Summary
इस प्रोटोकॉल स्टेम सेल की निहित क्षमता का उपयोग करने के लिए अपने आसपास के बाह्य मैट्रिक्स से क्यू लेने और कई phenotypes में अंतर प्रेरित करने पर केंद्रित है. इस तरीके पांडुलिपि हमारे और एक मॉडल एक bilayered hydrogel उपयोग, खूंटी आतंच और कोलेजन की रचना का वर्णन लक्षण वर्णन प्रदान करता है, के लिए एक साथ वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल सह अंतर
Abstract
पिछले कुछ वर्षों में प्राकृतिक पॉलिमर उनके मेजबान और biocompatibility के लिए इन विट्रो में और vivo में कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की क्षमता की वजह से अधिक महत्व प्राप्त है, अनुसंधान का एक क्षेत्र है कि पुनर्योजी चिकित्सा में वादा धारण उपन्यास biomaterials और स्टेम सेल के मिश्रित उपयोग है. ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में एक मौलिक रणनीति सेल समारोह के निर्देशन के लिए तीन आयामी पाड़ (उदाहरण के लिए, बाह्य मैट्रिक्स, hydrogels, माइक्रो / नैनो कणों decellularized) का उपयोग है. इस तकनीक की खोज से विकसित किया गया है कि कोशिकाओं को एक सब्सट्रेट पर जो वे का पालन कर सकते हैं की जरूरत है, पैदा करना, और उनके विभेदित सेलुलर phenotype और 2-3 समारोह व्यक्त. हाल ही में, यह भी निर्धारित किया गया है कि कोशिकाओं को न केवल इन substrates के पालन के लिए उपयोग करने के लिए, लेकिन यह भी बातचीत और मैट्रिक्स (उदाहरण के लिए, बाह्य मैट्रिक्स, ईसीएम) सब्सट्रेट 4 से cues ले. इसलिए, कोशिकाओं और scaffolds कि पारस्परिक संबंध हैऊतक विकास, संगठन, और अंतिम समारोह को नियंत्रित करता है. वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASCs) mesenchymal, गैर hematopoetic के स्टेम कोशिकाओं कि बहु - वंश भेदभाव एक्ज़िबिट और कोशिकाओं के एक तत्काल उपलब्ध स्रोत (यानी पूर्व के संवहनी endothelia और pericytes) के रूप में सेवा कर सकते हैं वसा ऊतकों में मौजूद हैं. हमारी परिकल्पना है कि वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल phenotypes एक साथ bilayered 1 matrices में बस सह संवर्धन उन्हें अलग - अलग करने की ओर निर्देशित किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला त्वचीय घाव भरने पर ध्यान केंद्रित है. यह अंत करने के लिए, हम प्राकृतिक, biomaterials से एक समग्र मैट्रिक्स, आतंच, मज्जा, और chitosan कि घाव त्वचीय विशिष्ट चिकित्सा ईसीएम पर्यावरण की विशेषताओं और कार्यों की नकल कर सकते हैं बनाया है.
Protocol
1. वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASCs) 1, 5 अलग
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- Perirenal चूहा और अधिवृषणी वसा को अलग और बाँझ हांक नमक बफर समाधान (HbSS) 5 पहले से वर्णित के रूप में 1% से भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) से युक्त से धो. इस अध्ययन में पशु कल्याण अधिनियम, पशु कल्याण विनियमों को लागू करने के साथ और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के सिद्धांतों के अनुसार अनुपालन में आयोजित किया गया है.
- ऊतक क़ीमा और एक ट्यूब 50 एमएल और कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 500 जी में 1% FBS युक्त HbSS के 25 एमएल में 1-2 जी हस्तांतरण.
- मुक्त अस्थायी वसा ऊतक परत और 125 एमएल Erlenmeyer कुप्पी हस्तांतरण लीजिए और 45 मिनट के लिए HbSS में 25 में Collagenase प्रकार द्वितीय (200 यू / एमएल) की 37 ° एमएल सी एक कक्षीय हिलनेवाला (125 आरपीएम) के साथ इलाज. ध्यान से pipeting द्वारा तरल अंश (तेल और वसा की परत के नीचे) को हटाने और यह एक 100 के माध्यम से क्रमिक रूप से फिल्टर माइक्रोन और 70 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 500 जी में छानना अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन), और गोली HbSS के 25 एमएल के साथ दो बार धोना.
- सेल विकास (MesenPRO रुपये बेसल मध्यम) मध्यम MesenPRO रुपये ग्रोथ अनुपूरक, एंटीबायोटिक कवकनाशी (100 यू / एमएल पेनिसिलिन जी के 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट के, और 0.25 / amphotericin की μg एमएल के साथ पूरक की 50 एमएल में गोली Resuspend बी), और दो T75 बोतल (25 एमएल / फ्लास्क) में 2 एल glutamine और विंदुक कोशिकाओं की मिमी.
- संस्कृति 37 पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में ए एस सी डिग्री सेल्सियस (बीतने 2-4 ASCs सभी प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है).
2. Chitosan microspheres (CSMs) की तैयारी
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- मिश्रण हलचल लगातार एक स्थिर पायस पानी में तेल प्राप्त किया जाता है जब तक लगभग 1 घंटे के लिए हड़कंप मच गया. ईओण 4 घंटे (24 एमएल) के लिए 1% w / v n-octanol हर 15 मिनट में पोटेशियम हीड्राकसीड के 1.5 एमएल के अलावा के साथ जोड़ने पार आरंभ
- एक निर्वात desiccator में बरामद क्षेत्रों सूखी और आगे प्रसंस्करण के बिना विश्लेषण. आप औसत CSM के कण आकार, मिलीग्राम प्रति सतह क्षेत्र, और एक कण आकार विश्लेषक का उपयोग करके इकाई घन मात्रा निर्धारित कर सकते हैं.
- बाद के प्रयोगों के लिए, बाँझ जल के साथ CSM तीन बार धोने के लिए अवशिष्ट लवण हटाने और पूर्ण इथेनॉल के 5 एमएल के साथ रात भर धोने से बाँझ.
3. निर्धारणCSMs में मुफ्त एमिनो समूह की संख्या
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- मुफ्त एमिनो हैं ईओण trinitro (TNBS) Bubnis और 6 OFNER के एसिड परख benzenesulfonic का उपयोग करके जोड़ने के पार के बाद CSMs में मौजूद समूहों की संख्या का निर्धारण करते हैं. 1 एक गिलास 50 एमएल ट्यूब में 0.5% TNBS समाधान के 40 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए एमएल के साथ microspheres की 5 मिलीग्राम सेते हैं और 60 में 6N एचसीएल 3 एमएल के अलावा ° सी 2 घंटे के लिए साथ Hydrolyze.
- कमरे के तापमान के लिए नमूनों को शांत करने के लिए और विआयनीकृत पानी की 5 एमएल और एथिल ईथर के 10 एमएल जोड़कर मुफ्त TNBS निकालने.
- 40 करने के लिए डिग्री सेल्सियस एक नहाने के पानी में 15 मिनट किसी भी अवशिष्ट आकाश, कमरे के तापमान को शांत, लुप्त हो जाना करने के लिए और पानी के 15 एमएल के साथ पतला करने के लिए जलीय चरण के अशेष भाजक 5 एमएल गर्म.
- 345 एनएम पर एक chitosan के बिना TNBS समाधान का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ absorbance के रूप में खाली और chitosan CSM पी के लिए इस्तेमाल को मापने केएमिनो समूहों की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए मरम्मत. Chitosan के सापेक्ष CSM की मुक्त एमिनो समूहों की संख्या का अनुमान है.
4. लोड हो रहा है CSM में ए एस सी
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- रातोंरात बाँझ HbSS में 2.5 अनुभाग से निष्फल CSMs 5 मिलीग्राम संतुलित करना और एक 8 - माइक्रोन रोमकूप आकार झिल्ली संस्कृति प्लेट डालने (24 अच्छी तरह से थाली).
- बाद CSMs झिल्ली पर बसे है, ध्यान से HbSS महाप्राण (व्यंजन) और डालने और विकास मीडिया के 700 μL के अंदर डालने के बाहर करने के लिए मध्यम विकास की 300 μL जोड़ने.
- उपयुक्त एकाग्रता में वृद्धि और संस्कृति थाली डालने के अंदर CSM पर मध्यम बीज के 200 μL में resuspend ASCs (1 × 4 10 से 4 × 4 10). संस्कृति डालने के भीतर माध्यम की अंतिम मात्रा, बोने के बाद, 500 μL है.
- Incub24 घंटे लिए CSMs पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में ए एस सी 37 पर वरीयता प्राप्त डिग्री सेल्सियस खाया
5. CSMs में ए एस सी लोड हो रहा है और सेल व्यवहार्यता का प्रतिशत निर्धारण
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- ऊष्मायन, pipet कोशिकाओं कि डालने झिल्ली में चले गए परेशान बिना ए एस सी भरी हुई एक बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge के ट्यूब में CSM के बाद.
- अवशिष्ट मध्यम निकालें और ट्यूब ताजा मध्यम विकास के 250 μL जोड़ें.
- प्रत्येक ट्यूब, का MTT की 25 μL [3 - (4,5 - dimethylthiozole-2-YL) -2,5 - diphenyltetrazolium ब्रोमाइड] समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल) और एक 5% humidified सीओ 2 में 4 घंटे के लिए सेते हैं 37 में इनक्यूबेटर डिग्री सेल्सियस
- ऊष्मायन के बाद, मध्यम निकालने के लिए, डाइमिथाइल sulfoxide के 250 μL जोड़ने, और 2-5 लिए formazan जटिल solubilize मिनट के लिए मिश्रण भंवर.
- 2700 जी में CSM के अपकेंद्रित्रके लिए 5 मिनट सतह पर तैरनेवाला बंद pipet और 570 एनएम और 630 एनएम के एक मानक प्लेट रीडर का उपयोग पर MTT के निर्माता विनिर्देशों के अनुसार इसकी तरंग दैर्ध्य absorbance के, निर्धारित.
- सेल परिभाषित ए एस सी के लिए एक मानक वक्र विकसित सभ्य संख्या से प्राप्त मूल्यों के सापेक्ष CSMs साथ जुड़े संख्या का निर्धारण करते हैं.
6. और ए एस सी-CSM की तैयारी विशेषता खूंटी आतंच जैल में एंबेडेड
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- Tris-buffered खारा (टीबीएस, 7.8 पीएच) और फिल्टर बाँझ 4 एमएल का उपयोग., Polyethylene glycol (खूंटी) आतंच hydrogel (खूंटी आतंच) SUGGS एट अल द्वारा succinimidyl glutarate संशोधित polyethylene glycol (3400 दा खूंटी) भंग द्वारा 7 तैयार प्रयोग शुरू करने से पहले सिर्फ एक .22 माइक्रोन फिल्टर के साथ. घुलित खूंटी पहले 3-4 घंटे के लिए इस आवेदन में केवल प्रभावी है.
- मिश्रण और 500म्यू, फाइब्रिनोजेन स्टॉक के एल (40 मिलीग्राम / एमएल टीबीएस, 7.8 पीएच में) और 37 में एक 6 अच्छी तरह से और एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए थाली सेते हैं अच्छी तरह से एक संस्कृति में खूंटी स्टॉक के 250μl ° सी. फाइब्रिनोजेन: यह मिश्रण 1:10, एसजी खूंटी एसजी की एक दाढ़ एकाग्रता के अनुपात का गठन किया.
- CSM की 5 मिलीग्राम की एकाग्रता में ए एस सी-CSM की 250 μl लो, (2 ≈ × 4 कोशिकाओं 10) और PEGylated फाइब्रिनोजेन समाधान के साथ मिश्रण.
- तुरंत में थ्रोम्बिन स्टॉक (25U/mL) के 1 मिलीलीटर जोड़ने और जल्दी विंदुक के साथ एक या दो बार महीन चुर्ण बनाना. खूंटी में फाइब्रिनोजेन थ्रोम्बिन के मिश्रण के बाद, तुरंत एक 12 अच्छी तरह से थाली में मिश्रण सेल जेल जगह है और एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में incubated 37 ° सेल्सियस पर 10 मिनट के पूरा जमाना लिए अनुमति के लिए. कोशिश जमाना समय के बाद से तेजी से है, और नहीं पकड़ अधिक से अधिक 5 सेकंड के लिए जेल समाधान विंदुक टिप के भीतर. PEGylated फाइब्रिनोजेन थ्रोम्बिन द्वारा cleaved है और एक PEGylated आतंच hydrogel रूपों. ऐसे वें के रूप में,ई अंतिम जेल उत्पाद के में खूंटी आतंच के रूप में संदर्भित किया जाता है.
- खूंटी - आतंच जैल HbSS साथ दो बार और धो अल्फा न्यूनतम आवश्यक (α - सदस्य) मीडिया एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में FBS साथ 10% 37 पूरक डिग्री सेल्सियस के साथ सेते हैं
- CSM से कोशिकाओं की एक 11 दिन की अवधि में मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर जेल में प्रवास निरीक्षण करते हैं.
7. और एएससी-CSM की तैयारी विशेषता कोलेजन जैल में एंबेडेड
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- मिक्स टाइप 1 (7.5 मिलीग्राम / एमएल) कोलेजन 6.8 2N NaOH का उपयोग करने के लिए पीएच को समायोजित करने के बाद 8 Bornstein और रेशे की तरह की पद्धति के अनुसार चूहे की पूंछ tendons से निकाले CSM के साथ ए एस सी (5 मिलीग्राम 2 ≈ 10 × 4 कोशिकाओं से युक्त).
- 12 अच्छी तरह से थाली करने के लिए तंतुमय कोलेजन ए एस सी-CSM मिश्रण जोड़ें और एक 5% सीओ 2 humidi में 30 मिनट के लिए सेते हैं37 में fied इनक्यूबेटर डिग्री सेल्सियस
- पूरा fibrillation के बाद, एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 11 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजन - ए एस सी CSM जैल सेते हैं
- CSM से कोशिकाओं की एक 11 दिन की अवधि मानक माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करते हुए अधिक जेल में प्रवास निरीक्षण करते हैं.
8. Bilayered खूंटी - आतंच (एएससी CSM) कोलेजन जेल constructs का विकास
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- विकसित bilayer निर्माण मामूली संशोधनों के साथ दोनों कोलेजन और खूंटी - आतंच जैल के रूप में ऊपर वर्णित है, तैयार. संक्षेप में, स्टेम दो bioscaffolds का उपयोग कोशिकाओं के एक ही स्रोत के प्रवासी और सह प्रेरण गुणों का अध्ययन करने के लिए, और एक चार कदम प्रक्रिया का उपयोग करके कोलेजन खूंटी - आतंच scaffolds के बीच "सैंडविच" ए एस सी - CSMs: 1) लोड ए एस सी CSM, 2) पर कर्नल अधिक तंतुमय कोलेजन जेल और ए एस सी-CSM मोती परत डालीजेल ए एस सी-CSM - कोलेजन पर डाली lagen जेल, 3) खूंटी आतंच जेल और जेल कठियाना करने के लिए अनुमति देते हैं, और 4) अच्छी तरह से करने के लिए मध्यम जोड़ने और सम्मिलित करने के लिए इन विट्रो में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए या के लिए vivo अनुप्रयोगों में डालने से हटाने (चित्रा 1 देखें ).
- एक 1 एमएल प्रकार 1 (7.5 मिलीग्राम / एमएल) कोलेजन मिश्रण के रूप में ऊपर 7.1 में ए एस सी-CSM के मिश्रण को जोड़ने के बिना, वर्णित तैयार. 6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति डालने (8 माइक्रोन रोमकूप आकार) में मिश्रण रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते हैं
- ए एस सी-CSM की कोलेजन सतह 5 मिलीग्राम (10, 000 मिलीग्राम / कोशिकाओं) संस्कृति मीडिया (200 μl) में निलंबित पर पूरा fibrillation के परत के बाद. बाद microspheres जेल पर बसे है, मिश्रण को ए एस सी CSM जोड़ने, और ए एस सी-CSM - कोलेजन परतों पर PEGylated समाधान / फाइब्रिनोजेन थ्रोम्बिन परत के बिना खूंटी - आतंच जेल के रूप में 6.0 खंड में वर्णित है, तैयार. जब खूंटी - आतंच जेल की तैयारी, टी की जगह में सेल संस्कृति माध्यम के 250 μl उपयोगवह 250 μl मध्यम युक्त कोशिकाओं की.
- एक बार जब पूरा, एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए constructs सेते हैं संस्कृति के माध्यम से निर्माण को खिलाने से पहले पूरा जमाना हासिल है.
- पूरा जमाना बाद, जगह और मध्यम के 3 एमएल निर्माण के निचले सदन में अधिक ऊपरी कक्ष में 1 मध्यम की एमएल.
9. स्टॉक समाधान
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- कैल्शियम क्लोराइड स्टॉक (40 मिमी): केवल CaCl 0.2 2 एच 2 ओ का उपयोग विआयनीकृत पानी की 100 मिलीलीटर के साथ 2 CaCl .2 एच 2 हे 588.4 मिलीग्राम भंग. 0.22 - माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर बाँझ.
- Polyethylene glycol: खूंटी उच्च प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन के साथ है और ऑक्सीकरण हो जाते हैं जब कमरे में हवा के संपर्क कर सकते हैं. जैसे, खूंटी (2 एन) नाइट्रोजन वातावरण के अंतर्गत संग्रहित किया जाना चाहिए. एसीसीurately उपयोग के लिए तैयार है जब तक 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र (एन 2 के साथ उपयोग करने से पहले ट्यूब शुद्ध करने के लिए सुनिश्चित कर लें) ट्यूब और -80 में दुकान डिग्री सेल्सियस में 32 मिलीग्राम वजन. टीबीएस समाधान का उपयोग करने से पहले 4 एमएल में खूंटी के 32 मिलीग्राम भंग.
निम्न समाधानों हर प्रयोग से पहले ताजा बना होगा. - टीबीएस समाधान: (25 7.75-7.77 पीएच डिग्री सेल्सियस, में पीएच 25 डिग्री सेल्सियस बहुत महत्वपूर्ण है). टीबीएस समाधान के 15 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, ध्यान से एक फिल्टर - निष्फल विआयनीकृत पानी में बफर गोली भंग करने और आवश्यक पीएच को समायोजित. स्टोर समाधान तैयार यह हर समय ताजा नहीं शेयर.
- फाइब्रिनोजेन समाधान: (40 मिलीग्राम / एमएल). भंग टीबीएस में फाइब्रोजन पाउडर फाइब्रिनोजेन 40 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता. यह रातोंरात भंग 4 में एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग डिग्री सेल्सियस टीबीएस के लिए आवश्यक राशि के साथ पूरे 1 ग्राम मात्रा को भंग करने के लिए आसान है. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस (आमतौर पर बादल) से फाइब्रिनोजेन को हटा दें और यह अनुमतिएक नहाने के पानी में गर्म जब तक एक समरूप समाधान प्राप्त की है. अंत में, एक 0.45-माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फाइब्रिनोजेन बाँझ फिल्टर.
- थ्रोम्बिन समाधान (25 इकाइयों / मिलीलीटर): थ्रोम्बिन समाधान करने के लिए आवश्यक राशि का वजन और तैयार 40 मिमी CaCl 2 .2 एच 2 ओ के साथ भंग यह हमेशा थ्रोम्बिन की पूरी शीशी का उपयोग करने के लिए स्टॉक बनाने के लिए एक अच्छा अभ्यास है. उदाहरण: 2 CaCl की 200 मिमी 0.2 एच 2 हे, अशेष भाजक और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान के साथ 5 ku थ्रोम्बिन की एक बोतल में भंग
10. प्रतिनिधि परिणाम
यहाँ प्रस्तुत तकनीक के समग्र लक्ष्य के लिए एक प्रसव वाहन के रूप में कई CSM का उपयोग phenotypes में ए एस सी के साथ - साथ मैट्रिक्स संचालित भेदभाव की क्षमता प्रदर्शित की है. हम एक में इन विट्रो स्टेम सेल CSMs से एक bilayered कोलेजन खूंटी आतंच पाड़ में देने की रणनीति का प्रदर्शन. ए एस सी की विशेषता इस पाड़ reveale के भीतर एम्बेडेडचाहते हैं कि ए एस सी - लोड CSMs के कोलेजन और खूंटी-आतंच की एक परत के बीच में किया जा सकता है "sandwiched," एक साथ और विभिन्न दोनों बाह्य वातावरण से क्यू लेने के लिए अपने नए शर्तों की छत्रछाया. हम पहले मॉडल प्रणाली के लिए सेल व्यवहार्यता और प्रवासी क्षमता को बनाए रखने की क्षमता होती है. कोलेजन ASCs अपने "stemness," के रूप में stro - 1 की उनकी अभिव्यक्ति और fibroblast तरह उनकी आकारिकी (चित्र 2 डी और 2 एफ) के द्वारा प्रदर्शन किया गया था बनाए रखने की क्षमता का समर्थन किया. इसके विपरीत, खूंटी - आतंच ASCs प्रेरित करने के लिए एक संवहनी phenotype की ओर अंतर, के रूप में उनके ट्यूब की तरह संरचना आकारिकी, वॉन Willebrand कारक (चित्रा 2 ई और 2 जी) endothelial सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति, और pericyte विशेष की अभिव्यक्ति के द्वारा प्रदर्शन किया है NG2 और प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर बीटा (PDGFRβ) (नहीं दिखाया डेटा). इसके अलावा, इन मनाया phenotypes संस्कृति में जल्दी होते हैं दिखाई दिया और 11 दिन से अधिक रखा गया, के रूप में dem हैचित्रा 3 में onstrated.
टेबल्स और आंकड़े
Bilayer के लाभ का निर्माण:
- पाड़ कोशिकाओं के बिना अकेले एक bioactive पाड़ के रूप में प्रदर्शन कर सकते हैं.
- खूंटी - आतंच स्टेम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए वृद्धि कारकों के अलावा बिना अलग कर सकते हैं.
- कोलेजन ASCs के स्टेम सेल phenotype बनाए रखने में सहायता कर सकते हैं.
- एक bilayer निर्माण के अन्य प्रकार की कोशिकाओं को विस्थापित करने के लिए और पैदा करना (जैसे, endothelial कोशिकाओं, तंतुप्रसू, keratinocytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, pericytes) के लिए एक सक्रिय सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- हार्ड और सॉफ्ट ऊतक पुनर्जन्म यह कठिन hydroxyaptite या demineralized हड्डी की तरह ऊतक इंजीनियरिंग scaffolds के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
- यह एक बहुस्तरीय, विविध निर्माण ऊतक इंजीनियर (जैसे त्वचीय संवहनी, संवहनी उपकला, त्वचीय संवहनी hypodermal, आदि) को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- यह एक एकल कोशिका के स्रोत का उपयोग करता है के लिए एक साथ विकसितबहुकोशिकीय डिब्बों.
- यह क्योंकि यह प्राकृतिक मूल के मेजबान ऊतक के साथ एकीकृत करने की क्षमता है.
- जेल का निर्माण भीतर CSM से विस्थापित कोशिकाओं के लिए एक मंच प्रदान करता है.
- Chitosan, CSM तैयार किया है, एक अच्छी तरह से ज्ञात सक्रिय है chemo attractant है.
- समग्र अवधारणा "मैट्रिक्स संचालित स्टेम सेल भेदभाव की इस प्रोटोकॉल में लागू अन्य स्टेम कोशिकाओं के प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, आगे की जांच करने के लिए मैट्रिक्स संचालित भेदभाव की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए warranted है. bilayered जेल पाड़ के लिए एक निरंतर और नियंत्रित तरीके से कोशिकाओं को देने के लिए जलाशय के रूप में कार्य कर सकते हैं.
- पुनर्निर्माण के बाद, जैल अभी भी व्यक्तिगत घटकों में विभाजित किया जा सकता है.
चित्रा 1. योजनाबद्ध समग्र लक्ष्य और तकनीक की प्रक्रिया चित्रण. 1) वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASCs) लो कर रहे हैंchitosan के microspheres पर aded. 2) कोलेजन तो 6 अच्छी तरह से डालने, कोलेजन रेशे की तरह समायोजित पीएच, और 6 अच्छी तरह से एक थाली कक्ष में रखा डालने में डाल दिया है. ए एस सी भरी हुई CSM के क्षेत्रों तो कोलेजन पर स्तरित हैं. 3) PEGylated फाइब्रिनोजेन तो कोलेजन (ए एस सी-CSM) पर डाल दिया है और थ्रोम्बिन के अलावा द्वारा gelled. 4) इसके बाद अंतिम bilayer निर्माण संस्कृति डालने से हटाया जा सकता है और इन विट्रो में vivo विश्लेषण में या के लिए इस्तेमाल किया.
चित्रा 2 ए एस सी की विशेषता कोलेजन और खूंटी आतंच 3 डी matrices के भीतर सुसंस्कृत. ए) पृथक ए एस सी की सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ चरण विपरीत passaged और 2 आयामी सेल संस्कृति तकनीक दिनचर्या का उपयोग कर बनाए रखा. Photomicrographs बी, डी, और एफ ए एस सी-CSM को दर्शाती एक कोलेजन 3 आयामी जेल के भीतर सुसंस्कृत, जबकि सी, ई, और जी ए एस सी-CSM शो 1 दिन में एक 3 - आयामी खूंटी आतंच जेल, दोनों के भीतर सुसंस्कृत2. बी और सी) में, ASCs दोनों पाड़ प्रकार में CSM क्षेत्र से दूर पलायन दिखाए जाते हैं. ASCs के लिए एक चपटी, कोलेजन (बी) में धुरी की तरह आकारिकी, जबकि स्टेम सेल मार्कर stro एक (; तीर विकास) की उनकी अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए दिखाई देते हैं. जब खूंटी आतंच ASCs में सभ्य अधिक ट्यूब संरचनाओं की तरह प्रदर्शन कर रहे हैं और में वॉन Willebrand फैक्टर (ई) के रूप में संवहनी सेल मार्कर व्यक्त प्रेरित किया. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ठेठ प्रत्येक पाड़ भीतर ASCs द्वारा प्रदर्शन आकारिकी दर्शाया गया है. (जी, तीर) कोलेजन जेल में ASCs छोटे filopodia (FL) सेल (एफ) के शरीर से बढ़ा है, जबकि आम तौर पर ASCs lumenal संरचनाओं लेबल (एल) का गठन होना दिखाई देते हैं.
चित्रा 3 कोलेजन की bilayers और खूंटी - आतंच जैल के बीच ए एस सी CSMs की आकृति - मूलक विश्लेषण. ए एस सी - CSMs कोलेजन और खूंटी - आतंच जैल के बीच sandwiched, "थे और 11 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा. बाईं coluकरोड़ पलायन और मैट्रिक्स कोलेजन के भीतर proliferating के ASCs दर्शाया गया है और एक धुरी की तरह आकारिकी पर लेने दिखाई देते हैं. सही कॉलम CSMs से दूर पलायन और खूंटी - आतंच जेल भर ट्यूब संरचनाओं की तरह बनाने के ASCs दर्शाया गया है.
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Discussion
ASCs अलगाव और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की ओर अंतर करने की क्षमता के अपने आसानी के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है. इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीकों के साथ, हम कई biomatrices के लिए इन कोशिकाओं को एक साथ उजागर द्वारा ASCs के plasticity का फायदा उठाने में सक्षम हैं. के रूप में कोशिकाओं को उनके CSM के आधार से दूर विस्थापित और उनके आसपास के बाह्य वातावरण में प्रवेश करने के लिए, कोशिकाओं पाड़ से क्यू लेते हैं और या तो "stemness" के (कोलेजन) बनाए रख सकते हैं या नाड़ी और नाड़ी - सहायक प्रकार की कोशिकाओं (आतंच) की ओर अंतर करने के लिए प्रेरित किया. के बाद से हमारी प्रयोगशाला त्वचा और नरम ऊतक घाव भरने में रुचि है, हम रणनीतिक कोलेजन त्वचीय और epidermal मेजबान द्वारा उत्थान का समर्थन करता है, जबकि आतंच स्वाभाविक रूप से संवहनी नेटवर्क के गठन के 9 लाती के बाद कोलेजन और आतंच की एक bilayer लागू. इसके अलावा, यह अब समझ में आ रहा है कि पार से बात करते त्वचा keratinocytes, तंतुप्रसू के, और अंतर्निहित संवहनी नेटवर्क proliferating के बीच होता है, और इस जटिलतंत्र उचित घाव 10 उपचार के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है. एक अंतर्निहित संवहनी नेटवर्क के बिना, ऊतक इंजीनियर त्वचा grafts मेजबान ऊतक के साथ inosculating कठिनाई होती है. इसलिए, हमारे समग्र परिकल्पना है कि कोलेजन और आतंच, जब ASCs के साथ संयोजन में एक bilayer के रूप में प्रयोग किया जाता है, रक्त वाहिका, चमड़े, और फिर से किसी जख् के ऊपर उपकला की वृद्धि हो जाने से जख्म का भर जाना प्रक्रियाओं में से एक या एक से अधिक चरणों में सुधार घाव भरने के समय कम हो जाएगा.
आतंच थ्रोम्बिन monomeric फाइब्रिनोजेन से व्युत्पन्न थॉम्बिन की क्रिया द्वारा रक्त के जमने के दौरान कोई ब्रिनोजेन के द्वारा हटाया गया पदार्थ की दरार की मध्यस्थता के बाद गठित एक बहुमुखी biopolymer है. आतंच hemostatic एजेंट (अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित) के रूप में और नरम ऊतक विच्छेदन के रूप में ऐसी प्रक्रियाओं सहित नैदानिक अनुप्रयोगों, की एक किस्म में एक सीलेंट के रूप में किया गया है नैदानिक इस्तेमाल किया. वाणिज्यिक allogeneic फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन शुद्ध आतंच hydrogels से पिछले दशक में किया गया है व्यापक रूप से ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया. हालांकि, मैं कुछ बड़े नुकसानn एक आतंच hydrogel का उपयोग 1) पाड़ के लिए क्षमता के लिए छोटा, 2) ऊतक संरचनाओं इंजीनियर के उचित गठन से पहले कम यांत्रिक कठोरता, और 3) तेजी से गिरावट हो सकती है. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, आतंच के लिए पहले प्रयोग के लिए एक बेहतर तीन आयामी ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ के रूप में सेवा करने के लिए संशोधित किया जा चाहिए. ऐसा ही एक दृष्टिकोण polyethylene glycol (खूंटी आतंच) के साथ आतंच copolymerizing है. हमारी प्रारंभिक काम खूंटी आतंच के कई अनूठी विशेषताओं है कि असंशोधित आतंच सहित अन्य hydrogel ड्रेसिंग, पर घाव भरने में यह लाभप्रद बनाने का प्रदर्शन किया है. PEGylated - आतंच दोनों कृत्रिम hydrogels और प्राकृतिक सामग्री की अनूठी विशेषताओं को दर्शाती है. विशेष रूप से, खूंटी की उपस्थिति अत्यधिक हाइड्रेटेड (> 90% पानी) exudates के प्रबंधन के लिए नम वातावरण प्रदान करता है. दूसरा, आतंच की उपस्थिति सामग्री biodegradability प्रदान, तथापि, पूर्व के परिणाम बताते हैं कि PEGylated आतंच काफी अधिक unPEGylated आतंच से इन विट्रो में स्थिर है हमारे bilayer के दूसरे घटक कोलेजन है. कोलेजन सर्वत्र स्तनधारियों में व्यक्त की है और कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए एक अनुलग्नक के प्रत्यक्ष साइट के रूप में कार्य करता है एक प्राकृतिक biomaterial है. विभिन्न ऊतकों कोलेजन के विभिन्न प्रकार (प्रकार 1-type29) व्यक्त, ऊतक के कार्यात्मक की जरूरत के प्रकार पर निर्भर करता है. कोलेजन अन्य अंतर्निहित गुण है कि हमारे मॉडल में यह अत्यधिक आकर्षक बनाने हैं कि 1) यह गैर भड़काऊ है, 2) कोलेजन दोनों पूरी अपमानित और उपकरणों, biocompatible, 3) यह एक अत्यंत झरझरा hydrogel, 4) सेल घुसपैठ का समर्थन करता है और प्रवास, 5) स्टेम सेल, 6) के multipotency के रखता है यह modulating तैयार द्वारा ट्यून करने योग्य है, और 7) यह आसानी से मेजबान ऊतक के साथ inosculates. त्वचा और मुलायम ऊतकों के उत्थान में हमारे अध्ययन के लिए, कोलेजन की एक bilayer मिलकर संयुक्त एक प्राकृतिक के बाद से पसंद हैयह बेहद गहरी त्वचीय क्षेत्रों सहित त्वचा, दुनिया भर में व्यक्त किया है, और एक immunohistochemistry के लिए एक घाव की गहराई का आकलन मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम तकनीक के लिए एक साथ "stemness" के ASCs के बनाए रखने, जबकि विभिन्न संवहनी सेल के प्रकार की ओर ASCs फर्क प्रदर्शित करता है. त्वचा और उसके अंतर्निहित कोमल ऊतक के अध्ययन के लिए, कोलेजन और खूंटी-आतंच सीधे लागू कर रहे हैं. हालांकि, अन्य bioscaffold सामग्री उनके पता लगाया अद्वितीय क्षमताओं का अध्ययन करने के लिए अन्य प्रकार की कोशिकाओं में ए एस सी प्रेरित करने के लिए लागू किया जा सकता है. यहाँ लागू तकनीक स्टेम सेल phenotypes को नियंत्रित करने में बाह्य मैट्रिक्स के महत्व पर प्रकाश डाला मदद करता है और त्वचा के उत्थान के लिए स्तरित कंपोजिट के अन्वेषण के लिए विश्वसनीयता बख्शी है. सारांश महत्वपूर्ण कदम सीमाएँ संभव संशोधन समस्या निवारण
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Disclosures
कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों मौजूद हैं.
अस्वीकरण
राय या दावे को समाहित इस के साथ साथ लेखक के निजी विचार हैं और अधिकारी के रूप में या रक्षा या अमेरिकी सरकार के विभाग के विचारों को दर्शाती है यह अर्थ लगाया जा नहीं रहे हैं. लेखकों अमेरिकी सरकार के कर्मचारी हैं, और यह काम उनके सरकारी कर्तव्यों के भाग के रूप में तैयार किया गया था. सभी काम अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान द्वारा समर्थित किया गया. इस अध्ययन की समीक्षा की और अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार में अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किया गया.
Acknowledgments
एस.एन. पिट्सबर्ग ऊतक इंजीनियरिंग पहल से एक Postdoctoral फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. DOZ जिनेवा फाउंडेशन से सम्मानित किया गया अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma-Aldrich | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | - | - | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus Corporation | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
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