Engineering A Bilayered Hydrogel å kontrollere ASC differensiering

Summary

Denne protokollen fokuserer på å utnytte den iboende evne stamceller til å ta signalet fra sin omkringliggende ekstracellulær matrix og bli overtalt til å differensiere i flere fenotyper. Dette metoder manuskript utvider vår beskrivelse og karakterisering av en modell utnytte en bilayered hydrogel, sammensatt av PEG-fibrin og kollagen, å samtidig co-differensiere adipose-avledet stilk celler

Abstract

Naturlige polymerer i løpet av årene har fått mer betydning på grunn av sin vert biokompatibilitet og evne til å samhandle med celler in vitro og in vivo. Et område av forskning som holder løftet i regenerativ medisin er kombinatorisk bruk av nye biomaterialer og stamceller. En grunnleggende strategi innen tissue engineering er bruken av tre-dimensjonale stillaset (f.eks decellularized ekstracellulær matrix, hydrogeler, mikro / nano partikler) for regi celle funksjon. Denne teknologien har utviklet seg fra oppdagelsen at celler trenger et substrat hvorpå de kan feste seg, spre seg, og uttrykke sin differensiert cellulær fenotype og funksjon ^2-3. Mer nylig har det også blitt bestemt at cellene ikke bare bruke slike underlag for tilhørighet, men også samhandle og ta signaler fra matrisen underlag (f.eks ekstracellulær matrix, ECM) ^4. Derfor cellene og stillaser har en gjensidig forbindelse somtjener til å styre vev utvikling, organisering, og ultimate funksjon. Er adipose-avledet stilk celler (ASCs) mesenchymale, ikke-hematopoetic stamceller som finnes i fettvev som kan vise multi-avstamning differensiering og tjene som en lett tilgjengelig kilde til celler (dvs. pre-vaskulær endothelia og pericytes). Vår hypotese er at adipose-avledet stilk celler kan være rettet mot ulike fenotyper samtidig ved å co-dyrkning dem i bilayered matriser ^1. Vårt laboratorium er fokusert på dermal sårtilheling. Til dette formålet har vi opprettet en enkelt sammensatt matrise fra de naturlige biomaterialer, fibrin, kollagen, og kitosan som kan etterligne egenskapene og funksjonene til en dermal-spesifikk sårtilheling ECM miljø.

Protocol

1. Isolere adipose-avledet stilk celler (ASCs) ^{1, 5}

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Isoler rotte perirenal og epididymal adipose og vask med sterilt Hank bufret salt-løsning (HBSS) inneholder 1% fosterets storfe serum (FBS) som tidligere beskrevet ^fem. Denne studien er gjennomført i samsvar med dyrevernloven, gjennomføringsreglene dyrevernnemnder forskrift og i samsvar med prinsippene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
2. Finhakk vev og overføre 1-2 g til 25 ml HBSS inneholder 1% FBS inn en 50-ml rør og sentrifuger ved 500 gr i 8 min ved romtemperatur.
3. Samle frittflytende fettvev lag og overføring til 125-mL erlenmeyerkolbe og behandle med 25 mL collagenase type II (200 U / ml) i HBSS for 45 min ved 37 ° C på en orbital shaker (125 rpm). Fjern forsiktig væskefraksjon (under olje-og adipose lag) ved pipeting og filtrere det sekvensielt gjennom en 100 - mikrometer og 70 - mikrometer nylon mesh filter. Sentrifuger filtratet ved 500 gr i 10 min ved romtemperatur, aspirer supernatanten, og vaske pellet to ganger med 25 ml HBSS.
4. Resuspender cellen pellet i 50 ml vekst medium (MesenPRO RS Basal Medium) supplert med MesenPRO RS Vekst Supplement, antibiotika-antimykotiske (100 U / ml av penicillin G, 100 mikrogram / ml streptomycin sulfat, og 0,25 mikrogram / ml amfotericin B), og 2 mm av L-glutamin og pipette celler i to T75 kolber (25 ml / kolbe).
5. Kultur i ASC i en 5% CO _2-fuktet inkubator ved 37 ° C (passasje 2-4 ASCs er brukt i alle eksperimenter).

2. Forberede Chitosan Mikrokuler (CSMs)

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

5. Emulsify en vandig løsning av kitosan (6 ml 3% w / v kitosan i 0,5 M eddiksyre) i en 100 mL en oljefasen blanding bestående av soyaolje, n-oktanol (1:2 v / v) og 5 % sorbitan-mono-oleate (span 80) emulgator, bruke overhead (1700 rpm) og magnetiske røring (1000 rpm) samtidig i motsatte retninger. Denne doble metoden for å blande sikrer at miceller dannet tidlig på før tverrbindinger forekommer kan forbli i løsning og ikke å bosette til bunnen. Videre den magnetiske oppsikt baren hjelpemidler i de-aggregere kitosan under miceller formasjon og rigidization.
1. Rør blandingen kontinuerlig røres i ca 1 time til en stabil vann-i-olje emulsjon oppnås. Initiere ionisk kryss linking med tillegg av 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroksid i n-oktanol hvert 15 min for 4 t (24 ml totalt)
2. Tørk de gjenopprettede kuler i et vakuum eksikkator og analysere uten videre bearbeiding. Du kan bestemme den gjennomsnittlige CSM partikkelstørrelse, areal per milligram, og enheten kubiske volumet ved hjelp av en partikkelstørrelse analysator.
3. For etterfølgende eksperimenter, vaske CSM tre ganger med sterilt vann for å fjerne rester av salter og sterilisere ved å vaske over natten med 5 ml absolutt etanol.

3. Bestemmeantall gratis aminogrupper i CSMs

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Bestem antall gratis aminogrupper stede i CSMs etter ionisk kryss linking ved å bruke trinitro benzenesulfonic (TNBS) syre analysen av Bubnis og Ofner ^6. Inkuber 5 mg mikrosfærer med 1 mL 0,5% TNBS løsning i en 50-ml glass tube for 4 timer ved 40 ° C og hydrolyserer med tillegg av 3 mL 6N HCl ved 60 ° C i 2 timer.
2. Kjøl prøvene til romtemperatur og trekke ut de frie TNBS ved å tilsette 5 ml avionisert vann og 10 ml ethyl ether.
3. Varm en 5-ml delmengde av den vandige fasen til 40 ° C i vannbad i 15 min å fordampe eventuelle gjenværende eter, avkjøles til romtemperatur, og fortynn med 15 ml vann.
4. Mål absorbansen ved 345 nm med et spektrofotometer ved hjelp TNBS løsning uten kitosan som blank og kitosan brukes til CSM poppreisning for å fastslå det totale antallet aminogrupper. Anslå antall gratis aminogrupper av CSM forhold til kitosan.

4. Laster ASC i CSM

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Stabilisere 5 mg av steriliserte CSMs fra § 2.5 i sterile HBSS natten og legge til en 8 - mikrometer porestørrelse membran kultur plate innsatsen (24-brønns plate).
2. Etter at CSMs har avgjort på membranen, nøye Aspirer HBSS og legge 300 mL av vekst medium til innsiden av innsatsen og 700 mL av vekstmedier til utsiden av innsatsen.
3. Resuspender ASCs på riktig konsentrasjon (1 × ^{4-4 oktober} × 10 ⁴⁾ i 200 mL av vekstmedium og frø over CSM inne i kulturen plate innsatsen. Den endelige volum medium innenfor kulturen innsatsen, etter seeding, er 500 mL.
4. Incubspiste ASC seeded på CSMs i 24 timer i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.

5. Bestemme Andel ASC Loading og celleviabilitet i CSMs

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Etter inkubasjon pipettér den ASC-lastet CSM i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifuge tube uten å forstyrre de cellene som har migrert inn innsatsen membranen.
2. Fjern rester medium og tilsett 250 mL av frisk vekst medium til røret.
3. Til hver tube, legg 25 mL av MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] oppløsning (5 mg / ml) og inkuberes i 4 t i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.
4. Etter inkubasjon fjerne medium, legge 250 mL av dimethyl sulfoxide, og vortex blandingen for 2-5 min til solubilize den formazanforbindelse komplekset.
5. Sentrifuger CSM på 2700 gfor 5 min, pipette av supernatanten og bestemme sin bølgelengdeabsorbans på 570 nm og 630 nm ved hjelp av en standard plateavleseren, ifølge MTT produsentens spesifikasjoner.
6. Bestem celle nummer tilknyttet CSMs forhold til de verdier hentet fra definerte ASC tall dyrket for å utvikle en standard kurve.

6. Forberedelse og karakterisering av ASC-CSM Innebygd i PEG-fibrin Gels

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Polyetylenglykol (PEG) fibrin (PEG-fibrin) hydrogel utarbeidet av Suggs m.fl. ⁷ ved å løse opp succinimidyl glutarate modifisert polyetylenglykol (PEG; 3400 Da). Bruke 4 mL av tris-saltløsning (TBS, 7,8 pH) og filter sterilisere med en 0.22-mikrometer filter rett før eksperimentet. Oppløst PEG er bare effektiv i dette programmet for de første 3-4 timene.
2. Bland 500 μ l av fibrinogen lager (40 mg / ml i TBS, 7,8 pH) og 250μl av PEG lager i en kultur godt av en 6-brønns plate og inkuber i 20 minutter i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C. Denne blandingen utgjør en molar konsentrasjon forholdet 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogen.
3. Ta 250 mL av ASC-CSM i en konsentrasjon på 5 mg CSM, (≈ 2 × 10 ⁴ celler) og bland med pegylert fibrinogen løsningen.
4. Umiddelbart tilsett 1 ml av trombin lager (25U/mL) og raskt triturate en eller to ganger med pipetten. Etter å blande trombin med PEG-fibrinogen, umiddelbart plasserer celle-gel blanding i en 12-brønns plate og inkubert i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C i 10 min for å tillate fullstendig gelation. Siden gelation tiden er rask, ikke prøv og hold gel løsning i løpet av pipettespissen for mer enn 5 sekunder. Den pegylert fibrinogen er spaltes av trombin og danner en pegylert fibrin hydrogel. Som sådan, the endelige gel produktet kalles PEG-fibrin.
5. Vask PEG-fibrin gels to ganger med HBSS og inkuber med alfa minimale essensielle media (α-MEM) supplert med 10% FBS i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.
6. Observer migrasjon av celler fra CSM inn i gelen over en 11-dagers periode ved hjelp av standard lysmikroskopi teknikker.

7. Forberedelse og karakterisering av ASC-CSM Embedded i kollagen Gels

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Mix ASC-CSM (5 mg inneholder ≈ 2 × 10 ⁴ celler) med type 1 kollagen (7,5 mg / ml) hentet fra rotte hale sener i henhold til metoden for Bornstein ⁸ og fibrillate etter justering av pH til 6,8 med 2N NaOH.
2. Legg til fibrillated kollagen-ASC-CSM blandingen til en 12-brønns plate og Inkuber i 30 min i en 5% CO ₂ humidifisert inkubator ved 37 ° C.
3. Etter fullført flimmer, Inkuber kollagen-ASC-CSM gels for opp til 11 dager i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.
4. Observer migrasjon av celler fra CSM inn i gelen over en 11-dagers periode ved hjelp av standard mikroskopi teknikker.

8. Utvikling av Bilayered PEG-fibrin-(ASC-CSM)-kollagen Gel konstruksjoner

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. For å utvikle den bilayer konstruere, forberede både kollagen og PEG-fibrin geleer som beskrevet ovenfor, med små modifikasjoner. Kort, for å studere de trekkende og co-induksjon egenskapene til en eneste kilde til stamceller ved hjelp av to bioscaffolds, "sandwich" den ASC-CSMs mellom kollagen og PEG-fibrin stillasene ved hjelp av en fire-trinns prosess: 1) Last ASC på CSM, 2) felles fibrillated kollagen gel og lag de ASC-CSM perler over colLågen gel, 3) cast PEG-fibrin gel over ASC-CSM-kollagen gel og la gel å stivne, og 4) legge medium til godt og sette inn for å studere celler in vitro eller fjerne fra innsatsen for in vivo-applikasjoner (se figur 1 ).
2. Forbered en 1-ml type 1 kollagen (7,5 mg / ml) blanding som beskrevet ovenfor i 7.1, uten å legge ASC-CSM til blandingen. Sett blandingen i en seks-brønns vevskultur innsatsen (8 mikrometer porestørrelse) og inkuberes i 30 min i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.
3. Etter fullført flimmer, lag over kollagen overflaten 5 mg av ASC-CSM (10 000 celler / mg) suspendert i kultur media (200 mL). Etter mikrosfærer har lagt seg over gel, utarbeide PEG-fibrin gel som beskrevet i kapittel 6.0, uten å legge ASC-CSM til blandingen, og lag den pegylert fibrinogen / trombin-løsning over ASC-CSM-kollagen lag. Ved utarbeidelsen av PEG-fibrin gel, bruk 250 mL av cellekultur medium i stedet for than 250 mL av medium som inneholder cellene.
4. Etter fullført, Inkuber konstruerer for 30 min i en 5% CO ₂ fuktet inkubator for å oppnå fullstendig gelation før fôring konstruktet med kultur medium.
5. Etter fullført gelation, sted 1 mL medium i det øvre kammeret over konstruksjonen og 3 mL medium i det nedre kammeret.

9. Å gjøre Stamløsninger

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

• Kalsiumklorid lager (40 mm): Bruk bare CaCl ₂ 0.2 H ₂ O. Løs 588,4 mg av CaCl ₂ 0.2 H ₂ O med 100 ml avionisert vann. Steriliser ved hjelp av en 0.22-mikrometer filter.
• Polyetylenglykol: PEG er svært reaktive med oksygen og kan bli oksidert når de utsettes for luften i rommet. Som sådan bør PEG lagres under nitrogen (N ₂₎ atmosfære. Accurately veie 32 mg i en 2-ml sentrifugerør (sørg for å rense rørene med N ₂ før bruk) og oppbevar ved -80 ° C til den er klar til bruk. Løs 32 mg av PEG i 4 mL TBS løsning før bruk.
  Følgende løsninger må gjøres frisk før hvert eksperiment.
  
• TBS løsning: (pH 7,75 til 7,77 ved 25 ° C; pH ved 25 ° C er svært kritisk). For å forberede 15 ml TBS løsning, bør oppløse en buffer tablett i filteret-steriliseres avionisert vann og juster til ønsket pH. Ikke oppbevar stamløsning-forberede det friskt hver gang.
• Fibrinogen løsning: (40 mg / ml). Løs fibrinogen pulver i TBS å gjøre fibrinogen konsentrasjon 40 mg / ml. Oppløse den over natten med en magnetrører ved 4 ° C. Det er lettere å oppløse hele 1-g mengde med den nødvendige mengden av TBS. Dagen etter, fjerne fibrinogen fra 4 ° C (vanligvis overskyet) og la detå varme i vannbad til en homogen løsning er oppnådd. Til slutt, filtrere sterilisere fibrinogen ved hjelp av en 0.45-mikrometer filter.
• Trombin løsning (25 enheter / ml): For å få trombin løsningen, veie ut den nødvendige mengden og oppløse med preparerte 40 mM CaCl ₂ 0.2 H ₂ O. Det er alltid en god praksis å bruke hele hetteglasset av trombin å gjøre lager. Eksempel: Løs en flaske av 5 KU trombin med 200 mm av CaCl ₂ 0.2 H ₂ O, alikvoter og oppbevares ved -20 ° C.

10. Representative Resultater

Det overordnede målet for teknikken som presenteres her er å vise potensialet i samtidig matrix-drevet differensiering av ASC i flere fenotyper med CSM som en levering kjøretøy. Vi viser en in vitro strategi for å levere stamceller fra CSMs inn en bilayered kollagen-PEG-fibrin stillaset. Karakterisering av ASC integrert i dette stillaset revealed som ASC-lastet CSMs kan "klemt" mellom et lag av kollagen og PEG-fibrin samtidig og ulikt ta signalet fra begge ekstracellulære miljøer til å trives under sine nye betingelser. Vi har først karakterisert muligheten for modellsystem for å opprettholde celleviabilitet og trekkende kapasiteter. Kollagen støttet evne ASCs å opprettholde sin «stemness," som ble demonstrert av deres uttrykk av stro-1 og deres fibroblast-lignende morfologi (Figur 2D og 2F). I motsetning, induserte PEG-fibrin de ASCs å differensiere mot en vaskulær fenotype, som er demonstrert av sin tube-lignende struktur morfologi, deres endotelial celle-spesifikk uttrykk for von Willebrand faktor (figur 2E og 2G), og pericyte-spesifikke uttrykk NG2 og trombocytter-derived vekstfaktorreseptor beta (PDGFRβ) (data ikke vist). Videre disse observerte fenotyper synes å forekomme tidlig i kultur og ble opprettholdt over 11 dager, er så DEMonstrated i figur 3.

Tabeller og Figurer

Fordeler med bilayer Konstruer:

• Stillaset alene uten celler kan utføre som en bioaktive stillas.
• PEG-fibrin kan indusere stamceller til å differensiere uten tilsetning av vekstfaktorer.
• Kollagen kan bistå i å opprettholde stamcelleforskningen fenotypen av ASCs.
• En bilayer konstruksjon kan brukes som en aktiv substrat for andre celletyper å migrere og spre (f.eks endotelceller, fibroblast og keratinocytter, glatte muskelceller, pericytes).
• Den kan brukes med hard-tissue engineering stillasene som hydroxyaptite eller demineralisert bein å regenerere hardt og mykt vev.
• Den kan brukes til å utvikle en multi-lagdelt, mangfoldig vev-konstruerte konstruksjon (som dermal-vaskulær, vaskulær-epitel, dermal-vaskulær-hypodermal, etc.).
• Den bruker en encellet kilde til samtidig utvikleflercellede rom.
• Den har potensial til å integrere med verten vev siden det er av naturlig opprinnelse.
• CSM innenfor gelen konstruktet gir en plattform for celler å migrere fra.
• Chitosan, brukes til å forberede CSM, er en velkjent aktiv kjemoterapi tiltrekkende.
• Det totale konseptet anvendt i denne protokollen for «matrise-drevet stamcelleforskningen differensiering" kan brukes til andre stamceller typer. Imidlertid er videre undersøkelse berettiget å avgjøre gjennomførbarheten av matrix-drevet differensiering. Den bilayered gel Stillaset kan fungere som et reservoar for å levere cellene i en vedvarende og kontrollert måte.
• Etter rekonstruksjon, kan gels fremdeles deles inn i enkelte komponenter.

Figur 1. Skjematisk viser det overordnede målet og prosessen av teknikken. 1) adipose-avledet stilk celler (ASCs) er loaded på kitosan mikrosfærer. 2) Kollagen er deretter helles i en 6-brønnen insert, pH justert til fibrillate kollagen, og innsatsen plasseres i en seks-brønns plate kammer. De ASC-lastet CSM sfærer blir deretter lagvis over kollagen. 3) Den pegylert fibrinogen helles deretter over kollagen (ASC-CSM) og gelled ved tilsetning av trombin. 4) Den endelige bilayer konstruksjon kan da bli fjernet fra kultur innsatsen og brukes til in vitro eller in vivo analyse.

Figur 2. Karakterisering av ASC dyrket innenfor kollagen og PEG-fibrin 3D matriser. A) Fase-kontrast mikrofotografiet av isolerte ASC passaged og vedlikeholdes ved hjelp av rutinen 2-dimensjonale cellekultur teknikker. Photomicrographs B, D, og ​​F skildre ASC-CSM kultiveres løpet av en 3-dimensjonal kollagen gel, mens C, E og G viser ASC-CSM kultiveres løpet av en 3-dimensjonal PEG-fibrin gel, både på dag 12. I B og C), er ASCs vist migrerer bort fra CSM sfære i begge stillaset typer. ASCs synes å ha en flat, spindel-lignende morfologi i kollagen (B), og samtidig opprettholde sin uttrykk for stamcelleforskningen markør stro-1 (D; pil). Når dyrket i PEG-fibrin ASCs vise flere tube-lignende strukturer og overtalt til å uttrykke slike vaskulær celle markører som von Willebrand faktor (E). Transmisjonselektronmikroskopi skildrer en typisk morfologi demonstrert av ASCs innenfor hver stillaset. ASCs i kollagen gel synes å ha mindre filopodia (FL) som strekker seg fra kroppen av cellen (F), mens ASCs vanligvis dannet lumenal (merket L) strukturer (G; pil).

Figur 3. Morfologisk analyse av ASC-CSMs mellom bilayers av kollagen og PEG-fibrin geleer. ASC-CSMs ble "klemt" mellom kollagen og PEG-fibrin geleer og vedlikeholdes i kultur i 11 dager. Den venstre column skildrer ASCs trekkende og voksende innenfor kollagen matrise og synes å ta på en spindel-lignende morfologi. Den høyre kolonnen viser ASCs migrering unna CSMs og danner rørformede strukturer gjennom PEG-fibrin gel.

Discussion

ASCs er godt kjent for sin enkle isolasjon og evne til å skille mot ulike celletyper. Med de teknikkene som beskrives i dette manuskriptet, er vi i stand til å utnytte plastisitet av ASCs ved å utsette disse cellene til flere biomatrices samtidig. Som celler migrere bort fra deres CSM basen og inn i sitt omkringliggende ekstracellulært miljø, cellene ta signalet fra stillaset og kan enten opprettholde "stemness" (kollagen) eller bli overtalt til å differensiere mot vaskulære-og vaskulær-støttende celletyper (fibrin). Siden vår lab er interessert i hud og myke vev sårtilheling, vi strategisk implementert en bilayer av kollagen og fibrin siden kollagen støtter dermal og epidermal regenerering av verten, mens fibrin naturlig induserer vaskulær nettverk formasjon ^9. Videre er det nå forstått at krysstale oppstår mellom proliferating hud keratinocytter, fibroblast, og den underliggende vaskulær nettverket, og dette kompleksemekanismen er svært kritisk for riktig sårtilheling ^10. Uten en underliggende vaskulær nettverk, vev-teknikk hud grafts har problemer inosculating med verten vev. Derfor er vår generelle hypotese at kollagen og fibrin, når den brukes som en bilayer i kombinasjon med ASCs, vil redusere sårheling ganger ved å forbedre en eller flere faser av blodkar, dermal, og re-epithelialization prosesser.

Fibrin er en allsidig biopolymer dannet etter trombin-mediert spalting av fibrinopeptide En avledet fra monomerisk fibrinogen. Fibrin har blitt brukt klinisk som en hemostatic agent (godkjent av US Food and Drug Administration) og som tetningsmasse i en rekke kliniske anvendelser, inkludert prosedyrer som for eksempel soft-vev disseksjon. Fibrin hydrogeler fra kommersielt renset allogen fibrinogen og trombin har blitt brukt mye i det siste tiåret i en rekke vev-tekniske anvendelser. Men noen store ulemper in bruke en fibrin hydrogel kan være 1) potensialet for stillaset til å krympe, 2) lav mekanisk stivhet, og 3) rask degradering før riktig dannelse av vev-konstruerte strukturer. For å overvinne disse problemene, må fibrin å bli endret før bruk for å tjene som en bedre tredimensjonal tissue-engineering stillaset. En slik tilnærming er copolymerizing den fibrin med polyetylenglykol (PEG-Fibrin). Vårt foreløpige arbeid har demonstrert flere unike funksjoner i PEG-fibrin som gjør det fordelaktig i sårheling over andre hydrogel bandasjer, inkludert umodifisert fibrin. Pegylert-fibrin har unike egenskaper både syntetiske hydrogeler og naturlige materialer. Nærmere bestemt, gir tilstedeværelsen av PEG en svært fuktig (> 90% vann) fuktig miljø for å håndtere eksudater. Sekund, gir nærvær av fibrin biodegradability til materialet, men tidligere resultater viser at pegylert fibrin er vesentlig mer stabilt in vitro enn unPEGylated fibrin

Den andre komponenten i bilayer vår er kollagen. Kollagen er et naturlig biomateriale ubikvitært uttrykt i pattedyr og fungerer som en direkte område av vedlegg for ulike typer celler. Ulike vev uttrykke forskjellige typer kollagen (type 1-type29), avhengig av funksjonelle behov for vev. Andre iboende egenskaper kollagen som gjør det svært attraktivt i vår modell er at 1) det er ikke provoserende, 2) både hel og degradert komponenter av kollagen er biokompatible, 3) det er en svært porøs hydrogel, 4) den støtter celle infiltrasjon og migrasjon, 5) det opprettholder multipotency av stamceller, 6) det er fleksibel med modulerende formulering, og 7) det lett inosculates med verten vev. For våre studier i hud og mykt vev gjenfødelse, er en bilayer sammensatt bestående av kollagen et naturlig valg sidendet er høyt uttrykt gjennom huden, blant dype dermale regioner, og kan brukes som en markør immunhistokjemi å vurdere dybden av et sår.

I denne protokollen, viser vi en teknikk for å samtidig opprettholde "stemness" av ASCs mens differensiere ASCs mot ulike vaskulære celletyper. For studiet av huden og dens underliggende bløtvev, kollagen og PEG-fibrin er direkte anvendelig. Imidlertid kan andre bioscaffold materialer settes i verk for å studere deres utforsket unike evner til å indusere ASC til andre celletyper. Teknikken gjennomføres her bidrar til å markere betydningen av ekstracellulær matrix i styrende stilk cellen fenotyper og låner troverdighet til utforskningen av lagdelte kompositter for hud regenerering.

Oppsummering

Kritiske trinn

• Kollagen bør justeres til riktig isoelektrisk pH (pH6.8-7.1) for å indusere flimmer og få en stabil gel structure.
• PEG bør utarbeides friskt før blanding med fibrinogen løsning siden holdbarheten av kammervann PEG er kort (4-5 timer).
• Inkubasjonstid av fibrinogen-PEG blandingen bør ikke overskride 25 minutter (ved 37 ° C), siden over-inkubasjon kan forårsake en grumset ugjennomsiktig nedbør i løpet av gelation.
• Etter å legge trombin til pegylert fibrinogen løsningen, skal blandingen utlevert til kultur setter umiddelbart (etter forsiktig blanding med en pipette). Holding løsningen blandingen i pipettespissen for en lengre tid (> 30 sek) kan forårsake gelation innenfor pipettespissen og problemer med å skaffe jevnt strømmet gels.
• Bruk jevnt store mikrosfærer og jevnt fordelt celler over CSM sengen er kritisk for optimal celle lasting. CSM størrelse variasjon i diameter påvirker direkte areal tilgjengelig for celle vedlegg per milligram av mikrosfærer, mens jevnt fordelt ASC-CSM direkte påvirker celle migrasjon inn than stillasene. Cellen-lastet mikrosfærer (ASC-CSM) bør fordeles jevnt på toppen av kollagen gel for å sikre enda migrasjon av ASCs i stillaset. Dersom fordelingen av ASC-CSMs er for tett, vil cellen migrasjon blir konsentrert til et bestemt område innenfor gels og kan begrense celle-celle interaksjon post-migrering.
• Sørg for at volumet av media lagt til ytre godt av cellekultur innsatsen er høyere enn menisken av den indre brønnen. Vanligvis en indre: er ytre volum ratio på 1:2 er aktuelt, da dette letter celler feste til mikrosfærer.

Begrensninger

• Denne metoden er begrenset til det totale arealet tilgjengelig på mikrosfærer. Hvis en høyere celle nummer er ønskelig, er mer mikrosfærer nødvendig for å øke arealet.
• Siden cellene er ment å migrere fra mikrosfærer, kan en forskyvning i tid observeres for den første migrering av celle på og innenfor de gels.
• Den mikrosfærer er i grenselandet mellom to geler (kollagen og PEG-fibrin), og dette kan begrense / ta lenger tid for migrasjon av celler til distale endene av geler.
• Under byggingen av bilayer, har pegylert fibrinogen-trombin blandingen som skal legges raskt over en CSM-ASC seng på toppen av kollagen. Dette kan føre til ujevn re-distribusjon av ASC-CSMs. Ved ujevn re-distribusjon av ASC-CSMs i grensesnittet under PEG-fibrin gel casting, kan gelen konstruktet være langsomt opprørt manuelt raskt videredistribuere mikrosfærer før fullstendig gelation.
• Denne metoden er begrenset til celler som har trekkende egenskaper og kan ikke være egnet til å levere forankringspunkter uavhengige celletyper.
• Den kollagen løsning før flimmer forblir i sure pH og begrenser direkte blanding av celler i løpet av kollagen gel. Som sådan, hvis ikke justeres innenfor en rimelig tidsramme (~ 30 min), kan celleviabilitet bli kompromittert.
• Siden gEls som brukes i denne konstruksjonen er individuelt lagvis, en mulig avbrudd eller separasjon av gels kan oppstå under håndtering prosess. Derfor kan det begrense letthet i håndtering under in vivo studier.

Mulige Modifikasjoner

• ASC-CSMs kan fordeles jevnt innenfor de enkelte gels stedet for stabling dem på grensesnittet.
• ASCs kan være direkte blandet innenfor enkelte gels snarere enn å levere ved CSM, men dette kan begrense utviklingen av høyt organiserte celle-mønstrede vev konstruksjoner.
• For å unngå ujevn re-distribusjon av ASC-CSMs under PEG-fibrin casting, kan ASC-CSMs henges i et lite volum av vandig kitosan løsning (1% w / v) og fordeles jevnt over kollagen gel. Dette vil sikre fast feste av ASC-CSMs over kollagen gel laget og vil hindre dislodging av ASC-CSMs fra kollagen overflaten.
• Konstruktet seg selv kan utnyttes på en omvendt måte, dvs. PEG-fibrin gels kan bli kastet først og ASC-CSMs kan være frø på toppen av PEG-fibrin gels etterfulgt av kollagen gel. Gjør du det tillater brukeren å kaste fibrillated kollagen løsningen over (ASC-CSM)-PEG-fibrin lag mer forsiktig siden, i motsetning PEG-fibrin geleer, krever fibrillated kollagen løsning ekstra tid (30 minutter) å stivne. Ved å vedta denne prosessen kan en sørge for å opprettholde jevn fordeling av ASC-CSM.
• De gels (kollagen og / eller PEG-fibrin geler) kan innarbeides med mitogens, som vekstfaktorer (f.eks vaskulær endotelial vekstfaktor, fibroblast vekstfaktorer), slik som å indusere raskere celle migrasjon og spredning.

Feilsøking

• Under flimmer av kollagen løsning, hvis pH overstiger isoelektrisk pH> 7,2, bør pH justeres ved enten å legge mer kollagen stamløsning, senke pH ved hjelp av svak syre løsning.
• Ved utarbeidelsen av CSM, hvis en stor variasjon i størrelse okkupertrs, deretter en rekke parametere kan justeres for å gi ønsket CSM størrelse (Viskositeten kitosan stamløsningen, volum av surfactant, omrøring hastighet, etc.).
• Ved treg celle migrasjon når fyller de gels, kan et høyere antall ASC-CSMs brukes for å øke antall celler migrere ut av CSM inn i geler.
• Prosessen med PEG-fibrinogen gelation kan være tilbakestående ved å kutte volumet av trombin tilsettes blandingen (typisk 900 mL i stedet for 1 ml) eller forbereder en lavere konsentrasjon lager av trombin (20 U / ml i stedet for 25 U / ml) . Dette gjør tregere gelation av PEG-fibrinogen blandingen og dermed gir ekstra tid for forsiktige støping av pegylert-fibrinogen og trombin blandingen over ASC-CSMs.
• Under inkubasjon, hvis en fase separasjon oppstår (mellom kollagen og fibrin gel), kan en steril Teflon O-ring skal plasseres på toppen konstruktet å sikre festing av gel faser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO, by Life Technologies	14175	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Consumable
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6685	Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Consumable
MesenPRO Growth Medium System	Invitrogen	12746-012	Consumable
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030	Consumable
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C8106	Consumable
T75 Tissue Culture Flask	BD Biosciences	137787	Consumable
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consumable
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Consumable
N-Octanol	Acros Organics	150630025	Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate	Sigma-Aldrich	S6760	Consumable
Potassium Hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767	Consumable
Acetone	Fisher Scientific	L-4859	Consumable
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741	Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid	Sigma-Aldrich	P2297	Consumable
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	320331	Consumable
Ethyl Ether	Sigma-Aldrich	472-484	Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts	BD Biosciences	353097	Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Consumable
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655)	Molecular Probes, Life Technologies	Q2502PMP	Consumable
Type 1 Collagen	Travigen	3447-020-01	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Consumable
12-Well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	Consumable
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F3879	Consumable
Thrombin	Sigma-Aldrich	T6884	Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene	Sunbio	DE-034GS	Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6)	Sigma-Aldrich	T5030	Consumable
Centrifuge	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Model 370	Equipment
Overhead Stirrer	IKA	Visc6000	Equipment
Magnetic Stirrer	Corning	PC-210	Equipment
Vacuum Desiccator	-	-	Equipment
Particle Size Analyzer	Malvern Instruments	STP2000 Spraytec	Equipment
Water Bath	Fisher Scientific	Isotemp210	Equipment
Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer	Equipment
Vortex	Diagger	3030a	Equipment
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Equipment
Light/Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	IX71	Equipment
Confocal Microscope	Olympus Corporation	FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope	Equipment
Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Leo 435 VP	Equipment
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEOL 1230	Equipment