Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

هذا البروتوكول يركز على الاستفادة من القدرة الكامنة للخلايا الجذعية لاتخاذ جديلة من مصفوفة من خارج الخلية المحيطة بها، ويكون ذلك حافزا على التمايز إلى الظواهر المتعددة. هذا المخطوط طرق تمتد لدينا وصف وتوصيف نموذج الاستفادة من هيدروجيل bilayered، ويتألف من الربط بين الليفين والكولاجين، وإلى وقت واحد شارك في تمييز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة

Abstract

اكتسبت البوليمرات الطبيعية على مر السنين أكثر أهمية بسبب توافق مع الحياة التي تستضيفهم، والقدرة على التفاعل مع الخلايا في المختبر والمجراة. وثمة مجال البحوث التي تبشر بالخير في الطب التجديدي هو استخدام اندماجي من المواد الحيوية الرواية والخلايا الجذعية. استراتيجية أساسية في مجال هندسة الأنسجة هو استخدام ثلاثي الأبعاد سقالة (على سبيل المثال، decellularized المصفوفة خارج الخلية، الهلاميات المائية، مايكرو / نانو جزيئات) لتوجيه وظيفة الخلية. وقد تطورت هذه التكنولوجيا من اكتشاف أن الخلايا في حاجة الى الركيزة التي تقوم عليها يستطيعون الالتزام بها وتتكاثر، والتعبير عن النمط الظاهري الخلوية المتباينة وظيفة 2-3. وفي الآونة الأخيرة، كما قد تقرر أن الخلايا ليس فقط استخدام هذه ركائز للانضمام، ولكن أيضا تتفاعل وتأخذ العظة من الركيزة المصفوفة (على سبيل المثال، المصفوفة خارج الخلية، ECM) 4. ولذلك، فإن الخلايا والسقالات وجود اتصال متبادل أنيعمل للسيطرة على تنمية الأنسجة، وتنظيم، وظيفة في نهاية المطاف. الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من (ASCs) هي الوسيطة، والخلايا الجذعية غير hematopoetic الموجودة في الأنسجة الدهنية التي يمكن أن تظهر نسب متعددة التمايز وتكون بمثابة مصدر متاحة بسهولة من الخلايا (أي ما قبل بطائن الأوعية الدموية وpericytes). فرضيتنا هي التي يمكن أن توجه الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الظواهر المختلفة في اتجاه واحد منهم من قبل المشاركة في زراعة ببساطة في مصفوفات bilayered 1. ويركز مختبر لدينا في التئام الجروح الجلدية. تحقيقا لهذه الغاية، أنشأنا مصفوفة واحدة مركب من المواد الحيوية الطبيعية، الليفين، والكولاجين، والشيتوزان التي يمكن أن تحاكي خصائص ووظائف بيئة جرح جلدي محددة ECM الشفاء.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. عزل الخلايا الجذعية المستمدة من الشحمي (ASCs) 1، 5

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. عزل الدهنية الفئران محيط بالكلية وبربخي وتغسل بمحلول معقم هانك والملح مخزنة (HBSS) التي تحتوي على 1٪ الجنين مصل بقري (FBS) إلى 5 الموصوفة سابقا. وقد أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان، والرفق بالحيوان، واللائحة التنفيذية وفقا لمبادئ دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
  2. فرم الأنسجة ونقل 1-2 غرام في 25 مل من HBSS FBS تحتوي على 1٪ في أنبوب 50 مل و الطرد المركزي في 500 غ لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. جمع الأنسجة الدهنية التعويم الحر لطبقة ونقل إلى دورق مخروطي سعة 125 مل وعلاج مع 25 مل من كولاجيناز من النوع الثاني (200 يو / مل) في HBSS لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية على مدار شاكر (125 دورة في الدقيقة). إزالة بعناية جزء السائل (أقل من النفط والطبقة الدهنية) بواسطة pipeting وتصنف انها بالتتابع من خلال 100 - ميكرومتر و 70 - ميكرومتر النايلون فلتر شبكة. منبذة الراشح في 500 غ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، نضح طاف، ويغسل بيليه مرتين مع 25 مل من HBSS.
  4. Resuspend وبيليه الخلية في 50 مل من متوسط ​​النمو (MesenPRO RS متوسطة بصل) تستكمل مع الملحق MesenPRO النمو RS، مضاد حيوي، مضاد فطري (100 يو / مل من مجموعة البنسلين، 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتومايسين، و 0.25 ميكروغرام / مل من أمفوتيريسين B)، و 2 ملم من الجلوتامين-L وخلايا ماصة في قوارير T75 2 (25 مل / قارورة).
  5. ثقافة ASC في حاضنة 5٪ 2-مرطب ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية (مرور تستخدم 2-4 ASCs لجميع التجارب).

2. إعداد الشيتوزان المجهرية (يتم أخذ خطوات التنفيذ)

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

    5. استحلب محلول مائي من الشيتوزان (6 مل من الشيتوزان ث / ت 3٪ في 0.5 متر من حامض الخليك) في 100 مل من زيت خليط مرحلة تتكون من زيت فول الصويا، N-الأوكتانول (1:2 V / V) و 5 ٪ صوربيتان-أحادية أوليئات (SPAN 80) مستحلب، وذلك باستخدام النفقات العامة (1700 دورة في الدقيقة)، والتحريك المغناطيسي (1000 دورة في الدقيقة) في وقت واحد في اتجاهين متعاكسين. هذا الأسلوب المزدوج لخلط يضمن أن المذيلات تشكلت في وقت مبكر قبل عبر ربط يحدث يمكن أن تبقى في حل وليس إلى تترسب في القاع. وعلاوة على ذلك، وتحريك شريط المغناطيسي يساعد في اجتثاث تجميع الشيتوزان خلال تشكيل micelle وrigidization.
  1. تحريك الخليط أثار بشكل مستمر لمدة ما يقرب من 1 ساعة حتى يتم الحصول على المياه مستقر في والنفط المستحلب. بدء الأيونية عبر ربط مع إضافة 1.5 مل من هيدروكسيد ث / ت 1٪ البوتاسيوم في N-الأوكتانول كل 15 دقيقة لمدة 4 ساعات (24 مجموع مل)
  2. تجفيف المجالات تعافى في مجفف فراغ وتحليل بدون مزيد من المعالجة. يمكنك تحديد الجسيمات CSM متوسط ​​الحجم والمساحة السطحية لكل مليغرام، وحجم وحدة مكعب باستخدام محلل حجم الجسيمات.
  3. لتجارب لاحقة، وغسل CSM ثلاث مرات بماء معقم لإزالة الأملاح المتبقية وتعقيم بواسطة غسل بين عشية وضحاها مع 5 مل من الايثانول المطلقة.

3. تحديدعدد المجموعات الأمينية الحرة في نظام إدارة إعالة الطفل

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. تحديد عدد من المجموعات الأمينية الحرة في الوقت الحاضر يتم أخذ خطوات التنفيذ بعد الأيونية عبر ربط باستخدام benzenesulfonic trinitro (TNBS) فحص الحمض من Bubnis وOfner 6. احتضان 5 ملغ من المجهرية مع 1 مل من محلول TNBS 0.5٪ في انبوب من الزجاج 50 مل لمدة 4 ساعات في 40 درجة مئوية، ويتحلل مع اضافة 3 مل من حمض الهيدروكلوريك في 6N 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. تبريد عينات لدرجة حرارة الغرفة واستخراج TNBS مجانا عن طريق إضافة 5 مل من الماء منزوع الأيونات و 10 مل من الأثير الإيثيل.
  3. تدفئة قسامة 5 مل من المرحلة المائية إلى 40 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة حتى يتبخر أي الأثير المتبقية، وبارد لدرجة حرارة الغرفة، وتمييع مع 15 مل من الماء.
  4. قياس الامتصاصية في 345 نانومتر مع الطيف باستخدام TNBS حل بدون الشيتوزان كما فارغة والشيتوزان المستخدمة لص CSMتعويض لتحديد العدد الإجمالي للجماعات الأمينية. ويقدر عدد المجموعات الأمينية الحرة المجلس الأعلى للقضاء بالنسبة لالشيتوزان.

4. التحميل ASC في CSM

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. تتوازن 5 ملغ من يتم أخذ خطوات التنفيذ تعقيمها من قسم 2.5 في HBSS العقيمة بين عشية وضحاها وإضافة إلى 8 - ميكرومتر غشاء حجم المسام ثقافة إدراج لوحة (24 لوحة جيد).
  2. بعد أن يتم أخذ خطوات التنفيذ قد استقروا على الغشاء، نضح بعناية HBSS وإضافة 300 ميكرولتر من متوسط ​​النمو الى الداخل من إدراج وميكرولتر 700 من وسائط النمو إلى الخارج من إدراج.
  3. Resuspend ASCs في تركيز مناسب (1 × 04 حتي 04 أكتوبر 10 × 4) في 200 ميليلتر من متوسط ​​النمو والبذور على CSM داخل ثقافة إدراج لوحة. الحجم النهائي من المتوسط ​​في ادخال ثقافة، بعد البذر، هو 500 ميكروليتر.
  4. Incubيأكل من المصنف ASC على يتم أخذ خطوات التنفيذ لمدة 24 ساعة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب عند 37 درجة مئوية.

5. تحديد النسبة المئوية لشركة ASC، وبقاء الخلية في نظام إدارة إعالة الطفل

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. بعد مرور فترة الحضانة، الماصة CSM ASC-تحميل في أنبوب معقم microcentrifuge 1.5 مل من دون إزعاج الخلايا التي هاجرت في غشاء إدراج.
  2. إزالة المتوسطة المتبقية وإضافة 250 ميكرولتر من متوسط ​​نمو جديدة للأنبوب.
  3. إلى كل أنبوب، إضافة 25 ميكرولتر من MTT [3 - (4،5-dimethylthiozole-2-يل) -2،5-diphenyltetrazolium بروميد] حل (5 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 4 ساعات في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 مرطب حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  4. بعد مرور فترة الحضانة، وإزالة المتوسطة، إضافة 250 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل، ودوامة الخليط لمدة 2-5 دقيقة إلى ذوبان مجمع formazan.
  5. أجهزة الطرد المركزي في CSM في 2700 زلمدة 5 دقائق، الماصة قبالة طاف وتحديد الامتصاصية لها طول موجي في 570 نانومتر و 630 باستخدام قارئ لوحة قياسية، وفقا لمواصفات الشركة الصانعة MTT.
  6. تحديد عدد الخلايا المرتبطة يتم أخذ خطوات التنفيذ بالنسبة الى القيم التي تم الحصول عليها من أرقام ASC تعريف المثقف لتطوير منحنى القياسية.

6. تحضير وتوصيف ASC-CSM المضمنة في الربط بين الليفين الهلام

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. البولي ايثيلين غليكول (PEG) الليفين (PEG-الليفين) هيدروجيل أعده سوغز وآخرون 7 بحل succinimidyl غليكول البولي ايثيلين glutarate تعديل (PEG، 3400 دا). باستخدام 4 مل من تريس مخزنة المالحة (TBS، ودرجة الحموضة 7.8)، ومرشح تعقيم مع فلتر 0.22 ميكرون فقط، قبل البدء في التجربة. PEG حل فعال فقط في هذا التطبيق لساعات 3-4 الأولى.
  2. مزيج 500 &مو؛ لتر من مخزون الفيبرينوجين (40 ملغ / مل في TBS، ودرجة الحموضة 7.8) و250μl من الأوراق المالية PEG في ثقافة جيدة من لوحة 6 جيدا والحضانة لمدة 20 دقيقة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب عند 37 درجة مئوية. هذا الخليط يشكل نسبة تركيز ضرس من 01:10، SG-PEG-SG: الفيزيولوجية.
  3. أخذ 250 ميكرولتر من ASC-CSM بتركيز 5 ملغ من CSM، (≈ 2 × 10 4 خلايا) وتخلط مع الحل الفيزيولوجية مضاد للفيروسات.
  4. إضافة على الفور 1 مل من الأوراق المالية الثرومبين (25U/mL) ويسحن بسرعة مرة أو مرتين مع ماصة. بعد خلط ثرومبين مع الفبرينوجين الإكسسوارات، ضع الخليط على الفور خلية جل في لوحة ال 12 جيدا والمحتضنة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب على 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة للسماح للدبق كاملة. منذ ذلك الوقت دبق سريع، لا تحاول باستمرار على حل هلام داخل طرف ماصة لأكثر من 5 ثوان. والمشقوق والفيزيولوجية مضاد للفيروسات بواسطة ثرومبين ويشكل هيدروجيل الليفين مضاد للفيروسات. على هذا النحو، الويشار إلى البريد المنتج هلام نهائي لمثل الربط بين الليفين.
  5. غسل المواد الهلامية الربط بين الليفين مرتين مع HBSS واحتضان وسائل الاعلام مع الحد الأدنى من الضروري ألفا (α-MEM) تستكمل مع FBS 10٪ في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب عند 37 درجة مئوية.
  6. مراقبة الهجرة من الخلايا من CSM في هلام على مدى فترة استمرت 11 يوما باستخدام معيار تقنيات المجهر الضوئي.

7. تحضير وتوصيف ASC-CSM المضمنة في الهلام الكولاجين

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. مزيج ASC-CSM (5 ملغ تحتوي ≈ 2 × 10 4 خلايا) مع الكولاجين من النوع 1 (7.5 ملغ / مل) المستخرج من الأوتار ذيل فأر وفقا لطريقة من بورنستاين (8) وfibrillate بعد تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 6.8 باستخدام 2N هيدروكسيد الصوديوم.
  2. إضافة لييفاتي الكولاجين ASC-CSM الخليط إلى طبق من ذهب 12-جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في humidi 5٪ CO 2fied حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد الرجفان كاملة، واحتضان والمواد الهلامية الكولاجين ASC-CSM لمدة تصل إلى 11 يوما في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب على 37 درجة مئوية.
  4. مراقبة الهجرة من الخلايا من CSM في هلام على مدى فترة استمرت 11 يوما باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية.

8. تطوير Bilayered الربط بين الليفين-(ASC-CSM) التركيبات جل الكولاجين

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. لتطوير طبقة ثنائية بناء، وإعداد كل من الكولاجين والمواد الهلامية الربط بين الليفين على النحو الموصوف أعلاه، مع تعديلات طفيفة. لفترة وجيزة، لدراسة خصائص المهاجرة والتعاون الاستقراء، من مصدر واحد من الخلايا الجذعية باستخدام اثنين من bioscaffolds، "شطيرة" وASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ بين الكولاجين والسقالات الربط بين الليفين باستخدام عملية من أربع خطوات: 1) ASC تحميل على CSM، 2) يلقي ييفاتي هلام الكولاجين وطبقة حبات ASC-CSM على العقيدلاجين هلام، 3) الزهر الربط بين الليفين الجل على هلام ASC-CSM-الكولاجين والسماح للهلام ليصلب، و 4) إضافة إلى متوسط ​​جيد وتدرج في دراسة الخلايا في المختبر أو إزالتها من إدراج للتطبيقات في الجسم الحي (انظر الشكل 1 ).
  2. إعداد نوع 1-1 مل الكولاجين (7.5 ملغ / مل) خليط كما هو موضح أعلاه في 7.1، دون إضافة ASC-CSM إلى الخليط. ضع الخليط في ادخال زراعة الأنسجة 6-جيدا (8 ميكرون حجم المسام)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب على 37 درجة مئوية.
  3. بعد اكتمال طبقة، الرجفان على مدى 5 ملغ الكولاجين سطح ASC-CSM (10، 000 خلية / ملغ) أوقف في وسائل الإعلام ثقافة (200 ميكرولتر). بعد المجهرية التي استقرت على مدى جيل، وإعداد جيل الربط بين الليفين كما هو موضح في القسم 6.0، دون إضافة ASC-CSM إلى الخليط، وطبقة ومضاد للفيروسات الفيزيولوجية / ثرومبين حل أكثر من طبقات ASC-CSM-الكولاجين. عند إعداد جيل الربط بين الليفين، استخدم 250 ميكرولتر من مستنبت الخلية في مكان رهو 250 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على خلايا.
  4. وبمجرد الانتهاء، احتضان البنى لمدة 30 دقيقة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب لتحقيق دبق كاملة قبل تغذي التصور مع الثقافة المتوسطة.
  5. بعد دبق كاملة، ومكان 1 مل من المتوسط ​​في مجلس الشيوخ خلال بناء و3 مل من المتوسط ​​في مجلس النواب.

9. مما يجعل الحلول المالية

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  • الكالسيوم المخزون كلوريد (40 ملم): استخدم فقط CaCl 2 0.2 H 2 O. حل 588.4 ملغ من CaCl 2 0.2 H 2 O مع 100 مل من الماء منزوع الأيونات. تعقيم باستخدام فلتر 0.22-ميكرون.
  • البولي ايثيلين جلايكول: الربط هو شديد التفاعل مع الأكسجين، ويمكن أن تصبح تتأكسد عند تعرضها للهواء الغرفة. على هذا النحو، ينبغي تخزين PEG تحت النيتروجين (N 2) الغلاف الجوي. لجنة التنسيق الإداريةوزن urately 32 ملغ في أنبوب الطرد المركزي 2-مل (تأكد لتطهير أنابيب مع N 2 قبل الاستعمال) ومخزن في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. حل 32 ملغ من PEG في 4 مل من محلول TBS قبل الاستخدام.
    يجب أن تكون الحلول التالية الطازجة قبل كل تجربة.
  • TBS حل: (7،75-7،77 درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية، درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية حرجة للغاية). للتحضير 15 مل من محلول TBS، حل بعناية قرص واحد العازلة في فلتر تعقيم الماء منزوع الأيونات والتكيف مع درجة الحموضة المطلوبة. لا تخزن المخزون حل التحضير أنها جديدة كل مرة.
  • حل الفيزيولوجية: (40 ملغ / مل). حل مسحوق الفيزيولوجية في TBS لجعل تركيز الفيبرينوجين 40 ملغ / مل. حلها بين عشية وضحاها باستخدام محرك مغناطيسي في 4 درجات مئوية. فمن الأسهل على حل كامل 1-G مع كمية المبلغ المطلوب من TBS. في اليوم التالي، وإزالة الفيزيولوجية من 4 درجات مئوية (غائم عادة) والسماح لهالتدفئة في حمام مائي حتى يتم الحصول على حل متجانسة. أخيرا، تصفية تعقيم الفيزيولوجية باستخدام فلتر 0.45-ميكرون.
  • ثرومبين حل (25 وحدة / مل): لجعل الحل ثرومبين، تزن من المبلغ المطلوب وحل مع 40 ملم معدة CaCl 2 0.2 H 2 O. انها دائما ممارسة جيدة لاستخدام قارورة كاملة من ثرومبين لجعل الأوراق المالية. على سبيل المثال: ذوب زجاجة ثرومبين كو 5 مع 200 ملم من 0.2 CaCl 2 H 2 O، قسامة وتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

10. ممثل النتائج

والهدف العام لهذه التقنية المقدمة هنا هي للتدليل على إمكانية التفريق مصفوفة يحركها وقت واحد من ASC إلى الظواهر متعددة باستخدام CSM كوسيلة التسليم. علينا أن نبرهن استراتيجية في المختبر لتوفير الخلايا الجذعية من يتم أخذ خطوات التنفيذ في سقالة الكولاجين الربط بين الليفين bilayered. توصيف ASC جزءا لا يتجزأ من ضمن هذه reveale سقالةد التي يمكن ASC محملة يتم أخذ خطوات التنفيذ "محصورة" بين طبقة الكولاجين وPEG الليفين في وقت واحد وبشكل مختلف اتخاذ جديلة من كلا بيئات خارج الخلية لتزدهر في ظل الظروف الجديدة. نحن يتميز أولا القدرة لنظام نموذجي للحفاظ على بقاء الخلية والقدرات المهاجرة. أيد الكولاجين قدرة ASCs للمحافظة على "stemness"، كما تجلى من قبل التعبير عنها من Stro-1 وعلى الخلايا الليفية، مثل التشكل (الشكل 2D و 2F). في المقابل، بفعل الربط بين الليفين في ASCs للتمييز نحو النمط الظاهري الأوعية الدموية، كما يتضح من الشكل الظاهري لها بنية أنبوب يشبه، على البطانية خلية محددة التعبير عن عامل فون ويلبراند (2E الشكل و2G)، وخلية حوطية محددة من التعبير NG2 والصفائح الدموية المشتقة مستقبلات عامل النمو بيتا (PDGFRβ) (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، فإن هذه الظواهر المرصودة بدا أن يحدث في وقت مبكر في الثقافة، وتمت المحافظة على أكثر من 11 يوما، كما هو ماركاonstrated في الشكل 3.

الجداول والأرقام

فوائد طبقة ثنائية أنشئ:

  • لا يمكن للسقالة وحدها دون أداء الخلايا كما سقالة النشطة بيولوجيا.
  • ويمكن الربط بين الليفين حث الخلايا الجذعية للتمييز بدون إضافة عوامل النمو.
  • يمكن الكولاجين المساعدة في الحفاظ على النمط الظاهري الخلايا الجذعية من ASCs.
  • ويمكن استخدام تأنشا طبقة ثنائية باعتبارها الركيزة نشطة لأنواع الخلايا الأخرى للهجرة وتتكاثر (على سبيل المثال، الخلايا البطانية، الخلايا الليفية، الخلايا القرنية، وخلايا العضلات الملساء، pericytes).
  • ويمكن استخدامه مع السقالات هندسة الأنسجة التي يصعب مثل العظام hydroxyaptite أو المنزوع المعادن على تجديد أنسجة الصلبة والناعمة.
  • ويمكن استخدامه لتطوير متعددة الطبقات، متنوع النسيج الهندسة التصور (مثل الجلد والأوعية الدموية، الأوعية الدموية، الظهارية، عن طريق الجلد والأوعية الدموية تحت الجلد، وغيرها).
  • ويستخدم مصدر وحيد الخلية لتطوير واحدحجرات متعددة الخلايا.
  • فمن لديه القدرة على الاندماج مع الأنسجة المضيف لأنه هو من أصل طبيعي.
  • CSM داخل التركيبة هلام يوفر منبرا للخلايا لترحيل من.
  • الشيتوزان، وتستخدم لإعداد CSM، هي معروفة نشط الكيماوي جاذبة.
  • ويمكن تطبيق المفهوم العام المطبقة في هذا البروتوكول من "مصفوفة يحركها تمايز الخلايا الجذعية" على غيرها من أنواع الخلايا الجذعية. ومع ذلك، هناك ما يبرر اجراء مزيد من التحقيقات لتحديد الجدوى من مصفوفة يحركها تمييز. لا يمكن للbilayered هلام سقالة بمثابة خزان لتسليم الخلايا بطريقة مستدامة والتي تسيطر عليها.
  • بعد إعادة الإعمار، لا يزال من المواد الهلامية لا يمكن فصلها إلى مكونات فردية.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي يصور الهدف العام وعملية لهذه التقنية. 1) الخلايا الجذعية المشتقة من الشحمي (ASCs) هي الصغرىaded على المجهرية الشيتوزان. 2) ثم يسكب الكولاجين في إدراج 6-جيدا، ودرجة الحموضة تعديلها لfibrillate الكولاجين، وإدراج وضعت في غرفة لوحة 6 جيدا. والطبقات ثم المجالات CSM ASC محملة على مادة الكولاجين. 3) ثم يتم سكب الفيزيولوجية مضاد للفيروسات على الكولاجين (ASC-CSM)، وتبلور من خلال إضافة ثرومبين. يمكن 4) ثم إن البناء طبقة ثنائية نهائي شطبها من إدراج الثقافة وتستخدم لفي المختبر أو في تحليل الجسم الحي.

الشكل 2
الشكل 2. توصيف ASC زرعها داخل الكولاجين والربط بين الليفين المصفوفات 3D. passaged A) المرحلة على النقيض من صورة مجهرية من ASC المعزولة والحفاظ على روتين باستخدام 2-الأبعاد تقنيات زراعة الخلايا. Photomicrographs B و D و F تصوير ASC-CSM زرعها داخل هلام الكولاجين 3-الأبعاد، بينما C، E، G، وعرض ASC-CSM زرعها داخل هلام PEG-3-الليفين الأبعاد، سواء في يوم 12. في باء وجيم)، وترد ASCs المهاجرة بعيدا عن المجال CSM في كلا النوعين سقالة. ASCs ويبدو أن بالارض، المغزل، مثل التشكل في الكولاجين (B)، مع المحافظة على التعبير عنها من علامة الخلية الجذعية Stro-1 (D؛ السهم). عندما تربيتها في الربط بين الليفين ASCs يحمل أكثر أنبوب يشبه الهياكل وحثهم على التعبير عن هذه الخلية علامات الأوعية الدموية وعامل فون ويلبراند (E). انتقال المجهر الإلكتروني يصور مورفولوجيا النموذجية التي أظهرتها ASCs داخل كل سقالة. ASCs في هلام الكولاجين تظهر لديهم أصغر أرجل كاذبة خيطية (فلوريدا) وتمتد من جسم الخلية (F)، في حين شكلت ASCs عادة lumenal (المسمى L) هياكل (G؛ السهم).

الشكل (3)
الشكل 3. التحليل الصرفي من ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ بين طبقات ثنائية الكولاجين والمواد الهلامية الربط بين الليفين. كانت "محصورة" ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ بين الكولاجين والمواد الهلامية الربط بين الليفين والمحافظة عليها في ثقافة لمدة 11 يوما. وcolu اليسارمليون يصور ASCs المهاجرة والمنتشرة داخل المصفوفة الكولاجين ويبدو أن تأخذ على التشكل مثل مغزل. العمود الأيمن يصور ASCs المهاجرة بعيدا عن يتم أخذ خطوات التنفيذ وتشكيل أنبوب يشبه الهياكل في جميع أنحاء هلام الربط بين الليفين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وASCs معروفة لسهولة لهم من العزلة والقدرة على التمييز تجاه مختلف أنواع الخلايا. مع التقنيات الموضحة في هذه المخطوطة، ونحن قادرون على استغلال اللدونة من ASCs من خلال تعريض هذه الخلايا إلى biomatrices متعددة في وقت واحد. كما الخلايا تهاجر بعيدا عن قاعدة CSM ويدخل بيئتهم المحيطة خارج الخلية، وخلايا اتخاذ جديلة من السقالة، ويمكن الحفاظ على إما "stemness" (الكولاجين) أو يكون ذلك حافزا للتفريق نحو أنواع الخلايا الأوعية الدموية والأوعية الدموية الداعمة-(الليفين). منذ مهتمة مختبرنا في الجلد والأنسجة الرخوة التئام الجروح، ونحن تنفيذا استراتيجيا طبقة ثنائية من الكولاجين والليفين منذ الكولاجين تؤيد تجديد الجلد والبشرة من قبل المضيف، في حين الليفين يدفع بطبيعة الحال تشكيل شبكة الأوعية الدموية 9. وعلاوة على ذلك، من المفهوم الآن أن يحدث عبر نقاش بين تكاثر الخلايا الكيراتينية الجلد والخلايا الليفية، والشبكة الأساسية الأوعية الدموية، وهذا مجمعآلية حرجة للغاية لالتئام الجروح السليم 10. بدون بشبكة الأوعية الدموية الكامنة، وعمليات ترقيع الجلد الأنسجة المهندسة صعوبة inosculating مع الأنسجة المضيف. لذلك، لدينا فرضية العام هو أن الكولاجين والليفين، عندما تستخدم على النحو طبقة ثنائية في تركيبة مع ASCs، ستنخفض مرة التئام الجروح عن طريق تحسين واحد أو أكثر من مراحل الأوعية الدموية، الجلد، وعمليات إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري.

الليفين هو البوليمر الحيوي تنوعا تشكلت بعد ثرومبين بوساطة الانقسام من ببتيد فبريني والمستمدة من الفيبرينوجين أحادى. وقد استخدمت الليفين سريريا كعامل مرقئ (التي وافقت عليها الولايات المتحدة للأغذية والدواء) ونتيجة لتسرب في مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية، بما في ذلك إجراءات مثل الأنسجة الرخوة تشريح. وقد استخدمت الهلاميات المائية الليفين من الفيبرينوجين خيفي تنقية تجاريا وعلى نطاق واسع ثرومبين في العقد الأخير في مجموعة متنوعة من الأنسجة هندسة التطبيقات. ومع ذلك، بعض العيوب الرئيسية أنان يمكن أن تستخدم هيدروجيل الليفين تكون 1) القدرة على السقالة لتقليص، 2) صلابة ميكانيكية منخفضة، و 3) تدهور سريع قبل تشكيل السليم للهياكل النسيج الهندسة. للتغلب على هذه المشاكل، الليفين يحتاج إلى تعديل قبل استخدامها لتكون بمثابة أفضل سقالة الأنسجة الهندسة ثلاثي الأبعاد. واحد مثل هذا النهج في copolymerizing الليفين مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG-الفايبرين). وقد أثبت عملنا الأولية العديد من المزايا الفريدة من الربط بين الليفين التي تجعل من المفيد في التئام الجروح على اللصقة هيدروجيل الأخرى، بما في ذلك الليفين معدلة. يسلك مضاد للفيروسات، الليفين ميزات فريدة من نوعها لكل من الهلاميات المائية الاصطناعية والمواد الطبيعية. على وجه التحديد، فإن وجود الربط يوفر رطب جدا (> 90٪ ماء) بيئة رطبة لإدارة الإفرازات. الثانية، فإن وجود الليفين يمنح التحلل البيولوجي للمواد، ولكن النتائج السابقة تبين أن الليفين مضاد للفيروسات هو أكثر استقرارا بكثير في المختبر من الليفين unPEGylated

العنصر الثاني من طبقة ثنائية لدينا هو الكولاجين. الكولاجين هو مادة بيولوجية طبيعية وأعرب بتواجد مطلق في الثدييات ويشكل موقع مباشر من المرفق لأنواع مختلفة من الخلايا. الأنسجة المختلفة عن أنواع مختلفة من الكولاجين (نوع 1-type29)، تبعا لنوع من الحاجة الوظيفية للأنسجة. الخصائص الملازمة أخرى من الكولاجين التي تجعلها جذابة للغاية في نموذج لدينا هي أن 1) هو غير قابل للالتهابات، و2) على حد سواء المكونات كلها وتدهور الكولاجين وحيويا، 3) وهو هيدروجيل المسامية العالية، 4) انها تؤيد تسلل خلية والهجرة، 5) فإنه يحتفظ multipotency من الخلايا الجذعية، 6) هو الانضباطي بواسطة صياغة تحوير، و 7) أنه inosculates بسهولة مع الأنسجة المضيف. لدينا دراسات في تجديد البشرة والأنسجة الرخوة، وهو مركب يتكون من طبقة ثنائية الكولاجين هو خيار طبيعي منذوأعرب بشدة في جميع أنحاء الجلد، بما في ذلك مناطق الجلد العميقة، ويمكن استخدامها بوصفها علامة المناعية لتقييم مدى عمق الجرح.

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود تقنية للحفاظ على وقت واحد "stemness" من ASCs بينما التفريق ASCs نحو مختلف أنواع الخلايا في الأوعية الدموية. لدراسة الجلد والنسيج الأساسي لينة، والكولاجين وPEG الليفين، قابلة للتطبيق مباشرة. ومع ذلك، لا يمكن تنفيذ غيرها من المواد bioscaffold لدراسة قدراتهم استكشاف فريدة من نوعها للحث على ASC إلى أنواع الخلايا الأخرى. أسلوب تنفيذها هنا يساعد على تسليط الضوء على أهمية المصفوفة خارج الخلية في السيطرة على الظواهر الخلايا الجذعية ويضفي مصداقية على استكشاف الطبقات المركبة لتجديد البشرة.

ملخص

خطوات حاسمة

  • وينبغي تعديل الكولاجين لدرجة الحموضة في كهرساوي الصحيح (pH6.8-7.1) للحث على الرجفان والحصول على شارع جل مستقرucture.
  • وينبغي إعداد PEG الطازج قبل الاختلاط مع حل الفيزيولوجية منذ مدة صلاحية الربط المائي قصير (4-5 ساعات).
  • وينبغي أن فترة حضانة من الفيبرينوجين PEG-خليط لا تتجاوز 25 دقيقة (في 37 درجة مئوية) منذ أكثر من الحضانة قد تتسبب في هطول الأمطار عكر مبهمة خلال دبق.
  • بعد إضافة ثرومبين إلى حل الفيزيولوجية مضاد للفيروسات، ينبغي الاستغناء عن هذا المزيج على إدراج ثقافة فورا (بعد خلط لطيف مع ماصة). وقد عقد مزيج حل في الطرف ماصة لفترة أطول (> 30 ثانية) يمكن أن يسبب دبق في قمة ماصة وصعوبة في الحصول على المواد الهلامية سكب بالتساوي.
  • باستخدام الخلايا المجهرية الحجم بشكل موحد وزعت بالتساوي على السرير CSM أمر حاسم بالنسبة لتحميل الخلية المثلى. CSM اختلاف حجم قطرها تؤثر بشكل مباشر على مساحة المتاحة للمرفق خلية لكل مليغرام من المجهرية، في حين وزعت بالتساوي ASC-CSM تؤثر بشكل مباشر على الهجرة إلى خلية تيهو السقالات. وينبغي توزيع الخلية محملة المجهرية (ASC-CSM) بالتساوي على أعلى من هلام الكولاجين لضمان الهجرة حتى من ASCs ضمن سقالة. إذا توزيع ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ هي كثيفة جدا، وسوف تحصل على تتركز الهجرة الخلية إلى منطقة معينة في المواد الهلامية، وربما تحد من خلية خلية التفاعل في مرحلة ما بعد الهجرة.
  • تأكد من أن حجم وسائل الإعلام إضافة إلى البئر الخارجي للخلية إدراج ثقافة أعلى من الغضروف المفصلي للداخلية أيضا. عادة، داخلية: نسبة حجم الخارجي لل01:02 من المناسب، كما تسهل هذه الخلايا المترتبة على المجهرية.

القيود

  • ويقتصر هذا الأسلوب على المساحة الإجمالية المتاحة في المجهرية. إذا كانت هناك رغبة عدد أكبر خلية، مطلوبة أكثر المجهرية لزيادة مساحة السطح.
  • منذ وتهدف هذه الخلايا على الهجرة من المجهرية، يمكن ملاحظة وجود الزمنية الفاصلة للهجرة الأولي للخلية على وضمن المواد الهلامية.
  • والمجهرية هي في واجهة اثنين من المواد الهلامية (الكولاجين وPEG-الليفين)، وهذا قد يحد من / يستغرق وقتا أطول للهجرة الخلايا إلى الغايات البعيدة من المواد الهلامية.
  • خلال بناء طبقة ثنائية، مضاد للفيروسات الفيزيولوجية، ثرومبين خليط يجب أن أضيف بسرعة فوق السرير CSM-ASC على أعلى من الكولاجين. قد يؤدي هذا التفاوت إعادة توزيع ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ. في حالة وجود تفاوت إعادة توزيع ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ في الواجهة خلال صب جل الربط بين الليفين، قد تكون التركيبة هلام تحريكها ببطء يدويا لإعادة توزيع بسرعة المجهرية قبل دبق كاملة.
  • ويقتصر هذا الأسلوب على الخلايا التي تحتوي على خصائص الهجرة، وربما لا تكون مناسبة لتقديم أنواع مرسى خلية مستقلة.
  • الحل الكولاجين قبل الرجفان يبقى في درجة الحموضة الحمضية ويحد من مزيج من الخلايا مباشرة ضمن المواد الهلامية الكولاجين. على هذا النحو، إذا لم تعدل في إطار زمني معقول (~ 30 دقيقة)، قد يكون خطر بقاء الخلية.
  • منذ زوالطبقات بشكل فردي ELS المستخدمة في هذا البناء، توقف محتمل أو الفصل بين المواد الهلامية قد تحدث أثناء التعامل مع هذه العملية. وبالتالي، فإنه قد تحد من سهولة في التعامل مع أثناء في الدراسات المجراة.

ممكن تعديلات

  • لا يمكن أن توزع بالتساوي ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ ضمن المواد الهلامية الفردية بدلا من الطبقات لهم في واجهة.
  • ويمكن أن تكون مختلطة ASCs مباشرة ضمن المواد الهلامية الفردية بدلا من تقديم بواسطة CSM، ولكن هذا قد يحد من تطوير درجة عالية من التنظيم الخلوي منقوشة بنيات الأنسجة.
  • لتجنب التفاوت إعادة توزيع ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ خلال الربط بين الليفين الصب، قد علقت ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ في حجم صغير من حل الشيتوزان مائي (1٪ W / V) وتوزع بالتساوي على المواد الهلامية الكولاجين. وسيضمن هذا المرفق من شركة ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ على طبقة الكولاجين جل وسيمنع طرد من ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ من سطح الكولاجين.
  • ويمكن الاستفادة من التصور في حد ذاته بطريقة معكوسة، أي PEG-Fويمكن تلقي المواد الهلامية ibrin الأولى وASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ يمكن أن تكون البذور على أعلى من الربط بين المواد الهلامية الليفين تليها المواد الهلامية الكولاجين. بذلك يسمح للمستخدم أن يدلي حل الكولاجين لييفاتي فوق طبقة (ASC-CSM)، PEG-الليفين أكثر حذرا منذ ذلك الحين، على عكس الربط بين المواد الهلامية الليفين، لييفاتي حل الكولاجين يتطلب وقتا اضافيا (30 دقيقة) لترسيخ. من خلال تبني هذه العملية لا يمكن للمرء ضمان الحفاظ على التوزيع حتى من ASC-CSM.
  • ويمكن إدراج المواد الهلامية (الكولاجين و / أو الربط بين المواد الهلامية الليفين) مع mitogens، مثل عوامل النمو (على سبيل المثال، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية، وعوامل نمو الخلايا الليفية)، وذلك للحث على الهجرة أسرع الخلايا وانتشار الأسلحة النووية.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  • خلال الرجفان من حل الكولاجين، وإذا كان الرقم الهيدروجيني يتجاوز الرقم الهيدروجيني من كهرساوي> 7.2، يجب أن تكون درجة الحموضة عدلت إما عن طريق إضافة المزيد من الأسهم حل الكولاجين، وخفض درجة الحموضة باستخدام حامض ضعيف الحل.
  • عند إعداد CSM، إذا تفاوت كبير في حجم occuويمكن تعديل RS، ثم عدد من المعلمات أن تحقق المطلوب حجم CSM (اللزوجة من حل الشيتوزان الأوراق المالية، وحجم السطحي، وسرعة التحريك وغيرها).
  • في حالة هجرة الخلية بطيء عند ملء المواد الهلامية، ويمكن استخدام عدد أكبر من ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ لزيادة عدد الخلايا المهاجرة خارج المجلس الأعلى للقضاء في المواد الهلامية.
  • ويمكن لعملية الربط بين الفيزيولوجية دبق يكون متخلفا عن طريق خفض حجم ثرومبين تضاف إلى خليط (عادة 900 ميكرولتر بدلا من مل 1) أو إعداد الأوراق المالية انخفاض تركيز الثرومبين (20 يو / مل بدلا من 25 U / مل) . وهذا يسمح أبطأ دبق من الربط بين خليط الفيزيولوجية، ويعطي بالتالي الوقت الاضافي لصب حذرا من الفيبرينوجين، مضاد للفيروسات وخليط ثرومبين على ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ.
  • أثناء الحضانة، وإذا كان فصل مرحلة يحدث (بين الكولاجين وهلام الليفين)، يمكن وضع خاتم معقم تفلون "O" على التركيبة أعلى لضمان الربط من مراحل الجل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا المصالح المتنافسة المالية موجودة.

براءة الذمة

آراء أو التأكيدات الواردة في هذه الوثيقة هي وجهات نظر خاصة من كتاب ولا يمكن تفسيره بأنه مسؤول أو يعكس وجهات النظر من وزارة الدفاع أو الحكومة الأمريكية. الكتاب هم من العاملين في حكومة الولايات المتحدة، وأعدت هذا العمل كجزء من واجباتهم الرسمية. وأيد كل العمل الذي قامت به الولايات المتحدة للبحوث الطبية للقوات المسلحة وقيادة العتاد. وقد أجريت هذه الدراسة في إطار بروتوكول مراجعتها والموافقة عليها من قبل الولايات المتحدة للبحوث الطبية للقوات المسلحة والعتاد مجلس القيادة المؤسسية ومراجعة وفقا للبروتوكول المعتمد.

Acknowledgments

كان مدعوما من قبل SN منحة زمالة ما بعد الدكتوراه في الهندسة من بيتسبرغ مبادرة الأنسجة. ويدعم منطقة دبي للتعهيد عن طريق منحة من منح المؤسسة جنيف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter