Abstract
leukocytes는 다양한 chemokines과 성장 요인의 1,2에 의해 종양으로 모집 의하여 종양 독특한 면역 microenvironment (종양 microenvironment, TME)을 만듭니다. 하지만 일단 TME에서 이러한 세포는 안티 종양 면역을 촉진하고 종양 성장을 지원하고 안티 - 종양 면역 반응 3-4 아래쪽 규제하기 시작하는 능력을 잃게됩니다. 종양 - 관련 leukocytes에 관한 연구는 주로 격리 세포에 초점을했습니다 종양 - 배수 일차 종양에서 충분한 세포 숫자와 순결을 취득에서 고유의 어려움으로 인해 림프절이나 비장을. 종양 베어링 마우스의 림프 시스템을 통해 셀 활성화 및 인신 매매의 메커니즘을 파악하는 것이 중요하며 암에 면역 반응 속도론에 통찰력을 줄 수 있지만, 우리의 경험에서 돌기 세포 (DC가) 포함하여 많은 leukocytes는 종양 - 배수 임파선의 종양에게 5,6 침투하여 그 이외의 다른 표현형을 가지고. 더욱이, 우리는 이전에 격리 T 세포를 adoptively - 전송되는 보여준 종양 - 배수 림프절 것은 tolerized 및 tolerized 및 확산 또는 시토킨 수가 없다는 것입니다 TME 격리 T 세포, 달리 체외에서 보조 자극에 반응 능력이되지 않습니다 생산 7,8. 흥미롭게도, 우리는 그러한 입양 송금 CD4 + T 도우미 세포를 제공하는 등 종양 microenvironment를, 바꾸는 것은 CD8을 촉진하는 + T 세포를 친 염증성 효과기 기능에게 5 유지 나타났습니다. 앞서 언급한 연구 각각의 결과는 주변에 남아있는 세포들은 반대로 TME-침투 면역 세포에서 세포의 반응을 측정의 중요성을 보여줍니다. Miltenyi 생명 공학 격리 시스템 9를 사용 종양에 침투하여 면역 세포의 기능을 연구하기 위해, 우리는 고도로 전자를 얻기 위해이 항체 기반 격리 절차를 수정 및 최적화항원 제시 세포와 종양 항원에 특정한 세포 독성 T의 lymphocytes의 nriched 인구. 프로토콜은 자발적인 전립선 종양 모델 (유전자 변형 마우스 선암 전립선암-계집) 10과 피하 흑색증 (B16) 각종 백혈구 인구의 후속 정화 뒤에 종양 모델에서 murine 전립선 조직의 상세한 해부를 포함합니다.
Protocol
1. 계집 전립선 종양에서 골수양 세포의 분리
- 모든 절차는 동물 검토위원회의지도하에 수행되었다. 계집 생쥐는 자발적 probasin업자 10에 의해 통제 transgene (SV40)의 결과로 autochthonous 전립선 종양을 개발합니다. 모든 남성 마우스가이 절차를 사용할 수 있습니다. 계집 종양이 어느 나이에 수확 수 있지만, 그것은 생쥐 20 주 이상 연령대가보다 도달할 때까지 계집 전립선 종양은 일반적으로 소형 남아 있다고 지적한다. CO 2 질식하여 쥐를 안락사시켜야. 복막 캐비티를 열고 절단하고 지방 조직을 후퇴하여 urogenital 요로 (UGT)를 제거합니다. 지방 조직은 거품, 반짝 이는보고 조직이다.
- 방광을 찾아, 그것은 두 개의 커다란, 흰 정액 vesicles간에 직접 자리잡고 있습니다. 포셉과 방광에 만요. 유지 가위는 지방 조직을 떠나 부드럽고 요도를 찾은 마감했다. U 줄이려고가능한 한 골반 환상 골 가까이로 rethra 및 중이야의 정관을 끊을. 자르고있는 동안 동시에 방광에 올려. 이것은 지금은 전립선의 엽 (叶) 각을 얻기 위해 마이크로 해부 될 수 있습니다 전체 UGT를 발표할 예정이다.
- 방 온도 PBS에서 UGT를 놓습니다. UGT을 시각화하고 과도한 지방 조직을 떠나 취소 해부 현미경을 사용합니다. 집게를 사용하여 요도를 지키고과 전립선의, 복부 측면과 앞부분 엽 (叶)을 수집합니다. 당신 엽 (叶)의 나머지를 수집하는 동안 PBS에서 조직을 놓습니다.
- 정액 vesicles를 제거하고 폐기.
- 남은 티슈 180 °를 돌립니다. ampullary 글랜드 및 지느러미 전립선 엽 (叶)을 수집합니다.
- 집게를 사용하여 전립선 조직을 분열 애타게하고 소화 (분해) 버퍼에 넣습니다.
- 한 ML 분리 버퍼 (100 U / ML Collagenase 유형 IV 및 RPMI + 10% FBS 100 μg / ML DNase)의 장소 종양 조직. 각각의 종양 월 requ분노 고유한 분리 조건은, 계집 전립선 종양에 대해, 1 ML을 사용 B16 종양 들면, (아래) 5 ML을 사용합니다. 참고 : Collagenase (I-IV)의 등급 고립된 것으로 세포 인구에 따라 달라집니다, 림프구 수율 입력 난을 사용하여 높은 반면 골수양 세포 격리는, 유형 IV에 가장 적합
- 37의 장소 튜브 30 분 대한 ° C 배양기.
- 쉽게 흐르는 단일 세포 현탁액을 위해 1 ML 피펫으로 위아래로 피펫.
- 필터 70 미크론 필터를 통해 서스펜션과 골수양 세포 격리 10 % FBS와 보충 맥에서 분리 완충액으로 3 배 씻는다.
- 10 분 400 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 그렇다면 10 ML 맥을 버퍼와 펠렛을 씻어 동일한 설정으로 다시 원심 분리기.
- 100 μl 맥에서 버퍼에 세포 펠렛을 Resuspend. 다음으로, 10 8 셀 (200 μl 2.4.G2 하이 브리 도마 문화 뜨는) 당 1 μg anti-CD16/32 항체 (AB)를 추가하고 10 분 동안 상온에서 품어. 참고 : T그는 추가되는 FcR-γ 차단 항체 (AB)의 양은 조직의 주파수 / 횟수 FcR-γ + 세포와 세포 현탁액의 볼륨에 따라 다를 수 있으므로이 단계는 최적화가 필요할 수 있습니다.
- "팬-DC"100 μl 또는 안티 CD11b, 안티 CD11c 또는 방지 PDCA-1 원하는 세포 인구에 따라 10 8 합계 셀 당 MicroBeads. 10 μl를 추가하십시오 참고 : 필요한 MicroBeads의 금액 조직에서 원하는 인구의 세포의 빈도 / 수를 따라 달라질 수 있으며, 따라서이 단계에서 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 부드럽게 튜브 (소용돌이하지 않음) flicking에 의해 잘 섞어서 빛으로부터 차폐 4-8 ° C에서 15 분, 위해 알을 품다. 빙판에 부화하지 마십시오.
- 맥에서 버퍼 10 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 완전히 뜨는을 붓고 맥 버퍼 500 μl의 세포를 resuspend. 종양 세포 현탁액은 LC 컬럼을 통해 더 흘러. (다른선택 : MS, LS, LD).
- 자석 분리기에 새로운 컬럼을 적용합니다. 프라임은 선택한 열에서 Mac 용 버퍼의 적절한 금액으로 rinsing에 의한 칼럼 : LC와 MS 열을는 500 μl를 사용합니다. LS 혹은 LD에 대한 열이 1 ML을 사용합니다. 마중물 칼럼 후, 열 상단에 세포 현탁액을 적용합니다. 매 1 X 10 8 세포에 대해 하나의 컬럼을 사용합니다.
- 레이블이 지정되지 않은 세포를 (통과)를 수집 및 유체 세척 1.5-2.5 ML 총 500 μl 볼륨과 열의 세 (최대 5) 시대의 최소 씻는다. 칼럼에 맥을 버퍼를 추가하여 1 단계를 씻어 수행, 그것은 열이 흐르는 유지하는 것이 중요합니다. 즉시 열이 마지막 한 방울까지 drips로 더 많은 버퍼를 추가합니다. 유동없이 열 이러고하거나 (이것은 순결을 망치와 세포 생존 능력의 상당 손실로 이어질 수있는 칼럼의 건조로서, understated 수 없습니다.) 건조를 실행하도록 허용하지 마십시오. 세차 단계 2 (드로서 Collagenase + DNase를 포함하는 분리 버퍼 믹스로 열을 헹굼단계 1.7)에 scribed,이 죽었거나 죽어가는 종양 세포에서 끈적끈적한 부스러기를 제거하기 위해 "엄격한"세차 단계로서의 역할을합니다. 맥에서 버퍼와 3 단계를 씻어 수행;을 통해 흐름 세척 3 단계 이후에 완전히 명확 보이지 않는 경우, 맥 버퍼 (5 세차장의 총) 2 추가 세척 단계를위한 세차로 진행합니다. 대형 피하 종양의 경우 (예 : B16 흑색증), 마지막 세탁 단계 동안, 열의 가기 장갑 낀 손가락으로 부드럽게 압력을 적용,이 세포 인구를 정화, 청소기를 위해 여분의 파편을 출시. 이 단계 등 전립선과 같은 견고한 조직 종양 필요하지 않습니다, 대신, 적어도 5-6 총 회 세척, 세차 추가 단계를 사용하십시오.
- 마그네틱 분리기에서 컬럼을 제거하고 적절한 회수 관에 배치하십시오. 열 고정 버퍼의 피펫이 ML. 단단히 칼럼과 함께 제공된 플런저를 적용하여 자기 (磁 气)라고 표시된 세포를 수집합니다.
- 하여 세포 수를 계산하고 선택한 셀 인구를 위해 순결을 확인cytometric 분석을 흘러. 직류 인구의 식별 들어, 제안된 마커는 B220와 CD11b CD45, CD11c, PDCA-1을 포함합니다. 제안 대식 세포 마커는 CD45, CD11b, F4-80, 그리고 Ly6C를 포함합니다.
2. 피하 B16 흑색증 종양에서 Adoptively 전송되는 T 세포의 분리
이 프로토콜은 250mm 2 또는 (종양 bisecting 직경을 측정하여 추정) 적은 종양 함께 잘 작동됩니다.
- B16 종양 세포는 C57BL으로 subcutaneously 주입되었다 / 6 마우스 및 종양 성능은 매 2 일간 8을 기록했다. 250mm 2를 측정하는 악성 종양으로 마우스는 CO 2 질식에 의해 euthanized있다. 70% ETOH로 씻어서 autoclaved 수술 도구를 사용하여 작은 (<3mm) 조각으로 종양을 잘라 5 ML 분해 용액 (RPMI 배지 5 % FBS, Collagenase 유형 나 (200 U / ML)와 DNase I (100 μg으로 보충에 품어 37 30 분 ° C, 용 / ML)가) (1,000 μ를 사용 Pipetting난 pipet 팁) 및 부화 도중에 10 분마다 vortexing. 골수양 세포가 연속적으로 고립되는 경우 FBS 및 Collagenase 10 % FBS 각각 Collagenase 유형 IV (200 U / ML)로 나를 입력 5 %를 대체.
- 부화 후 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과하고 10 ML 맥에서 버퍼 (제조 업체의 지침, Miltenyi 생명 공학 당 준비)로 두 번 씻는다. 선택 사항 - 매우 큰 종양을 위해 (> 300mm 2), 염증 세포 밀도 기울기 원심 분리를 (Percoll 또는 Ficoll)를 사용하여 미리 풍부하게 할 수 있습니다.
- 세차 뜨는을 대기음 1 μg anti-CD16/32 antibody/10 8 세포 (클론 2.4.G2 문화 뜨는 200 μl) 추가하고 10 분 동안 상온에서 품어.
- 세탁없이 부드럽게 빛을 차단할 얼음에서 30 분 동안 관과 부화를 flicking하여 잘 섞어, 10 8 셀 당 1 μg 안티 Thy1.1 PE 항체를 추가합니다.
- 언바운드 PRI를 제거하는 세포를 씻으15 분 400 XG 10 ML 맥을 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 메리 항체.
- 뜨는을 대기음 및 제조 지침에 의하면, 10 7 전체 세포 당 20 μl 방지 PE microbeads를 (Miltenyi 생명 공학) 추가합니다.
- 부드럽게 튜브 (와동하지 않음) flicking에 의해 잘 섞어서 4에 품어 ° C에서 빛으로부터 차폐된 15 분 동안 (얼음을 사용하지 마십시오). 주의 : vortexing은 구슬의 무결성을 축소하실 수 있습니다.
- 15 분 400 XG에 맥을 버퍼와 원심 분리기 10 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오.
- 500 μl 맥에서 버퍼에 뜨는, 그리고 resuspend 세포를 기음. 큰 크기 (> 300mm 2) 종양의 경우, 1 ML 버퍼를 사용합니다.
- 자기장 분리기에 놓으 LC (대형 셀) 칼럼. 종양 세포 현탁액이 컬럼을 통해 최선을 흘러. 열을 프라임 500 μl 맥에서 버퍼로 컬럼을 씻어. 대부분의 종양은 또한 LS와 LD 열 (Column)을 통해 흐름,하지만 더 소화 및 기계적 d를 요구합니다단일 세포 현탁액의 적정 수준을 달성하기 isruption. 컬럼을 수상하는 데 1 ML 맥을 버퍼로 컬럼을 씻으십시오.
- 칼럼에 세포 현탁액을 적용하고 (열 실행 건조시키는없이) 완전히 통해 흐를 수 있습니다. 다음, 500 μl 맥 버퍼로 씻고, 그리고 배 세척 반복한다. 만 열 저수지가 비어있을 때 새로운 버퍼를 추가할 수 있지만 열에 흐름없이 서있하지 않습니다. 이것은 막힘 및 줄었 순결을 초래하게됩니다.
- 이것은 대형 피하 종양을위한 중요한 단계입니다 : 마지막 세척 단계 후, 장갑 낀 손가락 팁 함께 자성 분리기에 한동안 여전히 열 상단에 부드러운 압력을 적용합니다. 이것은 순전히 더 풍부한 인구를위한 여분의 파편을 출시. 다음, 500 μl 맥 버퍼로 열에 한 번 더 씻는다.
- 구분에서 컬럼을 제거하고 깨끗한 15 ML 원뿔 튜브에 넣고, 열을에 두 ML 맥을 버퍼를 추가합니다. 자기 (磁 气) - 라벨 cel을 플러시단단히 열에 플런저를 밀어인가요.
- 5 분 400 XG에 eluted 소수를 원심 분리기. 이 단계에서 순도는 일반적으로 75-80% 사이입니다. > 90 % 순도를 달성하려면, 같은 새 MS 컬럼을 사용하여 단계 1.10-1.12에서 설명한 자기 분리 절차를 반복하십시오. MS 열에는 현탁액이 칼럼을 통해 더 느리게 실행됩니다 있도록 더 작고 컴팩트하지만, 높은 숫자와 관심 세포의 순도를 얻을 것입니다.
- 추가 실험을 위해 휴대폰 번호를 백작과 흐름 cytometric 분석에 의해 순도를 확인합니다. 이와 프로토콜에 설명된 것과 adoptively 양도 T 세포의 격리 내용 확인을위한 allelic 마커는 CD45과 Thy1.1 (양도 세포)와 Thy1.2 (호스트 T 세포)를 포함합니다.
3. 대표 결과
특정 세포 인구 (즉, macrophages, DC, T 세포 등)의 생산량은 종양의 크기와 관리자했다 트리 트먼트에 따라 달라집니다종양이 성장하는 동안 istered. 치료 14~16주 옛 계집 마우스의 전립선은 5-1x10 6 CD11c + / PDCA-1 90~95% 순도 또는 1x10 6-1.5x10 6 F4/80에서 + (DC) 세포 + / CD11b 8x10과 사이에 양보해야 + (macrophages) 티슈 300 MG 80-90% 순도의은 그림 1에 나타난 위의 절연 절차를 따르는. 이들 세포의 각각의 숫자가 약간 종양 - 항원 특정 T 세포의 입양 전송에 따라 증가합니다. 나쁨 순도는 (열에 종양 부스러기 보존이 발생할 수 있음) 열에 건조 있도록, 보통 불충 분한 세척의 결과이다, 또는 부족 FC 수용체가 차단.
마찬가지로, B16 종양으로부터 격리 총 세포는 또한 조직의 수확 시간 및 DC 백신 여부에 상관없이 T 세포 (5x10 6 환승) (1x10 5 송금)의 입양 전송에서 종양의 크기에 따라 달라집니다. 아주 몇 가지 항원-spe항원 펄스 직류 백신도 T 세포 전송 후 하루 주어진 경우를 제외하고 cific T 세포는 종양에 침투. DC 백신은 작고, 만져서 알 수있는 (<50mm 2) 종양을 간직한 마우스, 80~85%의 순도로 약 3x10 5 Thy1.1 + T 세포의 수율로 관리되는 경우, "좋은 간주됩니다 "같은 그림 2A에 표시된 수확. 큰 종양이 수확되는 경우에는 총 수율과 순도가 감소됩니다.
Macrophages (F4/80 + / CD11b +) 보통 B16 종양의 전체 세포의 작은 비율입니다. 그림 2B는 종양에서 CD11b를 활용하는가 250mm이 있는지 보여줍니다 90~95% 순도로 약 1x10 6 macrophages를 얻을 . B16 종양의 직류 인구가 이질적인 것을 또한 그림 2B 프로그램. 전립선 종양, 두 subpopulations 달리 : CD11c + / PDCA-1 + (plasmacytoid DC)와 CD11c+ / PDCA-1 - (종래의 직류)은 B16 흑색증 종양에서 얻을 수있다. 예상 2x10 6 PDC와 4x10 6 CDC는 80~90% 순도에서 250mm 2 B16 종양으로 예상된다. 절감 순도는 일반적으로 기둥에서 종양 세포를 청소하지 않은 결과입니다. 단계 2.12이 칼럼의 기지에서 지속 흑색증 세포의 작은 덩어리를 제거하는 중요한 단계입니다. 이 단계를 따르면 더 순도의 세척 단계와 결과의 효율성을 향상시킵니다.
그림 1. DC가 (CD11c + / PDCA-1 +) 및 macrophages (F4/80 + / CD11b +)은 도라 무통 전립선 종양으로부터 격리되었다. 도트 줄거리 값은 관심을 사전 또는 사후 정화의 세포의 비율을 나타냅니다.
그림 2. () Adoptiv일리는 Thy1.1 + / CD8 + T 세포를 전송하고 (B) CD11c + / PDCA-1을 포함한 골수양 세포 + plasmacytoid DC가, CD11c + / PDCA-1 - 기존의 DCS 및 F4/80 + / CD11b + macrophages는 피하로부터 고립되었다 Thy1.2 + 마우스에서 B16 흑색증 종양. 도트 줄거리 값은 관심을 사전 또는 사후 정화의 세포의 비율을 나타냅니다.
Discussion
이 프로토콜은 종양의 크기와 소스 (피하, 자발적인 종양, 또는 orthotopic 종양)을 기반으로 수정할 수 있습니다. 큰 종양의 경우, 그것은 분리 버퍼, 버퍼 맥, 그리고 세차장 수와 양을 늘릴 것을 권장합니다. 격리 세포의 사귀는 일들이 풍부한되고있는 TME에 따라 수 있습니다. 자발적인 전립선 종양이 피하 B16 흑색증 종양으로부터 격리 세포보다 gentler 분리를 필요로 예를 들면, 우리의 경험에서 세포 고정. 종양의 해부 동안, 많은 지방, 피부, 또는 효과적인 효소 분해를 방지 수있는 다른 파편으로 제거합니다. 그것은 완전히 종양 질량을 소화하고 적절한 순이 라벨을 보장하고 막힘에서 열을 방지하기 위해 단일 세포 현탁액을 얻을 것이 중요합니다. 골수양 세포 분리의 경우 맥 절연 버퍼에 추천 태아 소 혈청의 금액은 세포 생존을 개선하여 2 %에서 10 % 증가했다. 또한 야망이다불특정 AB 바인딩과 칼럼의 막힘을 방지하기 위해 프로토콜 내내 추위 모든 버퍼와 세포를 유지하는 데 ntial. 결론적으로 항원 제시 세포와 종양 항원에 특정한 세포 독성 T의 lymphocytes의 매우 풍부한 인구를 얻으려면, 우리는 수정되고 Miltenyi 생명 공학 기술을 이용한 항체 기반 격리 절차를 최적화했습니다. 이 프로토콜을 활용하여 모두 adoptively 양도 및 내생적인 백혈구 인구는 셀 유형 - 특정 표면 마커 향한 애비를 사용하여 풍부 수 있습니다. 설명된 절차 중 하나 장점은 종양 파편의 감소 광범위하고 엄격한 세탁 따라 기내 끝났습니다. 이것은 세척 버퍼뿐만 아니라 종양 세포에 의해 열 나막신를 없앨 수 컬럼에 강박 관념을 갖게되는 시점의 신분에서 collagenase의 사용을 포함합니다. 특히 기능 분석에 적합한 순도의 조직에서 면역 세포의 충분한 숫자를 취득하는 것은 어려운 작업이 될 수 있습니다.그러나 우리의 경험에서 프로토콜은 본 대부분의 일관성과 함께 최고의 순도에서 세포의 높은 숫자를 얻을.
Disclosures
저자 아무런 관련 공시가 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 원고와 비디오의 검토를 위해 박사 스콧 더럼 감사드립니다. 이 작품은 NIH, NCI의 교내 연구 프로그램에 의해 부분에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
References
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