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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

Published: May 25, 2012 doi: 10.3791/3953
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Extremity Trauma Research and Regenerative Medicine, United States Army Institute of Surgical Research, 2Department of Biomedical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Este protocolo é focado na utilização a capacidade inerente de células estaminais para tomar cue a partir de sua matriz circundante extracelular e ser induzidas a diferenciar-se em múltiplos fenótipos. Este manuscrito métodos estende nossa descrição e caracterização de um modelo utilizando um hidrogel de camada dupla, composto de PEG-fibrina e colagénio, ao mesmo tempo, co-diferenciar células-tronco adiposas

Abstract

Polímeros naturais ao longo dos anos ganharam mais importância devido à sua biocompatibilidade hospedeiro e capacidade de interagir com células in vitro e in vivo. Uma área de investigação que tem a promessa em medicina regenerativa é o uso combinatória de novos biomateriais e células estaminais. Uma estratégia fundamental no campo da engenharia de tecidos é o uso de tridimensional andaime (por exemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogéis, micro / nano partículas) para dirigir a função da célula. Esta tecnologia tem evoluído a partir da descoberta de que as células precisam de um substrato sobre o qual podem aderir, proliferar, e expressar seu fenótipo diferenciado celular e função 2-3. Mais recentemente, tem sido também determinado que as células não só a utilização destes substratos para a adesão, mas também interagir e tomar pistas a partir do substrato da matriz (matriz, por exemplo, extracelular, ECM) 4. Portanto, as células e andaimes ter uma ligação recíproca queserve para controlar o desenvolvimento do tecido, organização e função final. As células-tronco adiposas (ASC) são mesenquimais, as células estaminais hematopoiéticas não-apresentar no tecido adiposo que podem exibir multi-linhagem diferenciação e servir como uma fonte prontamente disponível de células (isto é pré-vascular endotélio e pericitos). Nossa hipótese é que as células-tronco derivadas de tecido adiposo pode ser direcionado para diferentes fenótipos simultaneamente, bastando co-cultura-los em matrizes bifásicos 1. O nosso laboratório é focado sobre a cicatrização de feridas dérmica. Para este fim, foi criada uma única matriz composta a partir de os biomateriais naturais, fibrina, colagénio, quitosano e que pode imitar as características e funções de um ambiente de cicatrização da ferida dérmica específico ECM.

Protocol

1. Isolamento de células-tronco adiposas (ASC) 1, 5

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  1. Isolar adiposo epididimal e perirenal rato e lavar com solução de Hank estéril tamponada de sal (HBSS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), como 5 descrito anteriormente. Este estudo foi conduzido em conformidade com o Animal Welfare Act, os regulamentos de execução do bem-estar animal e de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
  2. Picar o tecido e transferir 1-2 g em 25 mL de HBSS contendo FBS a 1% para um tubo de 50 ml e centrifugar a 500 g durante 8 minutos à temperatura ambiente.
  3. Recolher o de flutuação livre camada de tecido adiposo e transferência para 125-mL Erlenmeyer e trata-se com 25 mL de colagenase tipo II (200 U / mL) em HBSS durante 45 min a 37 ° C num agitador orbital (125 rpm). Retire cuidadosamente a fração líquida (abaixo da camada de petróleo e adiposo) por pipetagem e filtrá-lo sequencialmente através de um 100 - filtro de malha de nylon mM - mM e 70. Centrifugar o filtrado a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante, e lavar a pelete duas vezes com 25 mL de HBSS.
  4. Ressuspender o sedimento de células em 50 mL de meio de crescimento (Meio MesenPRO RS Basal) suplementado com MesenPRO Suplemento de Crescimento RS, antibiótico-antimicótico (100 U / mL de penicilina G, 100 ug / mL de sulfato de estreptomicina, e 0,25 ug / mL de anfotericina B), e 2 mM de L-glutamina e as células de pipeta em dois frascos T75 (25 ml / balão).
  5. Cultura da ASC em um 5% de CO 2-humidificada incubadora a 37 ° C (passagem 2-4 ASC são utilizados para todas as experiências).

2. Preparação de microesferas (MCS)

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

    5. Emulsionar uma solução aquosa de quitosano (6 mL de 3% w / v de quitosano em 0,5 M de ácido acético) em 100 ml de uma mistura de fase de óleo consistindo em óleo de soja, n-octanol (1:2 v / v) e 5 % de sorbitano-mono-oleato de emulsionante (Span 80), utilizando sobrecarga (1700 rpm) e agitação magnética (1000 rpm) simultaneamente em sentidos opostos. Este método de dupla resultará uma mistura que micelas formadas no início antes de reticulação ocorre podem permanecer em solução e não para assentar no fundo. Além disso, a barra de agitação magnética SIDA em DE-agregação de quitosano durante micela formação e rigidization.
  1. Agita-se a mistura continuamente agitada durante aproximadamente 1 hora até uma emulsão de água-em-óleo estável é obtido. Iniciar transversal iónico ligação com a adição de 1,5 mL de 1% de hidróxido de w / v de potássio em n-octanol min a cada 15 durante 4 h (24 ml no total)
  2. Secam-se as esferas recuperados em um exsicador de vácuo e analisa-se sem processamento adicional. É possível determinar o tamanho médio de partícula CSM, área de superfície por miligrama, ea unidade de volume cúbico usando um analisador de tamanho de partícula.
  3. Para as experiências subsequentes, lavar o CSM três vezes com água estéril para remover os sais residuais e esterilizar por lavagem durante a noite com 5 mL de etanol absoluto.

3. Determinaro número de grupos amino livres em MCS

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  1. Determinar o número de grupos amino livres presentes na MCS após transversal iónico ligando usando o benzenossulfónico trinitro (TNBS) ensaio de ácido de Bubnis e Ofner 6. Incubar 5 mg de microesferas com 1 mL de 0,5% de solução de TNBS em um tubo de vidro de 50 mL durante 4 h, a 40 ° C e hidrolisar com a adição de 3 mL de HCl 6N a 60 ° C durante 2 h.
  2. Arrefecer as amostras à temperatura ambiente e extrair os TNBS livres por adição de 5 mL de água desionizada e 10 mL de éter etílico.
  3. Aquecer uma aliquota de 5 mL da fase aquosa para 40 ° C num banho de água durante 15 min para evaporar qualquer éter residual, arrefecer até à temperatura ambiente, e diluir com 15 mL de água.
  4. Medir a absorvância a 345 nm com um espectrofotómetro com solução TNBS sem quitosana como em branco eo quitosano utilizado para CSM preparação para determinar o número total de grupos amino. Estimar o número de grupos amino livres da MSC em relação ao quitosano.

4. Carregando ASC no CSM

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  1. Equilibrar 5 mg de MCS esterilizados de seção 2,5 em HBSS estéril durante a noite e adicionar a um 8 - mM tamanho dos poros da membrana de inserção placa de cultura (24-bem placa).
  2. Depois de os MCS se estabeleceram para a membrana, aspirar cuidadosamente os HBSS e adicionam-se 300 uL de meio de crescimento para o interior da inserção e 700 uL de meio de crescimento para o exterior do inserto.
  3. ASC Ressuspender a uma concentração adequada (1 × 10 4 e 4 × 10 4) em 200 uL de meio de crescimento e de sementes ao longo do CSM dentro do inserto placa de cultura. O volume final de meio de cultura dentro da inserção, após a semeadura, é de 500 uL.
  4. Incubcomeu o seeded ASC em MCS por 24 h em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.

5. Determinação da porcentagem de ASC Carregando e viabilidade celular em MCS

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  1. Após a incubação, pipeta CSM a ASC-carregado num tubo de microcentrífuga esterilizado 1,5 mL, sem perturbar as células que migraram para a membrana de inserção.
  2. Remover o meio residual e adicionar 250 uL de meio de crescimento fresco para o tubo.
  3. Para cada tubo, adicionar 25 ul de MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] solução (5 mg / mL) e incubar durante 4 h em um 5% de CO 2 humidificada incubadora a 37 ° C.
  4. Após a incubação, o meio de remover, adicionar 250 uL de sulfóxido de dimetilo, e vórtice a mistura durante 2-5 minutos para solubilizar o formazan complexo.
  5. Centrifugar o CSM em 2700 gdurante 5 min, pipeta fora o sobrenadante e determinar a sua absorvância a 570 nm de comprimento de onda e 630 nm, utilizando um leitor de placas de padrão, de acordo com as especificações do fabricante MTT.
  6. Determinar o número de células associadas com os MCS em relação aos valores obtidos a partir de números definidos ASC cultivadas para desenvolver uma curva padrão.

6. Preparação e Caracterização de ASC-CSM incorporado em PEG-fibrina Gels

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  1. Polietileno glicol (PEG) de fibrina hidrogel (PEG-fibrina) preparado por Suggs et al 7 por dissolução do succinimidil glutarato polietileno glicol modificado (PEG; 3400 Da). Utilizando 4 mL de solução salina tamponada com tris (TBS, pH 7,8) e um filtro esterilizar com um filtro de 0,22 mícrons imediatamente antes do início da experiência. PEG dissolvido só é eficaz nesta aplicação para as primeiras horas 3-4.
  2. Misturar 500 μ l de estoque de fibrinogénio (40 mg / mL em TBS, pH 7,8) e 250μl de PEG estoque em um poço de cultura de uma placa de 6 poços e incubar durante 20 minutos em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C. Esta mistura constitui um rácio de concentração molar de 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogénio.
  3. Tome 250 uL de ASC-CSM a uma concentração de 5 mg de CSM, (≈ 2 × 10 4 células) e misturar com a solução de fibrinogénio PEGuilada.
  4. Imediatamente adicionar 1 ml de trombina de stock (25U/mL) e tritura-se rapidamente uma vez ou duas vezes com a pipeta. Após a mistura da trombina com o PEG-fibrinogénio, imediatamente colocar a mistura de células-gel em uma placa de 12 poços e incubadas em 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C durante 10 min para permitir a gelificação completa. Desde o tempo de gelificação é rápido, não tentar segurar a solução de gel dentro da ponteira por mais de 5 segundos. O fibrinogénio peguilado é clivado pela trombina e forma um hidrogel de fibrina PEGuilada. Como th, tale produto gel final é referido como PEG-fibrina.
  5. Lavar os géis PEG-fibrina duas vezes com HBSS e incubar com alfa mínimas meios essenciais (α-MEM) suplementado com FBS 10%, em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
  6. Observar a migração de células de CSM no gel durante um período de 11 dias usando técnicas de microscopia de luz padrão.

7. Preparação e Caracterização de ASC-CSM incorporado em géis de colágeno

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  1. Mistura ASC-CSM (5 mg contendo ≈ 2 × 10 4 células) com colagénio de tipo 1 (7,5 mg / mL), extraído a partir de tendões da cauda de rato de acordo com o método de Bornstein 8 e fibrilam depois de ajustar o pH para 6,8 utilizando NaOH 2N.
  2. Adicionar a mistura de colagénio-ASC-CSM fibrilada para uma placa de 12 poços e incubar durante 30 min em um 5% de CO 2 humidified incubadora a 37 ° C.
  3. Depois de fibrilação completa, incubar os géis de colagénio-ASC-CSM para até 11 dias em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
  4. Observar a migração de células de CSM no gel durante um período de 11 dias usando técnicas de microscopia padrão.

8. Desenvolvimento de bifásicos PEG-fibrina (ASC-CSM) Constrói-gel de colágeno

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  1. Para desenvolver a bicamada construir, preparar colagénio e os géis de PEG-fibrina conforme descrito acima, com ligeiras modificações. Resumidamente, para estudar as propriedades migratórias e co-indução de uma única fonte de células-tronco usando dois bioscaffolds, "sanduíche" do ASC-MCS entre o colágeno e os andaimes PEG-fibrina, usando um processo de quatro etapas: 1) Carga ASC em CSM, 2) lançar gel de colágeno fibrilada e uma camada das pérolas ASC-CSM sobre o collagen gel, 3) fundido gel PEG-fibrina sobre o gel de ASC-CSM-colagénio e permitir gel para solidificar, e 4) adicionar meio para bem e inserir a estudar células in vitro ou remover do inserto para aplicações in vivo (ver Figura 1 ).
  2. Prepara-se uma tipo 1-1 mL de colagénio (7,5 mg / mL) A mistura tal como descrito acima em 7,1, sem a adição de ASC-CSM à mistura. Colocar a mistura em uma inserção de cultura de tecido de 6 poços (8-iM tamanho de poro) e incubar durante 30 min em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
  3. Depois de completa a fibrilação camada, sobre o colagénio mg superfície 5 de ASC-CSM (10, 000 células / mg) suspenso em meios de cultura (200 uL). Após as microesferas têm assente sobre o gel, preparar o gel PEG-fibrina conforme descrito na secção 6.0, sem a adição de ASC-CSM-se à mistura, ea camada da solução de fibrinogénio / trombina PEGuilada sobre as camadas de colagénio ASC-CSM-. Ao preparar o gel PEG-fibrina, usar 250 uL de meio de cultura celular, em substituição de tele uL de meio contendo 250 das células.
  4. Uma vez concluída, incubar as construções durante 30 min em um 5% de CO 2 incubadora humidificada para alcançar a gelificação completa antes de alimentar a construção com meio de cultura.
  5. Após a gelificação completa, o local de 1 mL de meio na câmara superior sobre o construto e 3 mL de meio na câmara inferior.

9. Fazendo Solutions Banco

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

  • Estoque de cloreto de cálcio (40 mM): Use somente CaCl 2 .2 H 2 O. Dissolve-se 588,4 mg de CaCl2 0,2 H2O com 100 ml de água desionizada. Esterilizar utilizando um filtro de 0,22 um.
  • Polietileno-glicol: PEG é altamente reactivo com o oxigénio e pode tornar-se oxidado quando exposta ao ar ambiente. Como tal, o PEG deve ser armazenado sob azoto (N 2) atmosfera. Accurately pesar 32 mg em um tubo de centrífuga de 2 ml (certificar-se para purgar os tubos com N 2 antes da utilização) e armazenar a -80 ° C até estar pronto para utilização. Dissolve-se 32 mg de PEG em 4 mL de TBS solução antes da utilização.
    As soluções a seguir deve ser feita antes de cada nova experiência.
  • TBS solução: (pH 7,75-7,77 a 25 ° C; pH a 25 ° C é muito critico). Para preparar 15 ml de solução de TBS, cuidadosamente dissolver um comprimido tampão no filtro esterilizado de água desionizada e ajusta-se o pH desejado. Não guarde a solução estoque de preparar-la fresca o tempo todo.
  • Solução de fibrinogénio: (40 mg / ml). Dissolve-se pó de fibrinogénio em TBS para fazer a concentração de fibrinogénio 40 mg / ml. Dissolve-se durante a noite com um agitador magnético, a 4 ° C. É mais fácil para dissolver a quantidade 1-g inteiro com a quantidade necessária de TBS. No dia seguinte, remover o fibrinogénio a partir de 4 ° C (geralmente turva) e permitir que elepara aquecer num banho de água até que uma solução homogénea é obtida. Finalmente, filtrar esterilizar o fibrinogénio utilizando um filtro de 0,45 mícrons.
  • A trombina solução (25 Unidades / mL): Para tornar a solução de trombina, pesar a quantidade necessária e que se dissolvem com a mM 40 preparada CaCl2 0,2 H 2 O. É sempre uma boa prática usar o frasco inteiro de trombina para fazer o estoque. Exemplo: Dissolver uma garrafa de 5 kU trombina com 200 mM de CaCl2 0,2 H2O, alíquota e armazenar a -20 ° C.

10. Os resultados representativos

O objetivo geral da técnica apresentada aqui é demonstrar o potencial de diferenciação dirigida por matriz simultânea de ASC em múltiplos fenótipos usando CSM como um veículo de entrega. Nós demonstramos uma estratégia in vitro para entregar as células-tronco a partir de MCS em uma bicamada de colágeno-PEG-fibrina andaime. Caracterização da ASC integra a presente reveale andaimed que ASC-carregados MCS pode ser "imprensada" entre uma camada de colágeno e PEG-fibrina simultaneamente e diferencialmente tomar sugestão de ambos os ambientes extracelulares a prosperar sob as novas condições. O primeiro caracteriza-se a capacidade para o sistema modelo para manter a viabilidade celular e capacidades migratórias. O colagénio suportado a capacidade de ASC para manter a sua "stemness", como foi demonstrado pela sua expressão de Stro-1 e sua morfologia de fibroblastos-like (Figura 2D e 2F). Em contraste, o PEG-fibrina induzida as ASC para diferenciar para um fenótipo vascular, como é demonstrado pela sua morfologia estrutura tubular semelhante, a sua expressão em células específicas endotelial do factor de von Willebrand (Figura 2E e 2G), e pericyte expressão específica de NG2 e crescimento derivado de plaquetas beta do receptor do factor (PDGFRβ) (dados não mostrados). Além disso, estes fenótipos observados apareceu a ocorrer no início da cultura e foram mantidas durante 11 dias, como é demtrada na Figura 3.

Tabelas e Figuras

Benefícios da bicamada Construir:

  • O andaime sozinho sem células podem funcionar como um andaime bioativo.
  • PEG-fibrina pode induzir as células estaminais para diferenciar sem a adição de factores de crescimento.
  • O colagénio pode auxiliar na manutenção do fenótipo de células estaminais de ASC.
  • Uma construção de bicamada pode ser utilizado como um substrato activo para outros tipos de células para migrar e proliferar (por exemplo, células endoteliais, fibroblastos, queratinócitos, células musculares lisas, pericitos).
  • Ele pode ser usado com andaimes duro-engenharia de tecidos como o osso hydroxyaptite ou desmineralizada para regenerar tecidos duros e moles.
  • Ele pode ser utilizado para desenvolver um multi-camadas, construto tecido de diversa (como dermo-vascular, vascular-epitelial, dérmica-vascular-hipodérmica, etc.)
  • Ele utiliza uma única fonte de células para desenvolver simultaneamentecompartimentos multicelulares.
  • Ele tem o potencial para integrar com o tecido do hospedeiro, uma vez que é de origem natural.
  • CSM dentro da construção de gel proporciona uma plataforma para as células a migrar a partir de.
  • A quitosana, usado para preparar CSM, é um conhecido químico ativo atrativo.
  • O conceito geral aplicada neste protocolo de "dirigida por matriz diferenciação de células-tronco" pode ser aplicado a células estaminais tipos outros. No entanto, mais estudos são necessários para determinar a viabilidade da matriz baseada diferenciação. A bicamada gel andaime pode atuar como um reservatório para entregar as células de uma forma sustentada e controlada.
  • Após a reconstrução, os géis podem ainda ser separado em componentes individuais.

A Figura 1
Figura 1. Esquemático que representa o objectivo global eo processo da técnica. 1) As células-tronco adiposas (ASC) são eisaded para microesferas de quitosano. 2) O colagénio é então vertida para uma inserção de 6 poços, o pH ajustado para fibrilar o colagénio ea inserção colocada em uma câmara de placa de 6 poços. As esferas ASC-carregadas da CSM são, então, colocado sobre o colágeno. 3) O fibrinogénio é ligado a PEG, em seguida, vertida sobre o colagénio (ASC-CSM) e gelificada pela adição de trombina. 4) A construção bicamada final pode então ser removido a partir da inserção de cultura e utilizado para in vitro ou in vivo análise.

A Figura 2
Figura 2. Caracterização de ASC cultivadas dentro de colagénio e as matrizes de PEG-fibrina 3D. A) fotomicrografia de contraste de fase de isolado ASC passadas e mantido usando rotina 2-dimensionais técnicas de cultura de células. As fotomicrografias B, D, E e F ilustram ASC-CSM cultivadas num gel de colagénio 3-dimensional; que C, E, e G mostram ASC-CSM cultivadas dentro de um 3-dimensional PEG-fibrina gel, tanto no dia 12. Em B e C), ASC são mostrados migrar para longe da esfera CSM em ambos os tipos de andaime. ASC parecem ter uma achatada, morfologia fusiforme em colagénio (B), mantendo a sua expressão do marcador de células estaminais Stro-1 (D; seta). Quando cultivados em PEG-fibrina ASC exibem mais do tubo estruturas semelhantes e são induzidas para expressar tais marcadores de células vasculares, como Factor de von Willebrand (E). Microscopia eletrônica de transmissão mostra a morfologia típica demonstrada pela ASC dentro de cada cadafalso. ASC em gel de colagénio parecem ter filopodia menor (fl) que se estende a partir do corpo da célula (F), enquanto que ASC tipicamente formados luminais (rotulado L) estruturas (g; seta).

A Figura 3
Figura 3. A análise morfológica de ASC-MCS entre bicamadas de colágeno e PEG-fibrina géis. ASC-MCS foram "sanduíche" entre colagénio e PEG-fibrina géis e mantidas em cultura durante 11 dias. O Colu esquerdamn representa ASC migram e proliferam dentro da matriz de colágeno e parece assumir uma morfologia fusiforme. A coluna da direita mostra ASC migram longe os MCS e formando tubo estruturas semelhantes ao longo do gel PEG-fibrina.

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Discussion

ASC são bem conhecidos pela sua facilidade de isolamento e capacidade de diferenciar para vários tipos de células. Com as técnicas descritas neste manuscrito, somos capazes de explorar a plasticidade da ASC por expor essas células para biomatrices múltiplos simultaneamente. Como as células migram para longe de sua base CSM e entrar no seu meio ambiente extracelular, as células tomar sugestão do andaime e pode manter "stemness" (colágeno) ou ser induzido a diferenciar os tipos de células para vasculares e vascular-suporte (fibrina). Uma vez que nosso laboratório está interessado em pele e tecidos moles cicatrização de feridas, que estrategicamente implementado uma bicamada de colágeno e fibrina desde colágeno promove uma regeneração dérmica e epidérmica pelo anfitrião, enquanto fibrina naturalmente induz a formação da rede vascular 9. Além disso, é agora entendido que conversa cruzada ocorre entre proliferação de queratinócitos da pele, fibroblastos, ea rede vascular subjacente, e este complexomecanismo é muito crítico para a cicatrização de feridas adequada 10. Sem uma rede vascular subjacente, enxertos de tecido-engenharia da pele têm dificuldade inosculating com o tecido hospedeiro. Portanto, a nossa hipótese geral é que o colagénio e fibrina, quando usado como uma bicamada em combinação com ASC, irá diminuir o tempo de cura da ferida através da melhoria de um ou mais estágios de vaso sanguíneo, dérmica, e re-epitelização processos.

Fibrina é um biopolímero versátil formado após a trombina mediada por clivagem do fibrinopeptídeo A derivado de fibrinogénio monomérica. Fibrina tem sido utilizada clinicamente como um agente hemostático (aprovada pela Food and Drug Administration EUA) e como um vedante em uma variedade de aplicações clínicas, incluindo os procedimentos tais como o tecido macio dissecção. Hidrogéis de fibrina comercialmente purificada fibrinogênio alogênico e trombina foram amplamente utilizado na última década em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos. No entanto, algumas desvantagens principais in, usando um hidrogel de fibrina pode ser 1) o potencial para o andaime para encolher, 2) a rigidez mecânica baixa, e 3) uma rápida degradação antes da formação adequada das estruturas de tecidos de engenharia. Para ultrapassar estes problemas, a fibrina necessita de ser modificado antes do uso para servir como uma melhor tridimensional tecido-engenharia andaime. Uma tal abordagem é copolimerização de a fibrina com polietileno glicol (PEG-fibrina). O nosso trabalho preliminar tem demonstrado várias características únicas de PEG-fibrina que tornam vantajosa na cicatrização de feridas sobre pensos de hidrogel outros, incluindo fibrina não modificado. Peguilado fibrina apresenta características únicas de ambos os hidrogéis sintéticos e materiais naturais. Especificamente, a presença de PEG fornece um ambiente altamente hidratado (> 90% de água) húmido para a gestão exsudados. Em segundo lugar, a presença de fibrina confere biodegradabilidade para o material, no entanto, os resultados anteriores mostram que a fibrina PEGuilada é significativamente mais estável do que in vitro de fibrina não PEGilado

O segundo componente da nossa bicamada é colagénio. O colagénio é um biomaterial naturais ubiquamente expressa em mamíferos e serve como um local de ligação directa para vários tipos de células. Diferentes tecidos expressar os diferentes tipos de colagénio (tipo 1-type29), dependendo do tipo de necessidade funcional do tecido. Outras propriedades inerentes de colagénio que o tornam altamente atraente no nosso modelo são de que 1) é não-inflamatória, 2) ambos os componentes integrais e degradada de colagénio são biocompatíveis, 3) é um hidrogel altamente porosa, 4) que suporta a infiltração de células e migração, 5) mantém multipotency de células estaminais, 6) é sintonizável por formulação de modulação, e 7) que prontamente inosculates com o tecido hospedeiro. Para os nossos estudos na regeneração da pele e dos tecidos moles, um composto bicamada composto de colágeno é uma escolha natural, uma vezé altamente expressa em toda a pele, incluindo profundas regiões dérmicos, e pode ser usado como um marcador de imuno-histoquímica para avaliar a profundidade de uma ferida.

Neste protocolo, demonstramos uma técnica ao mesmo tempo, manter "stemness" de EAC enquanto diferenciar ASCs para vários tipos de células vasculares. Para o estudo da pele e do seu tecido subjacente macio, colagénio e PEG-fibrina são directamente aplicáveis. No entanto, outros materiais bioscaffold podem ser implementadas para estudar as suas habilidades únicas exploradas para induzir ASC em outros tipos celulares. A técnica implementada aqui ajuda a destacar a importância da matriz extracelular no controle de fenótipos de células-tronco e dá credibilidade à exploração de compósitos em camadas para a regeneração da pele.

Resumo

Etapas críticas

  • O colagénio deve ser ajustado para o seu pH correcto isoeléctrico (pH 6,8-7.1) para induzir a fibrilação e obter um gel estável structure.
  • PEG devem ser preparadas de fresco antes da mistura com solução de fibrinogénio a partir da vida de prateleira de PEG aquosa é curta (4-5 horas).
  • O tempo de incubação do fibrinogénio PEG-mistura não deve exceder 25 minutos (a 37 ° C), uma vez ao longo de incubação-precipitação pode causar uma turva opaca durante a gelificação.
  • Após a adição de trombina para a solução de fibrinogénio peguilado, a mistura deve ser dispensado a insere cultura imediatamente após a mistura (suave com uma pipeta). Segurando-se a mistura solução na ponta da pipeta para um tempo mais longo (> 30 seg) pode causar a gelificação no interior da ponta de pipeta e dificuldade na obtenção de géis uniformemente derramado.
  • Usando células de tamanho uniforme microesferas e uniformemente distribuída ao longo do leito CSM é crítica para o carregamento de células óptima. Variação CSM tamanho de diâmetro influencia directamente área de superfície disponível para a fixação de células por miligrama de microesferas, enquanto que uniformemente distribuída ASC-CSM influencia directamente migração celular para os tele andaimes. A célula-carregado microesferas (ASC-CSM) deve ser distribuído uniformemente na parte superior do gel de colagénio para assegurar mesmo migração de ASC dentro do andaime. Se a distribuição de ASC-MCS é muito densa, a migração celular vai ficar concentrada em uma área particular dentro dos géis e pode limitar a interação célula-célula pós-migração.
  • Assegurar que o volume de meio adicionado ao poço exterior do inserto de cultura de células é maior do que o menisco do interior bem. Tipicamente, uma interior: proporção em volume de 1:2 exterior é apropriado, como o que facilita células associadas à microesferas.

Limitações

  • Este método é limitado à área de superfície total disponível no microesferas. Se um número maior de células é desejada, microesferas mais são necessários para aumentar a área de superfície.
  • Uma vez que as células se destinam a migrar a partir de microesferas, um intervalo de tempo pode ser observado para a migração de células inicial de sobre e dentro dos géis.
  • As microesferas são na interface de dois géis (colagénio e PEG-fibrina), e isto pode limitar / demorar mais tempo para a migração de células para as extremidades distais dos géis.
  • Durante a construção da bicamada, mistura de fibrinogénio trombina-PEGuilado tem que ser adicionado rapidamente sobre um leito CSM-ASC em cima de colagénio. Isso pode causar desigual redistribuição da ASC-MCS. No caso de re-distribuição desigual de ASC-MCS na interface durante a fundição de gel de PEG-fibrina, o construto gel pode ser lentamente agitados manualmente para rapidamente redistribuir as microesferas antes de gelificação completa.
  • Este método é limitado às células que possuem propriedades migratórias e podem não ser adequados para proporcionar os tipos de células de ancoragem independentes.
  • A solução de colagénio antes fibrilação permanece em pH ácido e limita-se a mistura directa de células dentro de géis de colagénio. Como tal, se não for ajustado dentro de um prazo razoável (~ 30 min), a viabilidade das células pode ser comprometida.
  • Uma vez que o gels utilizados nesta construção são individualmente em camadas, uma possível ruptura ou a separação dos géis podem ocorrer durante o processo de manipulação. Assim, pode limitar a facilidade no manuseamento durante estudos in vivo.

Possíveis modificações

  • ASC-MCS pode ser distribuído uniformemente dentro dos géis individuais em vez de camadas-los na interface.
  • ASC pode ser diretamente misturado dentro de géis individuais ao invés de entregar pelo CSM, mas isso pode limitar o desenvolvimento de células altamente organizadas com estampas construções de tecido.
  • Para evitar a re-distribuição desigual de ASC-MCS durante PEG-fibrina fundição, o ASC-MCS pode ser suspenso num pequeno volume de solução de quitosano aquosa (1% w / v) e distribuído uniformemente sobre géis de colagénio. Isto irá assegurar fixação firme de ASC-MCS sobre a camada de gel de colagénio e irá impedir a retirada de ASC-MCS a partir da superfície de colagénio.
  • A construção, por si só pode ser utilizado de uma forma invertida, isto é, PEG-fgéis ibrin pode ser convertido em primeiro lugar e ASC-MCS pode ser semente no topo de PEG-fibrina géis seguido por géis de colagénio. Isso permite que o utilizador para converter a solução de colagénio fibrilada sobre a camada (ASC-CSM)-PEG-fibrina mais cautelosamente uma vez que, ao contrário de PEG-fibrina géis, solução de colagénio fibrilada requer tempo extra (30 minutos) para solidificar. Ao adotar este processo pode-se assegurar a manter uma distribuição uniforme de ASC-CSM.
  • Os géis de colagénio (e / ou PEG-fibrina géis) podem ser incorporados com mitogénios, tais como factores de crescimento (por exemplo, factor de crescimento endotelial vascular, os factores de crescimento de fibroblastos), de modo a induzir a migração mais rápida e proliferação celular.

Solução de problemas

  • Durante a fibrilação da solução de colagénio, se o pH excede o pH isoeléctrico de> 7,2, o pH deve ser reajustado por qualquer adição de uma solução estoque de mais de colagénio, baixando o pH usando solução de ácido fraco.
  • Ao preparar o CSM, se uma grande variação no tamanho ocurs, em seguida, um número de parâmetros podem ser ajustados para se obter o tamanho desejado CSM (viscosidade de solução stock de quitosano, o volume de agente tensioactivo, a velocidade de agitação, etc.)
  • No caso de migração celular lenta quando preencher os géis, um maior número de ASC-MCS pode ser usado para aumentar o número de células que migram para fora do MCS em géis.
  • O processo de PEG-fibrinogénio gelificação pode ser retardado por redução do volume de trombina adicionada à mistura de (tipicamente 900 uL em vez de 1 mL) ou preparação de um estoque de menor concentração de trombina (20 U / mL, em substituição de 25 U / mL) . Isso permite que mais lento gelificação de fibrinogênio PEG-mistura e, portanto, dá tempo extra para a fundição cauteloso de fibrinogênio-peguilado e mistura de trombina sobre o ASC-MCS.
  • Durante a incubação, se uma separação de fases ocorre (entre o colagénio eo gel de fibrina), um anel de estéril Teflon 'O' pode ser colocado sobre a construção de cima para assegurar a fixação das fases de gel.

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Disclosures

Não há interesses conflitantes financeiros existem.

Alerta

As opiniões ou afirmações contidas neste documento são as opiniões pessoais dos autores e não devem ser interpretadas como oficial ou refletindo as opiniões do Departamento de Defesa ou o Governo dos EUA. Os autores são funcionários do governo dos EUA, e este trabalho foi elaborado como parte das suas funções oficiais. Todo o trabalho foi apoiado pelo EUA Pesquisa Médica do Exército e do Comando de Material. Este estudo foi realizado ao abrigo de um protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Ética Médica EUA Exército e do Comando de Material Conselho de Revisão Institucional e de acordo com o protocolo aprovado.

Acknowledgments

SN foi apoiado por uma bolsa pós-doutorado da Iniciativa Engenharia de Tecidos Pittsburgh. DOZ é apoiado por uma subvenção concedida à Fundação de Genebra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

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References

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Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC
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Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

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