Инжиниринг двухслойных гидрогель для управления ASC дифференциации

Summary

Этот протокол фокусируется на использовании врожденной способности стволовых клеток брать пример с окружающих их внеклеточный матрикс и вызвать их дифференцировку в несколько фенотипов. Это методы рукопись расширяет наше описание и характеристика модели использования двухслойных гидрогель, состоящий из PEG-фибрин и коллаген, одновременно совместно дифференцировать жировой ткани стволовых клеток

Abstract

Природных полимеров на протяжении многих лет приобрели большее значение из-за их биосовместимостью хозяина и способность взаимодействовать с клетками, в пробирке и в естественных условиях. Область исследований, которая держит обещание в регенеративной медицине комбинаторной использование новых биоматериалов и стволовых клеток. Основная стратегия в области тканевой инженерии является использование трехмерных леса (например, decellularized внеклеточного матрикса, гидрогели, микро / нано частиц) для направления клеточной функции. Эта технология прошла путь от открытия, что клетки должны подложки, на которой они могут придерживаться, размножаться, и выражать свои дифференцированные клеточный фенотип и функции ^2-3. Совсем недавно было также установлено, что клетки не только использовать эти субстраты для присоединения, а также взаимодействовать и принимать сигналы с матрицы подложки (например, внеклеточный матрикс, ECM) ^4. Таким образом, клетки и леса имеют взаимные связи, чтослужит для контроля тканей развитию, организации и конечная функция. Жировая производные стволовые клетки (ИСС) являются мезенхимальные, не кроветворения стволовые клетки, присутствующие в жировой ткани, что может выставить несколько линия дифференциации и служить доступный источник клеток (т.е. предварительно сосудистой эндотелия и перицитов). Наша гипотеза состоит в том, что жировая стволовых клеток могут быть направлены на различные фенотипы одновременно просто совместного культивирования их в двухслойных матриц ^1. Наша лаборатория ориентирована на кожный заживления ран. С этой целью мы создали один составной матрицы от природных биоматериалов, фибрин, коллаген и хитозан, которые могут имитировать характеристики и функции кожного конкретных раны окружающей среды исцеления ECM.

Protocol

1. Изоляция жировой производные стволовые клетки (ИСС), ^{1, 5}

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Изолировать крысы паранефральная и придатка жировой и промыть буферной соли стерильной Хэнка решение (HBSS), содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), как описано выше ^5. Это исследование было проведено в соответствии с Законом о животных, подзаконных актов животных и в соответствии с принципами руководства по уходу и использованию лабораторных животных.
2. Фарш ткани и передавать 1-2 г на 25 мл HBSS, содержащим 1% FBS в 50 мл трубку и центрифуги в 500 г в течение 8 минут при комнатной температуре.
3. Соберите свободно плавающего слоя жировой ткани и передачи 125-мл колбу и лечение с 25 мл коллагеназы тип II (200 ЕД / мл) в HBSS в течение 45 мин при 37 ° С на орбитальном шейкере (125 оборотов в минуту). Осторожно снимите жидкой фракции (ниже масла и жировой слой) на пипетировать и фильтровать его последовательно через 100 - мкм и 70 - мкм сетчатый фильтр из нейлона. Центрифуга фильтрата на 500 г в течение 10 мин при комнатной температуре, аспирации супернатант и осадок мыть дважды 25 мл HBSS.
4. Ресуспендируют клеточный осадок в 50 мл среды роста (MesenPRO RS базальной среды) с добавлением MesenPRO RS роста дополнения, противогрибковых антибиотиков (100 ЕД / мл пенициллина G, 100 мкг / мл стрептомицина сульфата и 0,25 мкг / мл амфотерицина B), и 2 мМ L-глутамина и пипетки клетки на две колбы T75 (25 мл / колбы).
5. Культура ASC в 5% CO _{2-инкубаторе} увлажненных при температуре 37 ° C (переход 2-4 ИСС используются для всех опытов).

2. Подготовка Хитозан микросфер (ЦСМС)

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

5. Эмульсию водный раствор хитозана (6 мл 3% вес / объем хитозана в 0,5 М уксусной кислоты) в 100 мл смеси масляная фаза, состоящая из соевого масла, октаноле (1:2 об / об) и 5 % сорбитан-моноолеат (диапазон 80) эмульгатор, с использованием накладных (1700 оборотов в минуту) и магнитной мешалкой (1000 оборотов в минуту), одновременно в противоположных направлениях. Этот двойной метод смешивания гарантирует, что мицеллы образуются на ранних стадиях до сшивания происходит, может оставаться в растворе и не осели на дно. Кроме того, магнитная мешалка средств в де-объединения хитозана в мицеллообразования и rigidization.
1. Размешайте смесь непрерывно перемешивают в течение примерно 1 часа до стабильного водно-нефтяной эмульсии получается. Начать ионных сшивки с добавлением 1,5 мл 1% вес / объем гидроксида калия в октаноле каждые 15 мин в течение 4 ч (24 мл общего числа)
2. Высушите восстановленные сферы в вакуум-эксикаторе и анализа без дополнительной обработки. Вы можете определить средний размер частиц CSM, площадью в миллиграммах, а блок кубический объем с помощью анализатора размера частиц.
3. В последующих экспериментах, мыть CSM три раза стерильной водой для удаления остатков солей и стерилизовать стиральная ночь с 5 мл абсолютного этанола.

3. ОпределениеКоличество свободных аминогрупп в CSMS

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Определить количество свободных аминогрупп в настоящее время ЦСМС после ионной сшивки с помощью тринитро бензолсульфоновая (TNBS) кислоты из анализа Bubnis и Ofner ^6. Инкубировать 5 мг микросфер с 1 мл 0,5% раствора TNBS в 50 мл стеклянную трубку в течение 4 ч при 40 ° С и гидролиза с добавлением 3 мл 6N HCl при 60 ° С в течение 2 часов.
2. Охладите образцы до комнатной температуры и извлечения свободным TNBS добавлением 5 мл дистиллированной воды и 10 мл этилового эфира.
3. Теплый 5 мл аликвоты водной фазы до 40 ° С на водяной бане в течение 15 минут для испарения остаточной эфир, охладить до комнатной температуры и разбавляют 15 мл воды.
4. Измерьте оптическую плотность при 345 нм с помощью спектрофотометра использованием TNBS решение без хитозана как пустые и хитозана для CSM рвозмещение ущерба, чтобы определить общее количество аминогрупп. Оцените количество свободных аминогрупп CSM относительно хитозана.

4. Загрузка ASC в CSM

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Уравновешивать 5 мг стерилизовать CSMS из раздела 2.5 в стерильной HBSS в ночное время и добавить в 8 - мкм размер пор мембраны культуры пластины вставки (24-луночного планшета).
2. После CSMS поселились на мембране, тщательно аспирации HBSS и добавить 300 мкл питательной среды для внутренней вставкой и 700 мкл питательной среды за пределы вставки.
3. Ресуспендируйте ИСС в соответствующей концентрации (1 × 10 ⁴ до 4 × 10 ⁴⁾ в 200 мкл среднего роста и семян на МКС внутри вставки пластины культуры. Окончательный объем среды в культуре вставки, после посева, составляет 500 мкл.
4. Incubели ASC семенами на CSMS в течение 24 ч в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.

5. Определение Процент ASC Загрузка и жизнеспособность клеток в CSMS

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. После инкубации пипетки ASC-загруженным CSM в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубы, не нарушая клетки, которые мигрировали в вставкой мембраны.
2. Удаление остаточных средних и добавить 250 мкл свежей среды, рост к трубе.
3. В каждую пробирку, добавляют 25 мкл МТТ [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-ил) -2,5-diphenyltetrazolium метила] решение (5 мг / мл) и инкубировать в течение 4 ч в 5% CO ₂ увлажненный инкубаторе при температуре 37 ° C.
4. После инкубации удалить среды, добавить 250 мкл диметилсульфоксида, и вихрь смесь в течение 2-5 мин для растворения формазана комплекса.
5. Центрифуга CSM в 2700 гв течение 5 мин, пипетка с супернатант и определить его длину волны поглощения при 570 нм и 630 нм с использованием стандартных планшетов, в соответствии со спецификацией производителя МТТ.
6. Определить количество клеток связано с ЦСМС по отношению к значениям, полученным от определенных номеров ASC культивировали разработать стандартную кривую.

6. Подготовка и характеристика ASC-CSM встроенный в PEG-фибрин Гели

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Полиэтиленгликоля (PEG) фибрина (PEG-фибрин) гидрогель подготовленный Саггс и др. ^7, растворение сукцинимидил glutarate изменение полиэтиленгликоля (ПЭГ, 3400 Да). С помощью 4 мл трис-буферном растворе (TBS, рН 7.8) и фильтр стерилизовать с 0.22-мкм фильтр непосредственно перед началом эксперимента. Растворенный PEG действует только в этой заявке на первые 3-4 часа.
2. Смешать 500 иму, л акции фибриноген (40 мг / мл в TBS, рН 7,8) и 250 мкл ПЭГ акции в культуре и 6-луночный планшет и инкубировать в течение 20 минут в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C. Эта смесь является молярное отношение концентрации 1:10, SG-PEG-SG: фибриногена.
3. Возьмите 250 мкл ASC-CSM в концентрации 5 мг CSM (≈ 2 × 10 ⁴ клеток) и смешать с пегилированный решение фибриногена.
4. Сразу добавляют 1 мл тромбина акций (25U/mL) и быстро растереть один или два раза с помощью пипетки. После смешивания тромбина с PEG-фибриногена, немедленно разместить клетки-гель смеси в 12-луночного планшета и инкубировали в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 10 мин, чтобы обеспечить полную гелеобразования. Так как время гелеобразования быстро, не пытайтесь удерживать гель решение в пипетки более чем на 5 секунд. Пегилированный фибриноген расщепляется тромбином и образует гидрогель пегилированный фибрина. Таким образом, яэлектронной конечный продукт гель называется PEG-фибрина.
5. Вымойте PEG-фибрин гели дважды HBSS и инкубировать с альфа минимальный необходимый носитель (α-MEM) с добавлением 10% FBS в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
6. Обратите внимание на миграцию клеток из CSM в гель в течение 11-дневного периода с использованием стандартных методов световой микроскопии.

7. Подготовка и характеристика ASC-CSM встроенный в коллагеновых гелях

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Mix ASC-CSM (5 мг содержащих ≈ 2 × 10 ⁴ клеток) с коллагена 1 типа (7,5 мг / мл), выделенных из сухожилий хвоста крысы в соответствии с методом Борнштейн ⁸ и фибриллировать после корректировки рН до 6,8 использовании 2N NaOH.
2. Добавить фибриллированная коллагена ASC-CSM смесь на 12-луночного планшета и инкубировать в течение 30 мин в 5% CO ₂ humidiFied инкубаторе при температуре 37 ° C.
3. После полного аритмия, инкубировать коллагена ASC-CSM гели до 11 дней в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
4. Обратите внимание на миграцию клеток из CSM в гель в течение 11-дневного периода с использованием стандартных методов микроскопии.

8. Развитие двухслойных PEG-фибрин-(ASC-CSM) Коллаген гель Конструкции

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Для разработки двухслойных построить, подготовить как коллаген и фибрин PEG-гели как описано выше, с небольшими изменениями. Короче говоря, для изучения миграционных и сотрудничества индукции свойства одного источника стволовых клеток с помощью двух bioscaffolds, "сэндвич" ASC-CSMS между коллагена и PEG-фибрин леса с помощью четырех шагов: 1) Нагрузка ASC на CSM, 2) бросить фибриллированная гель слой коллагена и ASC-CSM бисером на колЛаген гель, 3) литье PEG-фибринового геля на ASC-CSM-коллагеновый гель и позволяют закрепить гелем, и 4) добавить средне хорошо и вставить изучать клетки в пробирке или удалить из вставки в естественных приложений (см. Рисунок 1 ).
2. Подготовить 1 мл коллагена типа 1 (7,5 мг / мл) смеси, как описано выше в п. 7.1, не добавляя ASC-CSM в смесь. Поместите смесь в 6-и культуре тканей вставки (8 мкм, размер пор) и инкубировать в течение 30 мин в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
3. После полного аритмия, слой над поверхностью коллагена 5 мг ASC-CSM (10 000 клеток / мг), взвешенных в культуре средств массовой информации (200 мкл). После того, микросферы осели в гель, подготовить PEG-фибринового геля, как описано в разделе 6.0, без добавления ASC-CSM в смеси, а слой пегилированный фибриногена / тромбина решение по ASC-CSM-коллагеновые слои. При подготовке PEG-фибринового геля, использовать 250 мкл клеточной среде культуры вместо тон 250 мл среды, содержащей клетки.
4. После завершения инкубации конструкций в течение 30 мин в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе для достижения полной геля перед подачей конструкция с питательной среде.
5. После завершения гелеобразования, место 1 мл среды в верхней палате по конструкции и 3 мл среды в нижней палате.

9. Создание растворы

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

• Кальций хлористый акции (40 мм): Используйте только CaCl ₂ · 2H ₂ O. Растворите 588,4 мг CaCl ₂ · 2H ₂ O с 100 мл дистиллированной воды. Стерилизовать использованием 0.22-мкм.
• Полиэтиленгликоль: PEG очень реагируют с кислородом и может стать окисленных при контакте с воздухом. Таким образом, PEG должны храниться в атмосфере азота (N ₂₎ атмосферы. Точностьurately весом 32 мг в 2-мл центрифужные пробирки (не забудьте очистить трубы № ₂ перед использованием) и хранить при температуре -80 ° C до готовности к использованию. Растворите 32 мг ПЭГ в 4 мл TBS раствор перед использованием.
  Следующие решения должны быть свежими перед каждым экспериментом.
  
• TBS решение: (рН 7.75-7.77 при 25 ° С, рН при 25 ° С имеет очень важное значение). Для подготовки 15 мл раствора TBS, тщательно растворите одну таблетку в буфер фильтр стерилизовать деионизированной воды и приспособиться к необходимой рН. Не храните маточного раствора, готовить свежую каждый раз.
• Фибриноген решение: (40 мг / мл). Растворите порошок в фибриногена TBS, чтобы концентрации фибриногена в дозе 40 мг / мл. Растворите в одночасье с использованием магнитной мешалки при температуре 4 ° C. Это проще распустить весь 1-г величина с необходимым количеством TBS. На следующий день, удалить фибриногена от 4 ° C (как правило, облачно) и дайте емунагреть на водяной бане до однородной раствор. Наконец, фильтр стерилизуют фибриногена использованием 0,45 мкм.
• Тромбин решение (25 ед / мл): Для того, чтобы решение тромбина, взвесить необходимое количество и растворяются с подготовленной 40 мМ CaCl ₂ · 2H ₂ O. Это всегда хорошая практика, чтобы использовать весь флакон тромбина, чтобы сделать запас. Пример: Растворите бутылку из 5-ку тромбина с 200 мМ CaCl ₂ · 2H ₂ O, аликвоты и хранят при температуре -20 ° C.

10. Представитель Результаты

Общая цель техники, представленные здесь, чтобы продемонстрировать возможности одновременного матрицы управляемой дифференциации АСК на несколько фенотипов использованием CSM, как средство доставки. Мы демонстрируем в пробирке стратегии доставить стволовые клетки из CSMS в двухслойных коллаген ПЭГ-фибрин эшафот. Характеристика ASC встроенный в эту леса revealeг, что ASC-загруженным CSMS может быть "зажата" между слой коллагена и PEG-фибрин одновременно и дифференцированно взять пример с внеклеточной среде и процветать под новые условия. Сначала характеризуется возможностью для модельной системы для поддержания жизнеспособности клеток и миграционных возможностей. Коллаген поддерживает возможность ИСС для поддержания их "stemness", как было продемонстрировано их выражение Стро-1 и их фибробластоподобных морфологии (рис. 2D и 2F). В отличие от PEG-фибрин индуцированные ИСС дифференцировать к сосудистой фенотип, о чем свидетельствует их ламповую структуру морфологии, их эндотелиальных клеток-конкретное выражение фактор фон Виллебранда (2E Рисунок и 2G) и перицитов конкретным выражением NG2 и тромбоцитарный рецептор фактора роста бета (PDGFRβ) (данные не представлены). Кроме того, эти наблюдаемых фенотипов появился происходят рано в культуре и сохранялись в течение 11 дней, как это демровал на рисунке 3.

Таблицы и рисунки

Преимущества двухслойной конструкции:

• Леса в одиночку, без клетки могут выступать в качестве биологически активных эшафот.
• PEG-фибрина может вызвать стволовых клеток дифференцироваться без добавления ростовых факторов.
• Коллаген может помочь в поддержании фенотипа стволовых клеток ИСС.
• Двухслойная конструкция может быть использована в качестве активного субстрата для других типов клеток мигрировать и размножаться (например, эндотелиальные клетки, фибробласты, кератиноциты, клетки гладкой мускулатуры, перицитов).
• Он может быть использован с жесткой тканевой инженерии леса как hydroxyaptite или деминерализованной кости для восстановления мягких и твердых тканей.
• Она может быть использована для создания многослойной, разнообразной тканевой инженерии конструкции (например, кожно-сосудистых, сосудисто-эпителиальные, кожно-сосудисто-гиподермальные и т.д.).
• Он использует одноклеточные источник одновременно развиватьмногоклеточных отсеков.
• У него есть потенциал для интеграции с тканями организма, поскольку он имеет естественное происхождение.
• CSM в гель конструкция обеспечивает платформу для клетки мигрируют из.
• Хитозан, используемых для подготовки CSM, это известные активные химио-приманки.
• Общая концепция применяется в этом протоколе «матрицы управляемой дифференциации стволовых клеток", может быть применена к другим типам стволовых клеток. Тем не менее, дальнейшее расследование является оправданным для определения целесообразности матрицы управляемой дифференциации. Двухслойных гель леса могут выступать в качестве резервуара для доставки клеток в устойчивых и контролируемым образом.
• После реконструкции, гели все еще может быть разделена на отдельные компоненты.

Рисунок 1. Схема изображающая общую цель и процесс техники. 1) Жировая производные стволовые клетки (ИСС) являются лоaded на хитозана микросферы. 2) Коллаген затем выливают в 6-и вставки, рН доводили до фибриллировать коллагена и вставки помещается в 6-луночный планшет камеры. ASC-загруженным сферах CSM затем накладываются коллагена. 3) пегилированный фибриногена затем облили коллагена (ASC-CSM) и гель при добавлении тромбина. 4) конечная конструкция бислоя могут быть удалены из культуры вставки и использоваться в пробирке или в естественных условиях анализа.

Рисунок 2. Характеристика ASC культивировали в течение коллагена и PEG-фибрин 3D-матрицы. А) фазового контраста Микрофотография изолированной ASC пассировать и поддерживается с помощью обычных 2-мерные методы клеточной культуре. Микрофотографии B, D, F и изображать ASC-CSM культивировали в течение 3-х мерного коллагеновый гель, в то время как C, E, G и шоу ASC-CSM культивировали в течение 3-х мерного PEG-фибринового геля, как на 1-й день2. В B и C), ИСС показаны мигрируют от CSM сферы в обоих типах леса. ИСС, как представляется, плоский, как веретено морфологии коллагена (B), при сохранении их экспрессии маркера стволовых клеток Стро-1 (D, стрелка). При культивировании в PEG-фибрин ИСС обладают более ламповую структур и вынуждены выражать такие сосудистые маркеры ячейки как фактор фон Виллебранда (E). Просвечивающей электронной микроскопии показана типичная морфология свидетельствует ИСС в каждой эшафот. ИСС в коллагеновый гель, кажется, есть меньше филоподии (П) простирается от тела клетки (F), в то время как ИСС обычно формируется lumenal (обозначение L) структур (G; стрелкой).

Рисунок 3. Морфологический анализ ASC-CSMS между бислоев коллагена и фибрина PEG-гели. ASC-ЦСМС были «зажаты» между коллагена и PEG-фибрин гели и поддерживаться в культуре в течение 11 дней. Левая coluмлн. изображает ИСС миграции и пролиферации в коллагеновой матрице и, кажется, взять на шпиндель, как морфология. В правой колонке показаны ИСС миграции от CSMS и формирования ламповую структур в PEG-фибринового геля.

Discussion

ИСС хорошо известны за их простоту изоляции и способность различать на различные типы клеток. С методами, описанными в этой рукописи, мы можем использовать пластичность ИСС, подвергая эти клетки на несколько biomatrices одновременно. Как клетки мигрируют от их CSM базу и ввести окружающих их внеклеточной среде, клетки взять пример с эшафота и может либо поддерживать "stemness" (коллаген) или вызвать их дифференцировку в сторону сосудистых и сосудисто-поддержку типов клеток (фибрин). С нашей лаборатории заинтересован в кожу и мягкие ткани, заживление ран, мы стратегически реализована двухслойная коллагена и фибрина, так как коллаген поддерживает эпидермис кожи и регенерации хозяина, в то время как фибрин естественным образом индуцирует образование сосудистой сети ^9. Кроме того, он теперь понял, что перекрестные помехи происходит между распространением кожи кератиноциты, фибробласты, а в основе сосудистой сети, и этот комплексМеханизм очень важно для надлежащего заживления ран ^10. Без основной сосудистой сети, тканевой инженерии трансплантаты кожи испытывают трудности с срастание тканей хозяина. Таким образом, наша общая гипотеза состоит в том, что коллагена и фибрина, при использовании в качестве бислоя в сочетании с ИСС, уменьшится раза заживления ран за счет улучшения один или несколько этапов кровеносных сосудов, кожных и реэпителизации процессов.

Фибрин является универсальным биополимер, образовавшихся после тромбин-опосредованную расщепления фибринопептида полученных из мономерных фибриногена. Фибрин был использован клинически как кровоостанавливающее средство (утвержден по контролю за продуктами и лекарствами США), а также в качестве герметика в различных клинических применений, в том числе процедуры, такие как мягкие ткани вскрытия. Фибрин гидрогелей из коммерчески очищенный аллогенной фибриногена и тромбина, нашли широкое применение в последнее десятилетие в различных тканях-технических приложениях. Тем не менее, некоторые крупные недостатки, яN Использование гидрогеля фибрина может быть: 1) потенциал для леса сокращаться, 2) низкая механическая жесткость, и 3) быстрая деградация до надлежащего формирования тканевой инженерии структур. Для преодоления этих проблем, фибрина должен быть изменен перед использованием в качестве лучшей трехмерной ткани инженерно-строительные леса. Один из таких подходов сополимеризацией фибрина с полиэтиленгликоля (ПЭГ-фибрин). Наша предварительная работа продемонстрировала ряд уникальных особенностей PEG-фибрина, которые делают его полезным в заживлении ран по сравнению с другими повязки гидрогель, в том числе немодифицированных фибрина. Пегилированный-фибрина обладает уникальными особенностями и синтетических гидрогелей и натуральных материалов. В частности, в присутствии ПЭГ обеспечивает высокую гидратированных (> 90% воды), влажная среда для управления вытяжки. Во-вторых, наличие фибрина придает биологическому разложению на материал, однако, прежде чем результаты показывают, что пегилированный фибрина значительно более стабилен, чем в пробирке unPEGylated фибрина

Вторая составляющая нашего бислоя является коллаген. Коллаген является естественным биоматериала повсеместно выражается в млекопитающих и служит прямым места крепления для различных типов клеток. Различные ткани выражают различные типы коллагена (тип 1-type29), в зависимости от вида функциональной необходимости ткани. Другие неотъемлемые свойства коллагена, которые делают его очень привлекательным в нашей модели в том, что 1) он не является противовоспалительным, 2) как целого и деградации компонентов коллагена биосовместимых, 3) это очень пористой гидрогеля, 4) поддерживает клеточной инфильтрации и миграции, 5) утверждает multipotency стволовых клеток, 6), настраиваемый путем модуляции разработки, и 7) легко inosculates с тканями организма. Для нашего исследования в регенерации кожи и мягких тканей, двухслойных композит, состоящий из коллагена является естественным выбором, так какнастоятельно выразили всей кожи, в том числе глубокие кожные регионов, и может быть использован в качестве маркера для иммуногистохимии оценить глубину раны.

В этом протоколе, мы показываем технику одновременно поддерживать "stemness" ИСС при дифференциации ИСС к различным сосудистым типов клеток. Для изучения кожи и лежащих в его основе мягкой ткани, коллаген и PEG-фибрин имеют прямое действие. Тем не менее, другие материалы bioscaffold могут быть реализованы, чтобы изучить их изучить уникальные способности вызывать ASC в другие типы клеток. Методика реализована здесь помогает подчеркнуть важность внеклеточного матрикса в управлении фенотипа стволовых клеток и придает достоверность исследования слоистых композитов для регенерации кожи.

Резюме

Критические Шаги

• Коллаген должны быть приспособлены для его правильного изоэлектрической рН (pH6.8-7.1), чтобы вызвать аритмии и получить стабильный ул гельucture.
• PEG должны быть подготовлены только что перед смешиванием с фибриногена решение, так как срок хранения водных PEG короткий (4-5 часов).
• Время инкубации фибриногена-PEG смеси не должно превышать 25 минут (при 37 ° С), так как в течение инкубации может привести к мутным непрозрачным осадков во время гелеобразования.
• После добавления тромбина к пегилированный решение фибриногена, смесь должна подаваться к культуре вставки сразу (после нежного смешивания с пипеткой). Проведение решение смеси в пипетки в течение длительного времени (> 30 сек) может привести к гелеобразованию в кончике пипетки и трудности в получении равномерно заливается гели.
• Использование равномерно размеров микросфер и равномерно распределяется по клеткам CSM кровать имеет решающее значение для оптимальной загрузки клетки. CSM размер изменения диаметра напрямую влияет на площадь поверхности для мобильных вложений на миллиграмм микросфер, а равномерно распределяется ASC-CSM напрямую влияет на миграцию клеток в тОн лесов. Клеточных загруженных микросфер (ASC-CSM) должны быть распределены равномерно на вершине коллагеновый гель, чтобы гарантировать даже миграция в ИСС на эшафот. Если распределение ASC-CSMS слишком плотная, миграции клеток получите сосредоточены на определенной территории в течение гелей и может ограничить межклеточных взаимодействий после миграции.
• Убедитесь, что объем средств массовой информации добавляются внешние и вкладыша культуре клеток выше, чем мениска внутренней хорошо. Как правило, внутренний: внешний том соотношении 1:2 подходит, так как это способствует клеткам прикрепляться к микросферы.

Недостатки

• Этот метод ограничен общей площадью доступны на микросферы. Если более высокий номер ячейки требуется более микросферы, необходимых для увеличения площади поверхности.
• Поскольку клетки предназначены для перехода от микросферы, запаздывание может наблюдаться на начальном миграции на клетку и в гелях.
• Микросферы в интерфейсе двух гелей (коллагена и PEG-фибрина), и это может ограничить / занять больше времени для миграции клеток дистальных концов гели.
• Во время строительства бислоя, пегилированный фибриногена, тромбина, смесь должна быть добавлена ​​быстро на CSM-АСК постель в верхней части коллагена. Это может привести к неравномерному перераспределению ASC-ЦСМС. В случае неравномерного перераспределения ASC-CSMS на границе во время PEG-фибринового геля литье, гель конструкция может быть медленно вручную перемешивать, чтобы быстро распространять микросфер до полного гелеобразования.
• Этот метод ограничен в клетках, которые имеют миграционные свойства и может не подходить для доставки крепления независимых типов клеток.
• Коллагена решение до фибрилляции остается в кислой и ограничивает прямое смесь клеток в коллаген гели. Таким образом, если не решен в разумные сроки (~ 30 мин), жизнеспособность клеток может быть нарушена.
• Так как гELS, используемые в этой конструкции индивидуально слоями, возможно разрушение или разделения гели могут возникнуть во время процесса обработки. Таким образом, он может ограничить легкость в обращении во время исследования в естественных условиях.

Возможные изменения

• ASC-ЦСМС могут быть распределены равномерно в отдельных гели вместо наложения их на границе.
• ИСС может быть непосредственно смешанных в отдельные гели, а не путем предоставления CSM, но это может ограничить развитие высокоорганизованной клеточной узорной конструкции ткани.
• Чтобы избежать неравномерного перераспределения ASC-CSMS в PEG-фибрин литье, ASC-CSMS может быть приостановлено в небольшом объеме водный раствор хитозана (1% вес / объем) и распределяются равномерно по коллагеновых гелях. Это позволит фирме крепления ASC-ЦСМС по слою геля коллагена и предотвращает смещение в ASC-CSMS из коллагена поверхности.
• Конструкция сама по себе может быть использован в перевернутом образом, то есть, ПЭГ-еibrin гели могут подаваться первым и ASC-ЦСМС могут быть семена сверху PEG-гели фибрина затем коллагеновых гелях. Это позволяет пользователю подавать фибриллированная решение коллаген по слою (ASC-CSM) PEG-фибрин более осторожно, поскольку, в отличие от PEG-фибрин гели, фибриллированная решение коллаген требует дополнительного времени (30 минут), чтобы затвердеть. Приняв этот процесс можно обеспечить, чтобы поддерживать равномерное распределение ASC-CSM.
• Гели (коллагена и / или ПЭГ-фибрин гели) могут быть объединены с митогены, как факторы роста (например, фактор роста эндотелия сосудов, факторы роста фибробластов), таким образом, чтобы побудить быстрее миграции клеток и пролиферации.

Поиск и устранение неисправностей

• Во время фибрилляции коллагена решение, если рН превышает изоэлектрической рН> 7,2, рН должен быть скорректированы путем добавления еще решение коллаген акции, снижая рН с помощью слабого раствора кислоты.
• При подготовке CSM, если большое изменение размера заниRS, то количество параметров можно настроить для получения желаемого размера CSM (вязкости раствора хитозана акций, объем ПАВ, скорости перемешивания и т.д.).
• В случае медленной миграции клеток при заполнении гели, большее количество ASC-ЦСМС могут быть использованы для увеличения числа клеток мигрируют из CSM в гелях.
• Процесс PEG-фибриногена геля может быть задержано за счет сокращения объема тромбина добавляют в смесь (как правило, 900 мкл, а 1 мл) или подготовка более низкой концентрацией запасов тромбина (20 ед / мл в место 25 Ед / мл) . Это позволяет медленнее геля ПЭГ-фибриногена смеси и, следовательно, дает дополнительное время для осторожного литья пегилированного-фибриноген и тромбин смесь по ASC-ЦСМС.
• Во время инкубации, если происходит разделение фаз (между коллагена и фибрина, гель), кольцо стерильный 'O' тефлон может быть помещена на верхнюю конструкцию для обеспечения крепления гель фаз.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO, by Life Technologies	14175	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Consumable
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6685	Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Consumable
MesenPRO Growth Medium System	Invitrogen	12746-012	Consumable
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030	Consumable
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C8106	Consumable
T75 Tissue Culture Flask	BD Biosciences	137787	Consumable
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consumable
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Consumable
N-Octanol	Acros Organics	150630025	Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate	Sigma-Aldrich	S6760	Consumable
Potassium Hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767	Consumable
Acetone	Fisher Scientific	L-4859	Consumable
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741	Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid	Sigma-Aldrich	P2297	Consumable
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	320331	Consumable
Ethyl Ether	Sigma-Aldrich	472-484	Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts	BD Biosciences	353097	Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Consumable
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655)	Molecular Probes, Life Technologies	Q2502PMP	Consumable
Type 1 Collagen	Travigen	3447-020-01	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Consumable
12-Well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	Consumable
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F3879	Consumable
Thrombin	Sigma-Aldrich	T6884	Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene	Sunbio	DE-034GS	Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6)	Sigma-Aldrich	T5030	Consumable
Centrifuge	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Model 370	Equipment
Overhead Stirrer	IKA	Visc6000	Equipment
Magnetic Stirrer	Corning	PC-210	Equipment
Vacuum Desiccator	-	-	Equipment
Particle Size Analyzer	Malvern Instruments	STP2000 Spraytec	Equipment
Water Bath	Fisher Scientific	Isotemp210	Equipment
Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer	Equipment
Vortex	Diagger	3030a	Equipment
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Equipment
Light/Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	IX71	Equipment
Confocal Microscope	Olympus Corporation	FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope	Equipment
Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Leo 435 VP	Equipment
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEOL 1230	Equipment