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Bioengineering

工程双层凝胶控制升序分化

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

该协议着重于利用干细胞的固有能力,其周围的细胞外基质的线索,被诱导分化成多个表型。这种方法手稿延伸我们描述一个利用双层水凝胶的模型,PEG-纤维蛋白和胶原蛋白的组成和特性,同时脂肪干细胞分化

Abstract

多年来的天然聚合物获得了更多,因为它们的宿主的生物相容性和交互能力与细胞在体外体内的重要性,认为在再生医学中的承诺的一个研究领域,是新型生物材料和干细胞的组合使用。在组织工程领域的一个基本战略是指导细胞的功能,使用三维支架(如脱细胞外基质,水凝胶,微/纳米颗粒)。这项技术已经从发现,细胞需要一个基板后,他们能够坚持,增殖,并表达他们分化 ​​的细胞表型和功能2-3。最近,它也已被确定,细胞不仅使用这些基板的坚持,但也互动,并采取从矩阵基板(例如,细胞外基质,细胞外基质的线索。因此,细胞和支架有一个相互连接,为控制组织发展,组织,和最终功能。脂肪干细胞(ASCs)是间质,非造血干细胞存在于脂肪组织,可以表现出多谱系分化的细胞现成的源(即前血管内皮细胞和周细胞)作为。我们的假设是,脂肪干细胞可以向简单的合作,培养他们的不同表型,同时在双层矩阵1。我们的实验室专注于皮肤伤口愈合。为此,我们建立了从天然生物材料的复合材料基体,纤维蛋白,胶原蛋白,壳聚糖,可以模仿特定皮肤伤口愈合的ECM环境的特点和功能。

Protocol

1。分离脂肪干细胞(ASCs)1,5

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  1. 分离大鼠肾周和附睾脂肪用无菌汉克的缓冲盐溶液,含1%胎牛血清(FBS),(5先前所描述的HBSS中)。这项研究已进行符合动物福利法“,实施动物福利条例,并按照实验动物护理和使用指南”的原则。
  2. 百果组织和转移到1-2克25毫升含有500克50毫升管和离心机在室温为8分钟到1%胎牛血清的HBSS。
  3. 收集的自由浮动的脂肪层转移到125毫升三角瓶和治疗胶原酶II型(200单位/毫升)25毫升37°轨道摇床(125转)在45分钟的HBSSÇ。 仔细由pipeting删除的液体部分(油和脂肪层以下)和过滤器,它通过一个100顺序 - 微米和70 - 微米尼龙网过滤器。在500克,在常温下为10分钟,离心滤液,吸上清,用25毫升的HBSS沉淀两次。
  4. 悬浮细胞沉淀在50毫升的培养基中补充MesenPRO RS生长补充,抗生素,抗霉菌(100 U / ml的青霉素G,100微克/毫升的硫酸链霉素,两性霉素0.25微克/毫升(MesenPRO RS基础培养基) B)和2毫米的L-谷氨酰胺和移液器细胞分为两个的T75瓶(25毫升/瓶)。
  5. 文化在5%CO 2培养箱孵化ASC在37°C间(通过2-4 ASCs的所有实验中使用的)。

2。制备壳聚糖微球(CSMS)

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

    5。乳化油相混合组成的大豆油,正辛醇(1:2 V / V)和5在100毫升的壳聚糖水溶液(6毫升3%W / V壳聚糖醋酸在0.5中号) %山梨醇单油酸酯(跨度80)乳化剂,同时使用方向相反的开销(1700 RPM)和磁力搅拌(1000转)。这种混合确保年初之前,在交联形成的胶束可以留在溶液中,并没有解决的底部双方法。此外,磁力搅拌棒的艾滋病在聚合过程中胶束的形成和刚化壳聚糖。
  1. 连续搅拌混合搅拌约1小时,直到获得一个稳定的中水乳化油。启动离子交联除了为4小时(共24毫升)1.5毫升1%W / V正辛醇,每15分钟的氢氧化钾
  2. 在真空干燥器的干燥回收领域,没有进一步的处理和分析。你可以决定CSM的平均颗粒大小,每毫克的表面积,使用粒度分析仪和单位立方体体积。
  3. 对于随后的实验中,用无菌水冲洗CSM的三倍,以除去残留的盐和隔夜5毫升无水乙醇洗涤消毒。

3。确定在CSMS游离氨基酸组数

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  1. 确定后离子交叉连接使用硝基苯磺酸(三硝基苯磺酸)酸法的Bubnis和Ofner 6 CSMS目前的氨基酸组的数量。用1 mL 0.5%三硝基苯磺酸溶液50毫升的玻璃试管中4小时在40°C孵育5毫克的微球和水解与另外3毫升6N盐酸在60°2小时。
  2. 样品冷却至室温,加入5毫升的去离子水和10毫升乙醚提取自由硝基苯磺酸。
  3. 温暖的水相的5 mL等分40°C的水浴蒸发冷却至室温,任何残余的乙醚,15分钟和15毫升水稀释。
  4. 与壳聚糖不使用三硝基苯磺酸溶液分光光度计测量吸光度作为空白和壳聚糖为CSM带够,在345 nm处确定氨基酸组总数的赔偿。估计CSM的相对壳聚糖的游离氨基酸组的数量。

4。在CSM加载升序

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  1. 平衡消毒CSMS在一夜之间无菌的HBSS 2.5节从5毫克,并添加到一个8 - 微米孔径的膜培养板插入(24孔板)。
  2. CSMS已落户到膜后,小心吸的HBSS,并添加300μL培养基中的生长介质的插入和700微升内插入外。
  3. 重悬的ASCs在适当的浓度(1×10 4 4×10 4)200μL生长介质和种子在培养板内插入的CSM。 ,播种后,内插入的文化语言的最终体积为500μL。
  4. incub吃了24小时的ASC上CSMS种子在5%CO 2培养箱孵化器在37°C。

5。 ASC的装载和细胞活力的百分比确定在CSMS

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  1. 经过孵化,在无菌的1.5 ml离心管吸管ASC加载,而不会干扰细胞已迁移到插入膜的CSM。
  2. 去除残留的培养基,并添加250μL新鲜生长培养基管。
  3. 每管中,加入25μLMTT法[3 - (4,5 - dimethylthiozole -2 -基)-2,5 -二苯基溴化铵溶液(5毫克/毫升)和5%CO 2培养箱中孵育4小时孵化器在37°C。
  4. 孵化后,取出介质,添加250μL二甲基亚砜,涡2-5分钟,以溶解甲臜的复杂混合物。
  5. CSM的离心2700Ğ5分钟,关闭上清吸管,并确定使用标准酶标仪在570 nm和630 nm的波长的吸光度,根据MTT法制造商的规格。
  6. 确定细胞数量与培养制定一个标准曲线从定义升序号码所得的值相对CSMS。

6。嵌入式PEG - 纤维蛋白凝胶的ASC-CSM的制备和表征

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  1. 萨格斯制备了聚乙二醇(PEG)纤维蛋白凝胶(PEG-纤维素)溶解的琥珀戊二酸改性聚乙二醇PEG(3400大)7。使用4毫升Tris缓冲生理盐水公司(TBS,pH值7.8)和过滤消毒与刚刚在实验开始前的0.22微米的过滤器。溶解PEG是只有在此应用程序的第3-4小时有效。
  2. 混合500万亩;纤维蛋白原股票升(40毫克/毫升在TBS,pH值7.8)和250μlPEG的股票在6孔板,孵育20分钟,在5%CO 2培养箱孵化文化在37°C。这种混合物构成的摩尔浓度比是1:10,SG-PEG-SG的:纤维蛋白原。
  3. 采取的ASC-CSM 250μL,浓度5毫克的CSM(≈2×10 4细胞)和聚乙二醇化纤维蛋白原的解决方案组合。
  4. 立即加入1毫升的,凝血酶股票(25U/mL)和快速磨碎移液器一次或两次。与PEG-纤维蛋白原,凝血酶混合后,立即将在12孔板细胞凝胶的混合物,在37°C在5%CO 2培养箱培养箱孵育10分钟,以便为完整的凝胶。由于凝胶时间快,不尝试按住超过5秒内枪头凝胶溶液。聚乙二醇化纤维蛋白原,凝血酶切割,形成了聚乙二醇的纤维蛋白凝胶。由于这样,THé最终凝胶产品被称为PEG-纤维。
  5. 洗两次PEG-纤维蛋白凝胶的HBSS和孵化最小的重要媒体阿尔法(α-MEM)的补充5%CO 2培养箱孵化器在37与10%FBS°C。
  6. 观察从CSM的细胞迁移到凝胶超过11天,期间使用标准光学显微镜技术。

7。胶原凝胶中的嵌入式的ASC-CSM的制备和表征

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  1. 组合的ASC-CSM(含5毫克≈2×10 4细胞),与1型胶原根据8伯恩斯坦和fibrillate后调节pH至6.8使用2N氢氧化钠的方法,从鼠尾肌腱中提取(7.5毫克/毫升)。
  2. 纤胶原蛋白ASC-CSM的混合物加入到12孔板,孵育30分钟,在5%的CO 2 humidi田间孵化器在37°C
  3. 完成后房颤,在5%CO 2培养箱孵化至11天孵化,在37°C胶原蛋白ASC-CSM的凝胶
  4. 观察从CSM的细胞迁移到凝胶超过11天,期间使用标准的显微镜技术。

8。双层聚乙二醇,纤维蛋白(ASC-CSM)的胶原蛋白凝胶构造的发展

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  1. 开发的双层构造,准备的胶原蛋白和聚乙二醇纤维蛋白凝胶如上所述,稍作修改。简单地说,研究一个单一来源的干细胞,使用两个bioscaffolds候鸟和共同诱导的性质,“三明治”的ASC-CSMS之间的胶原蛋白和聚乙二醇纤维支架使用的四步过程:1)负载升序到CSM的,2)投在山坳纤胶原凝胶层的ASC-CSM珠演员拉根凝胶,3)PEG-纤维素凝胶以上的ASC-CSM-Ⅰ型胶原凝胶和凝胶固化,4)增加中等和插入来研究细胞在体外或删除从插入体内应用( 见图1 )。
  2. 准备1胶原蛋白的混合物,如上所述,无需添加的ASC-CSM的混合物,在7.1(7.5毫克/毫升)1毫升的类型。将在6孔组织培养插入(8微米孔径)的混合物,并在37°C 30分钟在5%CO 2培养箱孵化器的孵化
  3. 经过完整的颤动,多一层表面的胶原蛋白5毫克的ASC-CSM(10,000细胞/毫克)文化传媒(200μL)暂停。已落户在凝胶微球后,准备如6.0节所述的聚乙二醇纤维蛋白胶,无添加的ASC-CSM的混合物,并层以上的ASC-CSM胶原层的聚乙二醇化纤维蛋白原/凝血酶溶液。当准备PEG - 纤维蛋白胶,使用地方的T细胞培养液中加入250μl他250μL含有细胞的媒介。
  4. 一旦完成,5%CO 2培养箱培养箱中培养30分钟的结构,实现喂奶前用培养基构造完整的凝胶。
  5. 完成后的凝胶,地点1毫升的中型以上的下腔的构造和3毫升培养基上腔。

9。使库存解决方案

注:所有的程序,在室温下进行,除非另有说明。

  • 氯化钙股票(40毫米):使用氯化钙2 .2 H 2 O 100毫升去离子水溶解588.4毫克氯化钙2·2H 2 O。消毒用0.22微米的过滤器。
  • 聚乙二醇 PEG是高度与氧气反应,并可以成为室内空气接触氧化。因此,PEG应存放在氮气(N2)气氛 ​​。命中率urately权衡,直到准备使用32毫克2毫升离心管(与N 2,使用前务必清除管)和存储于-80°C间。溶于4毫升TBS的解决方案之前,使用32毫克的聚乙二醇。
    以下解决方案必须每次实验前新鲜。
  • TBS的解决方案:(7.75-7.77 pH值在25°C,pH值在25°C是非常重要的)。要准备的TBS溶液15毫升,仔细溶解过滤灭菌去离子水的缓冲片,并调整到所需的pH值。不存储解决方案,准备新鲜每次股票。
  • 纤维蛋白原的解决方案:(40毫克/毫升)。在TBS溶解纤维蛋白原粉使纤维蛋白原浓度40毫克/毫升。一夜之间解散它使用磁力搅拌器在4°C。这是比较容易溶解所需金额的TBS整个1-G数量。翌日,从4℃(通常是阴天)纤维蛋白原,并允许它地暖水浴,直到得到一个同质的解决方案。最后,过滤消毒使用0.45微米的过滤器的纤维蛋白原。
  • 凝血酶溶液(25单位/毫升):为了使凝血酶溶液,称出所需的金额和化解的准备40毫米氯化钙2 .2 H 2 O它总是一个很好的做法,使用凝血酶整个小瓶,使股票。例如:200毫米氯化钙2·2H 2 O,分装和储存在-20°C溶解一瓶5 KU凝血酶

10。代表结果

这里介绍的是该技术的总体目标,证明将作为运载工具使用多个表型的CSM矩阵驱动的同时ASC的分化潜力。我们证明在体外战略提供CSMS干细胞成双层的聚乙二醇胶原纤维支架。嵌入式这个脚手架reveale内ASC的表征ð同时ASC装CSMS“夹心阶层”之间的胶原蛋白和PEG-纤维层和差异来自外环境的提示下茁壮成长的新情况。首先,我们的特点模型系统的能力,以维持细胞活力和迁徙能力。胶原蛋白的ASCs的支持能力,以维持他们的“干”,被证明STRO-1的表达和成纤维样形态( 图2D和2F)。相比之下,PEG-纤维蛋白诱导的ASCs分化对血管型,为的是证明他们的筒状结构形态,其内皮细胞特异性表达von Willebrand因子( 图2E,2G),和周细胞特异性表达NG2的和血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)(数据未显示)。此外,这些观察到的表型出现初发生在文化和维持超过11天,是DEM图3 onstrated在。

表格和图表

双层福利建设:

  • 无细胞支架单独作为一种生物活性支架可以执行。
  • PEG-纤维蛋白可诱导干细胞分化生长因子除了没有。
  • 胶原蛋白能协助维持干细胞表型的ASCs的。
  • 一个双层结构可以用来作为其他类型的细胞迁移和增殖(如内皮细胞,成纤维细胞,角质细胞,平滑肌细胞,周细胞)的活性基底。
  • 它可以用来与羟基磷灰石或脱钙骨等硬组织工程支架的硬软组织再生。
  • 它可以用来发展一个多层次,多样化的组织工程的结构(如皮肤血管,血管上皮细胞,真皮血管,皮下等)。
  • 它使用一种单细胞的来源,同时发展多细胞车厢。
  • 它有可能与宿主组织的整合,因为它是天然来源。
  • 内的凝胶结构CSM提供了一个平台,为细胞迁移。
  • 壳聚糖,用于准备CSM的,是一个众所周知的活跃的化学引诱剂。
  • 在这个“矩阵驱动的干细胞分化”的协议,适用于整体概念可以应用到其它的干细胞类型。然而,进一步的调查是必要的,确定的矩阵驱动分化的可行性。双层凝胶支架可以作为水库细胞在持续的和可控的方式提供。
  • 重建后,凝胶仍然可以被分离成单个组件。

图1
图1。示意图描绘的总体目标和过程的技术。 1)脂肪干细胞(ASCs)劳交锋到壳聚糖微球。 2)胶原蛋白,然后倒入6孔插入,调整以fibrillate胶原蛋白的pH值,并放置到6孔板室插入。在胶原蛋白ASC装的CSM球然后分层。 3)聚乙二醇化纤维蛋白原,然后倒在胶原蛋白(ASC - CSM)和凝血酶此外胶凝。 4)最后的双层结构可以从插入的文化,并在体外体内分析。

图2
图2。表征的ASC内的胶原蛋白和PEG-纤维蛋白的三维矩阵的培养。一个隔离升序)相衬显微照片传代并保持使用常规二维细胞培养技术。显微B,D和F描绘的ASC-CSM在三维胶原凝胶中培养的,而C,E和G秀的ASC-CSM在3维PEG纤维蛋白胶,既培养第1天2。在B和C),ASCs的迁移从CSM的领域中的两个支架类型。 ASCs的出现有一个扁平的,纺锤状的胶原蛋白的形态(乙),同时保持其表达干细胞标记STRO-1(D组;箭头)。当聚乙二醇 - 纤维素的ASCs培养表现出更多的筒状结构和诱导表达血管内皮细胞标记物,如血管性血友病因子(E)。透射电子显微镜描绘了典型的形态,通过在每个支架的ASCs证明。在胶原蛋白凝胶的ASCs出现有小的丝状伪足(FL)从体细胞(F)的延长,而通常的ASCs形成食管腔结构(L),(G组;箭头)。

图3
图3。之间的胶原蛋白和PEG-纤维素凝胶的双层ASC-CSMS形态分析。 ASC-CSMS“夹心阶层”之间的胶原蛋白和聚乙二醇纤维蛋白凝胶和文化保持11天。左colu百万描绘ASCs的迁移和增殖,胶原基质内出现主轴样形态。右列描述的ASCs迁移远离了CSMS,形成整个PEG - 纤维蛋白胶的筒状结构。

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Discussion

ASCs的是众所周知的,他们易于隔离和向多种细胞类型分化的能力。在这个手稿中描述的技术,我们能够利用这些细胞暴露多个biomatrices同时ASCs的可塑性。细胞迁移远离他们的CSM基地,并进入其周围的细胞外环境,细胞采取从断头台上的提示,并可以保持“干细胞”(胶原蛋白),或向血管和血管支持细胞类型(纤维蛋白)被诱导分化。由于我们的实验室是在皮肤及软组织伤口愈合的兴趣,我们的战略实施以来的胶原蛋白和纤维蛋白双层胶原真皮和表皮的再生,支持由主机,而纤维蛋白自然引起血管网的形成9。此外,它现在的理解,增殖皮肤角质细胞,成纤维细胞,和底层的血管网之间发生串音;这个复杂的机制是非常正确的伤口愈合10的关键。如果没有一个基本的血管网,组织工程皮肤移植有困难inosculating与宿主组织。因此,我们总体的假设是,胶原蛋白和纤维蛋白,作为ASCs的双层结合使用时,将减少伤口愈合时间,改善血管,皮肤,再上皮化进程的一个或多个阶段。

纤维蛋白是一种多功能的凝血酶介导的一个派生纤维蛋白单体纤维蛋白原裂解后形成的生物聚合物。纤维已应用于临床,作为止血剂(美国食品和药物管理局批准),以及在多种临床应用,包括程序,如软组织剥离密封剂。从商业纯化的异体纤维蛋白原和凝血酶的纤维蛋白凝胶已在过去十年中广泛使用在各种组织工程应用。然而,一些重大的缺点,我N使用纤维蛋白凝胶,可以是1)脚手架的萎缩,2)适当的组织工程结构的形成前低的机械刚度,3)迅速降解的潜力。为了克服这些问题,纤维蛋白作为一个更好的三维组织工程支架使用前,需要进行修改。一个这样的方法共聚纤维与聚乙二醇(PEG-纤维蛋白)。我们的前期工作已经证明PEG-纤维素的几个独特的功能,使伤口愈合的优势超过其他水凝胶敷料,包括未修改纤维。聚乙二醇 - 纤维素具有合成水凝胶和天然材料的独特功能。具体来说,聚乙二醇的存在提供了一个高度水合(> 90%的水)管理分泌物的湿润环境。其次,纤维蛋白的存在赋予生物降解材料,但事先结果表明,聚乙二醇化纤维比unPEGylated纤维蛋白在体外明显更稳定

第二部分是我们的双层胶原蛋白。胶原蛋白是一种天然生物材料的广泛表达在哺乳动物和不同类型的细胞直接作为附件网站。不同的组织表达了不同类型的胶原蛋白(1型type29),根据功能需要的组织类型。其他胶原蛋白的固有特性,使在我们的模型极具吸引力的是:1)非炎症,2)胶原蛋白的整体退化的生物相容性,3)它是一个高度多孔水凝胶,4)支持细胞浸润和迁移,5)保持多潜能干细胞,6),它是通过调节配方可调,7),它很容易与宿主组织相吻合。对于我们的皮肤及软组织再生的研究,双层胶原蛋白组成的复合材料是一种自然的选择,因为整个皮肤,包括深真皮地区高效表达,可作为免疫组化标记,以评估伤口的深度。

在这个协议中,我们展示的技术,同时保持ASCs的“干”的,而区分的ASCs向各种血管细胞类型。对于皮肤和其底层的软组织的研究,胶原蛋白和PEG-纤维是直接适用。然而,其他bioscaffold材料可以实现学习他们探索的独特的能力,诱导ASC成其他类型的细胞。在这里实施的技术,有助于突出在控制干细胞的表型的细胞外基质的重要性和印证层状复合材料的探索皮肤再生。

总结

关键步骤

  • 应调整其正确的等电点的pH值(PH6.8-7.1),胶原蛋白,诱发房颤,并得到一个稳定的凝胶STRucture。
  • PEG应准备新鲜的混合与纤维蛋白原的解决方案之前,因为水PEG的保质期很短(4-5小时)。
  • 纤维蛋白原的PEG混合物的孵化时间不应超过25分钟(在37°C),因为过度孵化过程中可能会导致凝胶混浊不透明沉淀。
  • 聚乙二醇化纤维蛋白原的解决方案中添加凝血酶后,混合物应免除文化立即插入后,用吸管轻柔混合。持有较长时间(> 30秒)的混合溶液的枪头,可能导致凝胶内获得均匀倒入凝胶枪头和困难。
  • 在CSM床大小均匀的微球均匀分布的细胞,是最佳的细胞加载的关键。 CSM的直径大小的变化直接影响到每毫克微球的细胞附着的表面积,而均匀分布的ASC-CSM直接影响到T细胞迁移他脚手架。细胞的微球(ASC-CSM)的应分布均匀,以确保即使在脚手架的ASCs迁移的胶原蛋白凝胶的顶部。如果ASC-CSMS的分布过于密集,细胞迁移将得到集中到一个特定的区域内凝胶,并可能会限制细胞与细胞相互作用后迁移。
  • 确保媒体的体积增加外以及细胞培养插入是高于内以及半月板。通常情况下,内,外体积比:1:2是合适的,因为这有利于细胞附着的微球。

限制

  • 此方法仅限于微球总面积。如果需要较高的细胞数,需要更多的球,以增加表面积。
  • 由于细胞的目的是从微迁移,时间滞后,可观察到细胞的初始迁移到凝胶内。
  • 微球是在两个凝胶的界面(胶原蛋白和PEG-纤维素),这可能会限制/细胞迁移到凝胶的末端较长的时间。
  • 双层建设过程中,聚乙二醇化纤维蛋白原,凝血酶混合物将迅速增加超过胶原上的CSM-升序床。这可能会导致ASC-CSMS的重新分配不均。在凝胶结构的不平衡重新分配接口ASC-CSMS在PEG纤维蛋白胶铸造的情况下,可能会慢慢激动手动快速重新分配球之前完成凝胶。
  • 这种方法只限于有洄游的性质和可能不适合提供锚地独立的细胞类型的细胞。
  • 前房颤的胶原溶液保持在酸性pH值和限制直接混合细胞在胶原凝胶。因此,如果不调整,在合理时间内(30分钟),细胞活力可能会受到影响。
  • 由于在G在这种结构中使用的埃尔斯单独分层,在处理过程中可能会出现一个可能中断或凝胶分离。因此,它可能会限制在处理过程中体内研究的方便。

可能修改

  • ASC-CSMS可以均匀分布在个别凝胶,而不是分层他们在界面上。
  • 可以直接混合的ASCs CSM所提供,而不是在个别的凝胶,但是这可能会限制发展的高度组织的细胞组织结构图案。
  • 为了避免在聚乙二醇纤维铸造不平衡ASC-CSMS重新分配,ASC-CSMS可悬浮在水溶液壳聚糖溶液的体积小(1%W / V),并均匀地分布在胶原凝胶。这将确保公司在胶原蛋白凝胶层的ASC-CSMS附件和防止胶原表面撞出ASC-CSMS。
  • 在一个倒置的方式,可以利用本身的构造,即PEG-Fibrin凝胶可投和ASC-CSMS可以在胶原凝胶PEG-纤维素凝胶的种子。这样做可以让用户(ASC-CSM)的PEG-纤维层蒙上纤胶原溶液更为谨慎,因为,不同的PEG-纤维蛋白凝胶,胶原纤的解决方案需要额外的时间(30分钟),以巩固。采用此过程中,可以确保维持甚至ASC - CSM的分布。
  • 凝胶(胶原蛋白和/或聚乙二醇 - 纤维素凝胶)可以注册成立的有丝分裂,样生长因子(如血管内皮生长因子,成纤维细胞生长因子),从而导致更快的细胞迁移和增殖。

故障排除

  • 在胶原溶液的颤动,如果pH值高于等电点pH值> 7.2,pH值应调整,通过添加更多的胶原蛋白原液,用弱酸性溶液中的pH值降低。
  • 当准备CSM的,如果在大小占用大的变化RS,那么参数的数量可以调整,以产生所需的CSM的大小(壳聚糖原液的粘度,表面活性剂的量,搅拌速度等)。
  • 在填充凝胶时,缓慢的细胞迁移的情况下,较高的ASC-CSMS可以用来提高CSM的迁移到凝胶的细胞数量。
  • PEG-纤维蛋白原凝胶过程,可以削减量的凝血酶的混合物(通常为900μL,而不是1毫升)或准备低浓度的凝血酶股票(20 U / ml的25 U / ml的智障) 。这使得PEG-纤维蛋白原混合凝胶较慢,从而给出了谨慎的聚乙二醇化纤维蛋白原和凝血酶的混合物在ASC-CSMS铸造额外的时间。
  • 孵化过程中,如果发生相分离(胶原蛋白和纤维蛋白胶之间),无菌的特氟隆“O”环可放置在顶部的结构,以确保固定凝胶相。

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Disclosures

没有竞争的金融利益存在。

免责声明

所载的意见或主张是作者的私人意见,是不被理解为官方或反映国防部或美国政府部门的意见。作者是美国政府的雇员,以及作为其执行公务的一部分准备工作。所有的工作是由美国陆军医学研究和装备司令部的支持。这项研究是由美国陆军医学研究和装备司令部机构审查委员会,并按照批准的协议的审查和批准了一项协议下进行的。

Acknowledgments

支持博士后奖学金资助从匹兹堡组织工程​​倡议的SN。 DOZ的日内瓦基金会颁发的赠款支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

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References

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工程双层凝胶控制升序分化
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Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

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