering, mättes mängden fetalt bovint serum rekommenderas i MAC isoleringsbuffert ökade från 2% till 10% för att förbättra cellviabilitet. Det är också essential att hålla alla buffertar och celler kalla hela protokollet för att förhindra icke-specifik Ab bindning och igensättning av kolonnen. Sammanfattningsvis, för att erhålla höggradigt anrikade populationer av antigenpresenterande celler och tumör-antigen-specifika cytotoxiska T-lymfocyter, har vi modifieras och optimeras ett antikropp-baserat förfarande för isolering med användning av Miltenyi Biotech tekniken. Med hjälp av detta protokoll, kan både adoptivt överföras och endogen leukocytpopulationer berikas med Abs riktade mot celler typspecifika ytmarkörer. En fördel med de beskrivna förfarandena är att minska tumören skräp överföring efter omfattande och rigorösa tvätt. Detta innefattar användning av kollagenas i tvättbufferten samt identifiering av en punkt där ökat tryck i kolonnen kan eliminera kolumn träskor av tumörceller. Erhålla ett tillräckligt antal av immunceller från vävnader, särskilt vid en renhet som är lämplig för funktionell analys, kan vara en svår uppgift.I vår erfarenhet, ger det protokoll häri har det högsta antalet celler, med den högsta renhet, med den mest konsistens.
Disclosures
Författarna har inga relevanta upplysningar.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Scott Durham för granskning av manuskriptet och video. Detta arbete stöds i delar av intramural forskningsprogram NIH, NCI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
References
- Shurin, M. R. Intratumoral cytokines/chemokines/growth factors and tumor infiltrating dendritic cells: friends or enemies. Cancer Metastasis Rev. 25, 333-356 (2006).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Anderson, M. J., Shafer-Weaver, K., Greenberg, N. M., Hurwitz, A. A. Tolerization of tumor-specific T cells despite efficient initial priming in a primary murine model of prostate cancer. J. Immunol. 178, 1268-1276 (2007).
- Ganss, R., Hanahan, D. Tumor microenvironment can restrict the effectiveness of activated antitumor lymphocytes. Cancer Res. 58, 4673-4681 (1998).
- Shafer-Weaver, K. A. Immunity to murine prostatic tumors: continuous provision of T-cell help prevents CD8 T-cell tolerance and activates tumor-infiltrating dendritic cells. Cancer Research. 69, 6256-6264 (2009).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Riboldi, E., Shafer-Weaver, K. A., Stagliano, K. E. R., Sklavos, M. M., Ambs, S., Yagita, H., Hurwitz, A. A. Foxo3a programs tumor associated dendritic cells to become tolerogenic in Human and Murine Prostate Cancer. Journal of Clinical Investigation. 121, (2011).
- Shafer-Weaver, K. A., Hurwitz, A. A. Tumor-Specific CD8+ T Cells Infiltrating Prostatic Tumors are Induced to Become Suppressor Cells. , (2009).
- Singh, V., Ji, Q., Feigenbaum, L., Leighty, R. M., Hurwitz, A. A. Melanoma progression despite infiltration by in vivo-primed TRP-2-specific T cells. J. Immunother. 32, 129-139 (2009).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
- Hurwitz, A. A., Foster, B. A., Allison, J. P., Greenberg, N. M., Kwon, E. D. The TRAMP mouse as a model for prostate cancer. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 20, (2001).
