Abstract
Les tumeurs de créer un microenvironnement unique, immunosuppresseur (microenvironnement de la tumeur, TME) selon laquelle les leucocytes sont recrutés dans la tumeur par des chimiokines et divers facteurs de croissance de 1,2. Cependant, une fois dans le TME, ces cellules perdent leur capacité à promouvoir immunité anti-tumorale et de commencer à soutenir la croissance de la tumeur et réguler à la baisse anti-tumoraux des réponses immunitaires 3-4. Les études sur les leucocytes associés à la tumeur ont été principalement axées sur des cellules isolées à partir de la tumeur les ganglions lymphatiques ou la rate en raison des difficultés inhérentes à l'obtention du nombre de cellules et une pureté suffisantes de la tumeur primaire. Tout en identifiant les mécanismes d'activation cellulaire et le trafic à travers le système lymphatique de souris porteuses de tumeurs est importante et peut donner un aperçu de la cinétique de la réponse immunitaire au cancer, dans notre expérience, de nombreux leucocytes, y compris les cellules dendritiques (DC), dans la tumeur de drainage ganglions lymphatiques ont un phénotype différent de ceux qui infiltrent les tumeurs 5,6. Par ailleurs, nous l'avons déjà démontré que adoptive transféré des cellules T isolées de la tumeur des ganglions lymphatiques drainant ne sont pas tolérantes et sont capables de répondre à une stimulation secondaire in vitro contrairement aux cellules T isolées de la TME, qui sont rendues tolérantes et incapable de prolifération ou de cytokine la production 7,8. Fait intéressant, nous avons montré que la modification du microenvironnement de la tumeur, telles que la fourniture de cellules CD4 + T auxiliaires par l'intermédiaire d'un transfert adoptif, favorise cellules T CD8 + à maintenir pro-inflammatoires fonctions effectrices 5. Les résultats de chacune des études mentionnées précédemment démontrent l'importance de mesurer les réponses cellulaires à partir de TME-cellules immunitaires infiltrant par opposition aux cellules qui restent dans la périphérie. Pour étudier la fonction des cellules immunitaires qui infiltrent les tumeurs en utilisant le système d'isolation Miltenyi Biotech 9, nous avons modifié et optimisé cette procédure d'isolement à base d'anticorps pour obtenir très epopulations nriched de cellules présentatrices d'antigènes tumoraux et spécifiques de l'antigène de lymphocytes T cytotoxiques. Le protocole comprend une dissection détaillée du tissu prostatique murin à partir d'un modèle de tumeur de la prostate spontané (adénocarcinome transgénique de la souris de la prostate-TRAMP) 10 et un mélanome sous-cutanée (B16) modèle de tumeur suivie d'une purification ultérieure de diverses populations leucocytaires.
Protocol
1. Isolement des cellules myéloïdes à partir de tumeurs de la prostate TRAMP
- Toutes les procédures ont été réalisées sous la supervision d'un comité d'examen des animaux. Souris TRAMP développent spontanément des tumeurs de la prostate autochtones à la suite d'un transgène (SV40) contrôlée par le promoteur probasine 10. Toute la souris mâle peut être utilisé pour cette procédure. Bien que les tumeurs TRAMP peuvent être récoltées à n'importe quel âge, il convient de noter que TRAMP tumeurs prostatiques restent généralement jusqu'à ce que les petites souris atteindre des âges de plus de 20 semaines. Euthanasier les souris par le CO 2 asphyxie. Retirez le tractus urogénital (UGT), en coupant ouvert la cavité péritonéale et en tirant le tissu adipeux. Le tissu adipeux est mousseuse, tissus brillant avenir.
- Localisez la vessie, il se trouve directement entre les deux grandes, blanches vésicules séminales. Tenez la vessie avec une pince. Garder les ciseaux fermés, lisser le tissu adipeux et de localiser l'urètre. Réduire le urethra aussi près de la ceinture pelvienne que possible et de rompre le canal déférent. Tout en réduisant, en même temps tirer sur la vessie. Cela libérera de l'UGT ensemble qui peut désormais être micro-disséqués pour obtenir chacun des lobes de la prostate.
- Placez l'UGT à la température ambiante PBS. Utilisez un microscope à dissection pour visualiser l'UGT et déblayer tout tissu adipeux en excès. En utilisant le forceps, s'accrocher à l'urètre et de recueillir les lobes ventraux, latérale et antérieure de la prostate. Placez le tissu dans du PBS pendant que vous recueillir le reste des lobes.
- Retirez les vésicules séminales et les jeter.
- Tournez le tissu restant à 180 °. Recueillir la glande ampullaire et des lobes de la prostate dorsale.
- En utilisant le forceps, démêler le tissu de la prostate et le placer dans la digestion (dissociation) de mémoire tampon.
- Tissu tumoral place dans 1 ml de tampon de dissociation (100 U / ml de collagénase de type IV et 100 pg / ml dans du RPMI + DNase FBS 10%). Chaque tumeur peut require uniques des conditions de dissociation, car TRAMP tumeurs prostatiques, utiliser 1 ml et pour les tumeurs B16, utilisez 5 ml (voir ci-dessous). Remarque: la note de la collagénase (I-IV) dépendra de la population de cellules d'être isolé, isolement cellulaire myéloïde est le meilleur avec le type IV, alors que le rendement est plus élevé en utilisant des lymphocytes de type I.
- Placer le tube à 37 ° C incubateur pendant 30 min.
- Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette de 1 ml pour obtenir une suspension de cellules coulant facilement unique.
- Filtrer à travers la suspension filtre 70 microns et laver 3x avec le tampon de séparation MAC complété avec FBS 10% pour l'isolement des cellules myéloïdes.
- Centrifuger la suspension de cellules à 400 xg pendant 10 min. Puis rincer le culot avec 10 ml de tampon MAC et centrifuger à nouveau avec les mêmes paramètres.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 ul de tampon MAC. Ensuite, ajoutez 1 ug anti-CD16/32 anticorps (Ac) par 10 8 cellules (200 pi 2.4.G2 culture surnageant d'hybridome) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Remarque: te montant du FcR-γ anticorps bloquant (Ab) à ajouter peut varier en fonction de la fréquence / nombre de FcR-y + de cellules dans le tissu et le volume de la suspension cellulaire et, par conséquent, cette étape peut nécessiter l'optimisation.
- Ajouter 100 ul de «Pan-DC" ou 10 ul d'anticorps anti-CD11b, anti-CD11c ou anti-PDCA-1 microbilles par 10 8 cellules totales, en fonction de la population cellulaire désirée. Remarque: le montant de microbilles requises peuvent varier en fonction de la fréquence / nombre de cellules de la population souhaitée dans le tissu, par conséquent, cette étape peut nécessiter l'optimisation.
- Bien mélanger en douceur feuilletant tube (ne pas Vortex) et incuber pendant 15 min à 4-8 ° C, à l'abri de la lumière. Ne pas incuber sur de la glace.
- Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MAC. Centrifuger à 400 xg pendant 10 min.
- Verser le surnageant et remettre en suspension les cellules complètement dans 500 ul de tampon MAC. Suspensions de cellules tumorales de mieux circuler à travers les colonnes LC. (Autreschoix: MS, LS, LD).
- Appliquer une nouvelle colonne à l'séparateur magnétique. Premier de la colonne par rinçage avec une quantité appropriée de tampon MAC pour la colonne sélectionnée: Pour LC et colonnes MS utiliser 500 pi. Pour LS ou LD colonnes utiliser 1 ml. Après l'amorçage de la colonne, appliquer la suspension de cellules sur le sommet de la colonne. Utilisez une colonne pour chaque 1 x 10 8 cellules.
- Recueillir cellules non marquées (pass-through) et laver la colonne d'un minimum de trois (jusqu'à cinq) fois avec 500 ul de volume pour un total de 1,5-2,5 ml de fluide de lavage. Effectuer laver l'étape 1 par addition de tampon MAC à la colonne, il est important de garder la colonne qui coule. Dès que la colonne coule la dernière goutte, ajouter plus de mémoire tampon. Ne pas laisser reposer la colonne débit ou sans lui permettre de fonctionner à sec (cela ne peut pas être sous-estimée, comme le séchage de la colonne peut ruiner la pureté et entraîner une perte importante de la viabilité cellulaire.). Pour l'étape 2 de lavage, rincer la colonne avec un tampon de dissociation mélange (contenant de la collagénase + DNase que dedécrite à l'étape 1.7), ce qui sert comme une étape "plus sévère" de lavage pour rincer les débris collant de morts ou mourants cellules tumorales. Effectuer laver l'étape 3 avec le tampon MAC, si le débit à travers n'a pas l'air tout à fait clair, après l'étape 3 de lavage, continuer à laver pour 2 étapes de lavage supplémentaires avec MAC tampon (pour un total de 5 lavages). Pour les tumeurs sous-cutané grandes (par exemple, B16 mélanome), au cours de la dernière étape de lavage, appliquer une légère pression avec un doigt gantée à la partie supérieure de la colonne; ce libère les débris d'appoint pour un aspirateur, purifié population de cellules. Cette étape n'est pas nécessaire pour les tumeurs des tissus solides tels que la prostate, mais plutôt d'utiliser les étapes de lavage supplémentaires, se laver un total d'au moins 5-6 fois.
- Retirer la colonne du séparateur magnétique et placez-le sur un tube de collecte approprié. Introduire à la pipette 2 ml de tampon sur la colonne. Recueillir les cellules marquées magnétiquement en appliquant fermement le piston fourni à la colonne.
- Comptez le nombre de cellules et de confirmer la pureté de la population de cellules sélectionnée pars'écouler l'analyse cytométrique. Pour l'identification des populations de DC, les marqueurs CD45 proposées comprennent, CD11c, PDCA-1, B220 et CD11b. Marqueurs des macrophages suggérées comprennent CD45, CD11b, F4-80, et Ly6C.
2. Isolement des cellules T transférées adoptive de tumeurs sous-cutanées de mélanome B16
Ce protocole fonctionne mieux avec des tumeurs qui sont de 250 mm 2 ou moins (estimée par la mesure des diamètres bissecteurs de la tumeur).
- B16 cellules tumorales ont été injectées par voie sous cutanée dans C57BL / 6 et des mesures tumorales ont été enregistrées tous les 2 jours 8. Souris présentant des tumeurs mesurant 250 mm 2 sont euthanasiés par asphyxie de CO 2. Utilisation autoclave instruments chirurgicaux rincés avec 70% ETOH, coupé en petits tumeur (<3 mm) et incuber en morceaux 5 ml de solution de dissociation (milieu RPMI supplémenté avec 5% de FBS, la collagénase de type I (200 U / ml) et DNase I (100 ug / ml)) pendant 30 min à 37 ° C, de pipetage (en utilisant un μ 1000pointe de la pipette l) et de vortex toutes les 10 minutes pendant l'incubation. Si les cellules myéloïdes sera ensuite isolé, substituer 5% de FBS et de la collagénase de type I avec 10% de FBS et de la collagénase de type IV (200 U / ml), respectivement.
- Après incubation, passer la suspension de cellules à travers une passoire 70 um cellules et laver deux fois avec 10 ml de tampon MAC (préparé selon les instructions du fabricant, Miltenyi Biotech). En option - pour les tumeurs de très grandes (> 300 mm 2), les cellules inflammatoires peuvent être pré-enrichi par centrifugation en gradient de densité (Percoll ou Ficoll).
- Aspirer le surnageant du lavage et ajouter 1 ug anti-CD16/32 antibody/10 8 cellules (200 pi de surnageant de culture clone 2.4.G2) et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Sans lavage, ajoutez 1 ug d'anticorps anti-Thy1.1 PE par 10 8 cellules, bien mélanger doucement par feuilletant le tube et incuber pendant 30 minutes sur la glace, à l'abri de la lumière.
- Laver les cellules pour enlever non liée prianticorps primaire en ajoutant 10 ml de tampon MAC et centrifuger à 400 xg pendant 5 minutes.
- Aspirer le surnageant et ajouter 20 ul anti-PE microbilles (Miltenyi Biotech) par 10 7 cellules totales, selon les instructions du fabricant.
- Bien mélanger en douceur feuilletant tube (ne pas vortexer) et incuber à 4 ° C (ne pas utiliser de la glace) pendant 15 minutes, à l'abri de la lumière. Attention: vortex peut diminuer l'intégrité des perles.
- Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MAC et centrifuger à 400 xg pendant 5 minutes.
- Aspirer le surnageant des cellules, et remettre en suspension dans 500 ul de tampon MAC. Pour les tumeurs de plus grande taille (> 300 mm 2), utiliser 1 ml de tampon.
- Placez une LC (Large Cell) de colonne dans le séparateur de champ magnétique. Suspensions cellulaires tumorales mieux circuler à travers ces colonnes. Rincer la colonne avec tampon de 500 ul MAC pour amorcer la colonne. La plupart des tumeurs aussi circuler à travers LS et LD colonnes, mais exigent en outre la digestion et mécanique disruption pour atteindre le niveau approprié de suspension cellulaire unique. Laver la colonne avec 1 ml de tampon MAC pour amorcer la colonne.
- Appliquer une suspension de cellules sur la colonne et laisser s'écouler à travers complètement (sans laisser couler le colonne sèche). Ensuite, laver avec tampon de 500 ul MAC, et répéter le lavage 3x. N'ajoutez nouveau tampon lorsque le réservoir de la colonne est vide, mais ne laissez pas la colonne se tenir debout sans débit. Cela entraînera le colmatage et la pureté diminuée.
- Il s'agit d'une étape cruciale pour les grandes tumeurs sous-cutanées: Après la dernière étape de lavage, avec un bout de doigt ganté, appliquer une légère pression vers le haut de la colonne tout en restant sur le séparateur magnétique. Cela libère les débris supplémentaire pour une population plus purement enrichi. Ensuite, lavez la colonne 1 de plus de temps avec tampon de 500 MAC ul.
- Retirer la colonne du séparateur et le placer dans un endroit propre 15 ml tube conique, ajouter 2 ml de tampon MAC sur la colonne. Rincez le magnétiquement marqué cells en le poussant fermement le piston dans la colonne.
- Centrifuger la fraction éluée à 400 xg pendant 5 min. Pureté à cette étape est généralement comprise entre 75-80%. Pour atteindre la pureté> 90%, répétez la procédure de séparation magnétique tel que décrit à l'étape 1.10 à 1.12 en utilisant une nouvelle colonne MS. La colonne MS est plus petit et plus compact, la suspension se déroulera plus lentement à travers la colonne, mais donnera un plus grand nombre et de la pureté de la cellule d'intérêt.
- Comptez le nombre de cellules pour d'autres expériences et de vérifier la pureté par analyse en cytométrie de flux. Pour l'isolement de cellules T transférées adoptive tels que ceux décrits dans le présent protocole, des marqueurs alléliques pour l'identification comprennent CD45 et Thy1.1 (cellules transférées) et Thy1.2 (accueil des cellules T).
3. Les résultats représentatifs
Le rendement d'une population cellulaire particulière (c.-à-macrophages, les lymphocytes T, les DC, etc) peut varier en fonction de la taille de la tumeur et les traitements qui étaient d'administrationgistrée pendant la croissance tumorale. Un la prostate d'un non traitée 14-16 semaines souris TRAMP ancienne devrait produire entre 8x10 5-1x10 6 CD11c + / PDCA-1 + (DC) à cellules pureté de 90-95% ou 1x10 6-1.5x10 6 F4/80 + / CD11b + (macrophages) à une pureté de 80-90% de 300 mg de tissu selon le protocole d'isolement ci-dessus comme le montre la figure 1. Le nombre de chacun de ces cellules augmente légèrement après le transfert adoptive de tumeur-antigène des cellules T spécifiques. Pauvre pureté est généralement le résultat d'un lavage insuffisant, ce qui permet la colonne pour sécher (ce qui peut entraîner une rétention des débris de tumeur dans la colonne), ou l'insuffisance de blocage récepteur Fc.
De même, les cellules total isolé à partir B16 tumeurs varie également en fonction de la taille de la tumeur au moment de la récolte des tissus et le transfert adoptif de cellules T (transfert de 5x10 6) avec ou sans vaccin DC (transfert de 1x10 5). Très peu d'antigène SPEspécifiques des cellules T infiltrent la tumeur à moins d'un vaccin d'antigène DC pulsé est également donnée un jour après le transfert de cellules T. Si un vaccin DC est administré à une souris portant une petite, palpable (<50 mm 2) la tumeur, un rendement d'environ 3x10 5 cellules Thy1.1 T +, avec une pureté de 80-85%, serait considérée comme une bonne " "récolter comme le montre la figure 2A. Toutefois, si les tumeurs plus volumineuses sont récoltées, le rendement total et la pureté sera réduit.
Macrophages (F4/80 + / CD11b +) sont généralement un pourcentage plus faible des cellules totales dans B16 tumeurs. La figure 2B montre que l'utilisation de CD11b, d'une tumeur qui est de 250 mm 2, on obtient environ 1x10 6 macrophages à la pureté de 90-95% . En outre, des spectacles figure 2B que la population continue à B16 tumeurs sont hétérogènes. Contrairement aux tumeurs de la prostate, deux sous-populations: CD11c + / PDCA-1 + (plasmacytoïdes DC) et CD11c+ / PDCA-1 - (classique DC) peut être obtenu à partir de tumeurs de mélanome B16. On estime que 6 2x10 4x10 6 PDC et CDC sont attendus à partir de 250 mm 2 B16 tumeurs à la pureté de 80-90%. Réduction de pureté est généralement le résultat de ne pas effacer les cellules des tumeurs de la colonne. Étape 2.12 est une étape cruciale pour enlever le petit bouquet de cellules de mélanome qui persiste à la base de la colonne. Après cette étape améliore l'efficacité des étapes de lavage et les résultats de meilleure pureté.
Figure 1. PED (CD11c + / PDCA-1 +) et les macrophages (F4/80 + / CD11b +) ont été isolés à partir d'une tumeur de la prostate TRAMP. Les valeurs en points représentent le pourcentage de cellules d'intérêt pré-ou post-purification.
Figure 2. (A) AdoptivEly transférés Thy1.1 + / T CD8 + et (B) Les cellules myéloïdes, y compris CD11c + / PDCA-1 + plasmacytoïdes PED, CD11c + / PDCA-1 - PED classiques et F4/80 + CD11b + ou des macrophages ont été isolés à partir de sous-cutanée B16 tumeur de mélanome de souris + de Thy1.2. Les valeurs en points représentent le pourcentage de cellules d'intérêt pré-ou post-purification.
Discussion
Ce protocole peut être modifiée, sur la base de la taille et la source de la tumeur (sous-cutanée, une tumeur spontanée, ou des tumeurs orthotopiques). Pour les tumeurs plus volumineuses, il est recommandé d'augmenter la quantité de tampon de dissociation, tampon MAC, et le nombre de lavages. La cordialité des cellules isolées peut dépendre de la TME à partir de laquelle ils sont enrichis. Par exemple, dans notre expérience, les cellules isolées à partir de tumeurs de la prostate spontanés nécessitent plus doux que la dissociation des cellules isolées de tumeurs sous-cutanées de mélanome B16. Au cours de la dissection de la tumeur, éliminer le tissu adipeux beaucoup, la peau, ou d'autres débris qui peuvent empêcher efficacement la dissociation enzymatique. Il est essentiel de digérer complètement les masses tumorales et d'obtenir une suspension cellulaire unique pour assurer une bonne étiquetage Ab et à empêcher les colonnes de colmatage. Pour l'isolement des cellules myéloïdes, la quantité de sérum de veau foetal recommandé dans le tampon d'isolement MAC a été augmenté de 2% à 10% afin d'améliorer la viabilité des cellules. Il est également essential de garder tous les tampons et les cellules froides tout au long du protocole visant à prévenir la non-spécifique Ab lier et de colmatage de la colonne. En conclusion, pour obtenir des populations hautement enrichi de cellules présentatrices d'antigènes tumoraux et spécifiques de l'antigène des lymphocytes T cytotoxiques, nous avons modifié et optimisé une procédure d'isolement à base d'anticorps en utilisant la technologie Miltenyi Biotech. En utilisant ce protocole, les deux populations adoptive transférés et endogènes de leucocytes peut être enrichi en utilisant Abs dirigés contre des marqueurs de surface cellulaire spécifiques de type. Un avantage des procédures décrites est la réduction des débris tumeur report après lavage approfondi et rigoureux. Cela comprend l'utilisation de la collagénase dans le tampon de lavage ainsi que l'identification d'un point à partir duquel une pression supplémentaire à la colonne permet d'éliminer des sabots de colonne par les cellules tumorales. L'obtention d'un nombre suffisant de cellules immunitaires provenant de tissus, en particulier à une pureté qui est adapté à l'analyse fonctionnelle, peut être une tâche difficile.Cependant, dans notre expérience, le protocole donne ici le plus grand nombre de cellules, à la plus grande pureté, avec le plus de consistance.
Disclosures
Les auteurs n'ont aucune divulgation pertinents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Scott Durham pour l'examen du manuscrit et de la vidéo. Ce travail est soutenu en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, NCI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
References
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