Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Bearbejdning af et dobbeltlag Hydrogel at styre ASC differentiering

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

Denne protokol fokuserer på at udnytte den iboende evne stamceller at tage udgangspunkt i det omgivende ekstracellulære matrix og kan induceres til at differentiere til flere fænotyper. Dette fremgangsmåder manuskript strækker vores beskrivelse og karakterisering af en model under anvendelse af en dobbeltlagede hydrogel bestående af PEG-fibrin og collagen, til samtidig co-differentiere adipøst afledte stamceller

Abstract

Naturlige polymerer i årenes løb har fået større betydning på grund af deres vært biokompatibilitet og evne til at interagere med celler in vitro og in vivo. Et forskningsområde, som holder løfte regenerativ medicin er det kombinatoriske anvendelse af hidtil ukendte biomaterialer og stamceller. En grundlæggende strategi på vævet teknik er anvendelsen af ​​tredimensionale stillads (f.eks decellulariserede ekstracellulær matrix, hydrogeler, mikro / nano-partikler) til at dirigere cellefunktion. Denne teknologi har udviklet sig fra den opdagelse, at celler skal et substrat, hvorpå de kan adhærere, proliferere og udtrykke deres differentierede cellulære fænotype og funktion 2-3. For nylig er det også blevet konstateret, at cellerne ikke kun anvender disse substrater til vedhæftning, men også interagere og tage signaler fra matrixen substratet (f.eks ekstracellulær matrix, ECM) 4. Derfor cellerne og scaffolds har en gensidig forbindelse,tjener til at styre væv udvikling, organisation og ultimative funktion. Adipøst afledte stamceller (ASC'er) er mesenchymal, ikke-hæmatopoietiske stamceller er til stede i fedtvæv, som kan udvise multi-linie differentiering og tjene som en let tilgængelig kilde til celler (dvs. præ-vaskulære endothel og pericytes). Vores hypotese er, at adipøst afledte stamceller kan rettes mod forskellige fænotyper samtidigt ved simpelthen co-dyrkning deraf i dobbeltlagede matricer 1. Vores laboratorium er fokuseret på huden sårheling. Til dette formål har vi skabt en enkelt sammensat matrix fra naturlige biomaterialer, fibrin, collagen og chitosan, der kan efterligne karakteristika og funktioner af en dermal-specifik sårheling ECM miljø.

Protocol

1. Isolering adipøst afledte stamceller (ASC'er) 1, 5

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Isoler rotte perirenalt og epididymalt fedt-og vaskes med steril Hanks pufrede saltopløsning (HBSS) indeholdende 1% føtalt bovint serum (FBS) som tidligere beskrevet 5. Denne undersøgelse er gennemført i overensstemmelse med dyreværnsloven, gennemførelsesbestemmelserne regler for dyrevelfærd, og i overensstemmelse med principperne i vejledningen til pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
  2. Hakket vævet og overføre 1-2 g i 25 ml HBSS indeholdende 1% FBS i en 50 ml rør og centrifugeres ved 500 g i 8 minutter ved stuetemperatur.
  3. Opsamle fritflydende fedtvæv lag og overførsel til 125 ml Erlenmeyer-kolbe og behandles med 25 ml kollagenase type II (200 U / ml) i HBSS i 45 minutter ved 37 ° C på et orbitalt rysteapparat (125 rpm). Forsigtigt fjernes den flydende fraktion (under olie og fedt lag) ved pipettering og filtreres sekventielt gennem en 100 - um og 70 - um nylon mesh filter. Centrifugeres filtratet ved 500 g i 10 minutter ved stuetemperatur, aspireres supernatanten og vask pellet to gange med 25 ml HBSS.
  4. Resuspenderes cellebundfaldet i 50 ml vækstmedium (MesenPRO RS Basal Medium) suppleret med MesenPRO RS Growth Supplement, antibiotikum-antimykotikum (100 U / ml penicillin G, 100 ug / ml streptomycin-sulfat og 0,25 ug / ml amphotericin B) og 2 mM L-glutamin og pipettespidser celler i to T75-kolber (25 ml / kolbe).
  5. Kultur af ASC i en 5% CO 2-befugtet inkubator ved 37 ° C (passage 2-4 ASC'er anvendes til alle eksperimenter).

2. Klargøring Chitosanmikrosfærer (fælles sikkerhedsmetoder)

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

    5. Emulgere en vandig opløsning af chitosan (6 ml 3% vægt / volumen chitosan i 0,5 M eddikesyre) i en 100 ml af en oliefase bestående af sojaolie, n-octanol (1:2 v / v) og 5 % sorbitan-mono-oleat (span 80) emulgator, under anvendelse overliggende (1700 rpm) og magnetisk omrøring (1000 omdrejninger i minuttet) samtidigt i modsatte retninger. Denne dobbelte fremgangsmåde til blanding sikrer, at miceller dannet tidligt, før tværbinding finder sted, kan forblive i opløsning og ikke at sedimentere til bunden. Endvidere magnetisk omrørerstang AIDS i de-aggregering chitosan under micelledannelse og rigidization.
  1. Blandingen omrøres kontinuerligt omrørt i cirka 1 time, indtil en stabil vand-i-olie-emulsion er opnået. Initiere ionisk tværbinding med tilsætning af 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroxid i n-octanol hvert 15. minut i 4 timer (24 ml total)
  2. Tør den gendannede kugler i vakuum og analysere uden yderligere forarbejdning. Du kan bestemme den gennemsnitlige CSM partikelstørrelse, areal pr milligram, og enheden kubiske volumen ved hjælp af en partikelstørrelse analysator.
  3. For efterfølgende eksperimenter, vaskes CSM tre gange med sterilt vand til fjernelse af resterende salte og steriliseres ved vask natten over med 5 ml absolut ethanol.

3. Bestemmelseaf antallet af frie aminogrupper i sikkerhedsmetoder

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Bestemmelse af antallet af frie aminogrupper til stede i sikkerhedsmetoder efter ionisk tværbinding ved hjælp af trinitro benzensulfonsyre (TNBS) syre assay Bubnis og Ofner 6. Inkuber 5 mg mikrosfærer med 1 ml 0,5% TNBS-opløsning i et 50 ml glasrør i 4 timer ved 40 ° C og hydrolysere ved tilsætning af 3 ml 6 N HCI ved 60 ° C i 2 timer.
  2. Afkøle prøverne til stuetemperatur og ekstraheres de frie TNBS ved tilsætning af 5 ml deioniseret vand og 10 ml ethylether.
  3. Opvarme en 5-ml prøve af den vandige fase til 40 ° C i et vandbad i 15 minutter for at fordampe alle resterende ether, afkøles til stuetemperatur og fortyndes med 15 ml vand.
  4. Mål absorbansen ved 345 nm med et spektrofotometer ved hjælp af TNBS løsning uden chitosan som tomt, og chitosan anvendes til CSM perstatning for at bestemme det totale antal aminogrupper. Estimere antallet af frie aminogrupper af CSM i forhold til chitosan.

4. Loading ASC i CSM

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Ækvilibrere 5 mg steriliseret sikkerhedsmetoder fra afsnit 2.5 i sterile HBSS natten over og tilsættes til en 8 - um porestørrelse membran dyrkningsplade insert (24-brønds plade).
  2. Efter sikkerhedsmetoder har fast på membranen omhyggeligt indsuges HBSS, og der tilsættes 300 pi vækstmedium til indersiden af ​​indsatsen og 700 pi af vækstmedier til ydersiden af ​​indsatsen.
  3. Resuspender ASC'er i den passende koncentration (1 x 4 til 4 oktober x 10 4) i 200 pi vækstmedium og frø over CSM inde i dyrkningspladen insertet. Det endelige volumen af ​​medium i kulturen insertet, efter podning, er 500 uL.
  4. Incubspiste ASC podet på sikkerhedsmetoder i 24 timer i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.

5. Om fastsættelse af ASC Loading og cellelevedygtighed i fælles sikkerhedsmetoder

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Efter inkubation pipetteres ASC-ladede CSM i en steril 1,5-ml mikrocentrifugerør uden at forstyrre cellerne, der er migreret ind i indsatsen membranen.
  2. Fjernelse af det resterende medium, og der tilsættes 250 pi frisk vækstmedium til røret.
  3. Til hvert rør, 25 pi MTT tilsættes [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid]-opløsning (5 mg / ml) og inkuberes i 4 timer i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
  4. Efter inkubation fjernes mediet, og der tilsættes 250 pi af dimethylsulfoxid, og vortex blandingen i 2-5 minutter for at solubilisere formazan komplekset.
  5. Centrifuger CSM på 2700 gi 5 minutter, pipetteres supernatanten og bestemme dens bølgelængde-absorbans ved 570 nm og 630 nm under anvendelse af en standard-pladelæser ifølge MTT producentens specifikationer.
  6. Bestemme celleantallet forbundet med sikkerhedsmetoder forhold til de værdier, der opnås defineret ASC tal dyrket for at udvikle en standardkurve.

6. Fremstilling og karakterisering af ASC-CSM Indlejret i PEG-fibringeler

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Polyethylenglycol (PEG) fibrin (PEG-fibrin) hydrogel fremstilles ved Suggs et al 7 ved at opløse succinimidylglutarat modificeret polyethylenglycol (PEG; 3400 Da). Anvendelse af 4 ml tris-bufret saltvand (TBS, pH 7,8) og filtreres sterilisere med et 0,22 um filter lige før forsøget. Opløst PEG er kun effektiv i denne ansøgning for de første 3-4 timer.
  2. Bland 500 μ l fibrinogen stamopløsning (40 mg / ml i TBS, pH 7,8) og 250μl af PEG stamopløsning i en kultur brønd af en 6-brønds plade og inkuber i 20 minutter i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Denne blanding udgør en molær koncentration på 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogen.
  3. Tage 250 ul ASC-CSM ved en koncentration på 5 mg CSM, (≈ 2 x 10 4 celler) og blandes med den PEGylerede fibrinogenopløsningen.
  4. Straks tilsættes 1 ml thrombin lager (25U/mL) og hurtigt udriv én eller to gange med pipetten. Efter blanding af thrombin med PEG-fibrinogen, placeres umiddelbart celle-gel blanding i en 12-brønds plade og inkuberet i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C i 10 minutter for at tillade fuldstændig gelering. Da den Geleringstiden er hurtig, ikke forsøge at holde gelen løsning inden pipettespidsen i mere end 5 sekunder. Det PEGylerede fibrinogen spaltes af thrombin, og danner en PEGyleret fibrin hydrogel. Som sådan the slutgel produkt betegnes som PEG-fibrin.
  5. Vask PEG-fibringeler to gange med HBSS, og der inkuberes med alfa minimale essentielle medium (α-MEM) suppleret med 10% FBS i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
  6. Overhold migration af celler fra CSM i gelen over en 11-dages periode ved hjælp af standard lys mikroskopi-teknikker.

7. Fremstilling og karakterisering af ASC-CSM Indlejret i kollagengeler

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Blanding ASC-CSM (5 mg indeholdende ≈ 2 x 10 4 celler) med type 1 collagen (7,5 mg / ml) ekstraheret fra rotte hale sener ifølge fremgangsmåden af Bornstein 8 og fibrillerer efter justering af pH til 6,8 med 2N NaOH.
  2. Tilføje fibrillerede collagen-ASC-CSM blanding til en 12-brønds plade og inkuber i 30 minutter i en 5% CO 2 humidiceret inkubator ved 37 ° C.
  3. Efter fuldstændig fibrillering, inkubere collagen-ASC-CSM geler op til 11 dage i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
  4. Overhold migration af celler fra CSM i gelen over en 11-dages periode ved hjælp af standard-mikroskopi-teknikker.

8. Udviklingen af ​​dobbeltlagede PEG-fibrin-(ASC-CSM)-kollagengel konstruktioner

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. At udvikle dobbeltlaget konstruktion, forberede både collagen og PEG-fibrin-geler som beskrevet ovenfor, med små modifikationer. Kort fortalt, at studere de migrerende og co-induktion egenskaber af en enkelt kilde til stamceller under anvendelse af to bioscaffolds, "sandwich" ASC-sikkerhedsmetoder mellem collagen og PEG-fibrin scaffolds ved anvendelse af en fire-trins proces: 1) Load ASC på CSM, 2) kastede fibrilleret kollagengel og lag de ASC-CSM perler over Collagen gel, 3) støbt PEG-fibringel over ASC-CSM-kollagengel og tillade gelen at størkne, og 4) tilsættes medium til brønden og indsætte for at studere celler in vitro eller fjerne fra insertet til in vivo anvendelser (se figur 1 ).
  2. Der fremstilles en 1-ml type 1 collagen (7,5 mg / ml)-blanding som beskrevet ovenfor i 7.1, uden tilsætning af ASC-CSM til blandingen. Anbring blandingen i en 6-brønds vævskultur insert (8-um porestørrelse) og inkuberes i 30 minutter i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
  3. Efter fuldstændig fibrillering, lag over collagen overflade 5 mg ASC-CSM (10, 000 celler / mg) suspenderes i dyrkningsmedier (200 ul). Efter at mikrokuglerne er fast over gelen, forberede PEG-fibrin-gel som beskrevet i afsnit 6.0, uden tilsætning af ASC-CSM til blandingen, og laget af PEGyleret fibrinogen / thrombin-opløsning i løbet af de ASC-CSM-collagen lag. Ved forberedelse af PEG-fibringel, brug 250 pi cellekulturmedium i stedet for tHan 250 pi medium indeholdende cellerne.
  4. Når de er udført, inkuberes konstruktionerne i 30 minutter i en 5% CO 2 befugtet inkubator for at opnå fuldstændig gelering, før fremføring af konstruktionen med dyrkningsmedium.
  5. Efter fuldstændig gelering. Sted 1 ml medium i det øvre kammer i konstruktionen og 3 ml medium i det nedre kammer

9. Gør Stock Solutions

Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  • Calciumchlorid lager (40 mM): Brug kun CaCl 2 .2 H 2 O. Opløs 588,4 mg CaCl2 0,2 H2O med 100 ml deioniseret vand. Sterilisere ved anvendelse af en 0,22 um filter.
  • Polyethylenglycol: PEG er yderst reaktivt med oxygen og kan blive oxideret når de udsættes for luft. Som sådan bør PEG opbevares under nitrogen (N2) atmosfære. Accurately vejer 32 mg i en 2-ml centrifugeglas (sørg for at rense rørene med N 2 inden brug) og opbevares ved -80 ° C, indtil klar til brug. Opløs 32 mg PEG i 4 ml af TBS-opløsning før anvendelse.
    Følgende løsninger skal foretages frisk før hver eksperiment.
  • TBS-opløsning (pH 7,75 til 7,77 ved 25 ° C, pH ved 25 ° C er meget kritisk). Til fremstilling af 15 ml TBS-opløsning omhyggeligt opløse en buffer tablet filtersteriliseret deioniseret vand og justeres til den ønskede pH. Opbevar ikke stamopløsningen-forberede den frisk hver gang.
  • Fibrinogenopløsning (40 mg / ml). Opløs fibrinogen pulver i TBS at gøre fibrinogenkoncentration 40 mg / ml. Opløses den natten over med en magnetomrører ved 4 ° C. Det er lettere at opløse hele 1-g mængde med den påkrævede mængde TBS. Den følgende dag fjernes fibrinogen fra 4 ° C (sædvanligvis uklart) og tillader denat opvarme i et vandbad, indtil en homogen opløsning er opnået. Endelig Filtersteriliser fibrinogen ved hjælp af en 0,45 um filter.
  • Thrombinopløsning (25 enheder / ml): At gøre thrombinopløsning, afvejes den krævede mængde og opløses med det fremstillede 40 mM CaCl2 0,2 H2O Det er altid en god ide at bruge hele hætteglasset af thrombin til at gøre bestanden. Eksempel: Opløs en flaske 5 kU thrombin med 200 mM CaCl2 0,2 H2O, alikvot og opbevares ved -20 ° C.

10. Repræsentative resultater

Det overordnede mål for den teknik, der præsenteres her, er at demonstrere potentialet af samtidige matrix-drevet differentiering af ASC i flere fænotyper ved hjælp af CSM som en leverance køretøj. Vi viser en in vitro strategi til at levere stamceller fra sikkerhedsmetoder til en dobbeltlagede collagen-PEG-fibrin stillads. Karakterisering af ASC indlejret i dette skelet revealed, at ASC-loaded sikkerhedsmetoder kan blive "klemt" mellem et lag af kollagen og PEG-fibrin samtidigt og varierende tager udgangspunkt i både ekstracellulære miljøer til at trives under deres nye forhold. Vi først karakteriseret evne til modelsystem for at opretholde cellelevedygtighed og migrerende kapacitet. Collagen støttet evne ASC'er til at opretholde deres "stemness", som blev påvist ved deres ekspression af Stro-1 og deres fibroblastlignende morfologi (fig. 2D og 2F). I modsætning hertil inducerede PEG-fibrin de ASC'er at skelne mod en vaskulær fænotype, som det fremgår af deres rørlignende struktur morfologi, deres endotelcelle-specifikt ekspression af von Willebrand faktor (fig. 2E og 2G) og pericyte-specifik ekspression af NG2 og blodpladeafledt vækstfaktorreceptor beta (PDGFRβ) (data ikke vist). Desuden er disse observerede fænotyper synes at forekomme tidligt i kultur og blev opretholdt i løbet af 11 dage, som er DEMonstrated i figur 3.

Tabeller og Tal

Fordele ved tolag Construct:

  • Stilladset alene uden celler kan virke som et bioaktivt stillads.
  • PEG-fibrin kan inducere stamceller til at differentiere uden tilsætning af vækstfaktorer.
  • Collagen kan hjælpe med at opretholde stamcelle-fænotype af ASC'er.
  • En tolags konstrukt kan anvendes som en aktiv substrat for andre celletyper til at vandre og proliferere (f.eks endotelceller, fibroblaster, keratinocytter, glatte muskelceller, pericytter).
  • Den kan anvendes med hård vævs-engineering scaffolds, såsom hydroxyaptite eller demineraliseret knogle at regenerere hårde og bløde væv.
  • Det kan bruges til at udvikle en multi-lag, forskellige væv-manipuleret konstruktion (som dermal-kar-, vaskulær-epitel, dermal-kar-hypodermal, etc.).
  • Det anvender en enkelt-cellekilde til samtidigt at udviklemulticellulære rum.
  • Det har potentialet til at integreres med værtsvævet, da det er af naturlig oprindelse.
  • CSM i gelen konstruktion giver en platform for celler til at migrere fra.
  • Chitosan, der anvendes til fremstilling CSM, er en velkendt aktiv kemo-tiltrækningsstof.
  • Det samlede koncept anvendes i denne protokol "matrix-drevne stamcelle-differentiation" kan anvendes på andre stamceller typer. Imidlertid yderligere undersøgelse berettiget til at bestemme muligheden for matrix-drevet differentiering. Den dobbeltlagede gel Stilladset kan fungere som et reservoir til at levere celler i en vedvarende og styret måde.
  • Efter rekonstruktion, kan gelerne stadig adskilles i individuelle komponenter.

Figur 1
Figur 1. Skematisk afbildning det overordnede mål og fremgangsmåden ifølge den teknik. 1) adipøst afledte stamceller (ASC'er) er loaded på chitosan-mikrosfærer. 2) Collagen hældes derefter i en 6-brønds insert, pH justeret til fibrillerer kollagen, og indsatsen er placeret i en 6-brønds plade kammer. ASC-fyldte CSM kugler derefter anbragt over collagenet. 3) Det PEGylerede fibrinogen derefter hældt over collagen (ASC-CSM) og geleret ved tilsætning af thrombin. 4) Den endelige dobbeltlaget konstruktion kan derefter fjernes fra kulturen indsatsen og anvendt til in vitro eller in vivo analyser.

Figur 2
Figur 2. Karakterisering af ASC dyrket i kollagen og PEG-fibrin 3D matricer. A) et fasekontrast-mikrofotografi af isoleret ASC passager og opretholdes ved hjælp af rutinemæssig 2-dimensionelle cellekulturteknikker. Mikrofotografier B, D og F viser ASC-CSM dyrket i en 3-dimensional kollagengel, hvorimod C, E og G viser ASC-CSM dyrket i en 3-dimensional PEG-fibringel, både på dag 12. I B og C), er ASC'er vist migrere væk fra CSM sfære i begge stillads typer. ASC'er synes at have en flad, spindel-lignende morfologi i kollagen (B), under opretholdelse af deres ekspression af stamcelle markør Stro-1 (D pil). Når de dyrkes i PEG-fibrin ASC'er udviser mere rør-lignende strukturer, og induceres til at udtrykke sådanne vaskulære cellemarkører som von Willebrand faktor (E). Transmissionselektronmikroskopi afbilder typiske morfologi påvist ved ASC'er i hver stillads. ASC'er i kollagengel synes at have mindre filopodia (fl) strækker sig fra legemet af cellen (F), medens ASC'er typisk dannet luminale (mærket L) strukturer (G pil).

Figur 3
Figur 3. Morfologisk analyse af ASC-sikkerhedsmetoder mellem dobbeltlag af kollagen og PEG-fibrin-geler. ASC-sikkerhedsmetoder blev "sandwiched" mellem kollagen og PEG-fibrin-geler og holdt i kultur i 11 dage. Venstre column viser ASC trækkende og breder sig i collagenmatrix og synes at tage på en spindel-lignende morfologi. Den højre kolonne viser ASC'er migrere væk fra sikkerhedsmetoder og danner rør-lignende strukturer i hele PEG-fibringel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ASC'er er kendt for deres lette isolation og evnen til at differentiere mod forskellige celletyper. Med teknikkerne beskrevet i dette skrift, er vi i stand til at udnytte plasticitet ASC'er ved at eksponere disse celler til flere biomatrices samtidigt. Som celler migrere væk fra deres CSM base og ind i deres omgivende ekstracellulære miljø, cellerne tager udgangspunkt i stilladset og kan enten bibeholde "stemness" (collagen) eller kan induceres til at differentiere mod vaskulære-og vaskulære-støttende celletyper (fibrin). Da vores lab er interesseret i hud og blødt væv sårheling, vi strategisk implementeret et dobbeltlag af collagen og fibrin siden kollagen understøtter dermal og epidermal regeneration af værten, mens fibrin naturligvis inducerer vaskulære netværk formation 9. Desuden er det nu forstås, at krydstale forekommer mellem prolifererende hudkeratinocyter, fibroblast og den underliggende vaskulære netværk, og dette kompleksmekanisme er meget kritisk for korrekt sårheling 10. Uden en underliggende vaskulær netværk, har vævs-manipuleret hudtransplantation svært inosculating med værtsvæv. Derfor vores samlede hypotese er, at kollagen og fibrin, når det anvendes som et dobbeltlag i kombination med ASC'er, vil falde sårhelende gange ved at forbedre én eller flere stadier af blodkar, dermal, og re-epitelisering processer.

Fibrin er en alsidig biopolymer dannet efter thrombin-medieret spaltning af fibrinopeptid A afledt fra monomert fibrinogen. Fibrin er blevet anvendt klinisk som et hæmostatisk middel (godkendt af US Food and Drug Administration) og som et tætningsmiddel i en række kliniske anvendelser, herunder fremgangsmåder, såsom blødt væv dissektion. Fibrin hydrogeler fra kommercielt renset allogen fibrinogen og thrombin er blevet anvendt bredt i det sidste årti i en række vævsmanipulering applikationer. Men nogle store ulemper in ved hjælp af en fibrin hydrogel kan være 1) potentialet for stillads til at skrumpe, 2) lav mekanisk stivhed, og 3) en hurtig nedbrydning før korrekt dannelsen af ​​væv-manipuleret strukturer. For at overvinde disse problemer, fibrin skal modificeres før anvendelse til at tjene som en bedre tredimensionalt vævsmanipulering stillads. En sådan fremgangsmåde er copolymerisering af fibrin med polyethylenglycol (PEG-fibrin). Vores foreløbige arbejde har vist flere unikke funktioner i PEG-fibrin, der gør det fordelagtigt i sårheling end andre hydrogelforbindinger, herunder umodificerede fibrin. PEGyleret-fibrin udviser unikke træk fra begge syntetiske hydrogeler og naturlige materialer. Specifikt tilstedeværelsen af ​​PEG tilvejebringer en meget hydratiseret (> 90% vand) fugtigt miljø for styring udsondringer. Sekund, tilstedeværelsen af fibrin giver bionedbrydelighed til materialet, men tidligere resultater viser, at PEGyleret fibrin er signifikant mere stabile in vitro end ikke-pegyleret fibrin

Den anden komponent i vores dobbeltlaget er collagen. Kollagen er et naturligt biomateriale ubikvitært udtrykt i pattedyr og tjener som en direkte bindingsstedet for forskellige typer celler. Forskellige væv udtrykker forskellige typer af collagen (type 1-type29), afhængigt af typen af ​​funktionel behov for vævet. Andre iboende egenskaber af kollagen, der gør det meget attraktiv i vores model er, at 1) det er ikke-inflammatorisk, 2) både hele og nedbrudt komponenter collagen er biokompatible, 3) det er en meget porøs hydrogel, 4) understøtter celleinfiltration og migration, 5) opretholder multipotency af stamceller, 6) er indstillelig ved at modulere formulering, og 7) den let inosculates med værtsvæv. For vores studier i hud og blødt væv regenerering, er en tolags kompositmateriale, bestående af kollagen et naturligt valg, daDet er overudtrykt i hele huden, herunder dybe dermale regioner, og kan anvendes som en immunhistokemisk markør til at vurdere dybden af ​​et sår.

I denne protokol, viser vi en teknik til samtidig at opretholde "stemness" af ASC, mens differentiere ASC mod forskellige vaskulære celletyper. Til undersøgelse af huden og det underliggende blødt væv, er collagen og PEG-fibrin direkte anvendelse. Dog kan andre bioscaffold materialer skal gennemføres for at studere deres udforskede unikke evner til at fremkalde ASC til andre celletyper. Teknikken implementeret her med til at understrege vigtigheden af ​​den ekstracellulære matrix i at styre stamceller fænotyper og giver tiltro til udforskning af lagdelte kompositmaterialer til hud regenerering.

Oversigt

Kritiske trin

  • Kollagen bør justeres til sin korrekte isoelektrisk pH (pH 6,8-7.1) for at inducere fibrillering og få en stabil gel structure.
  • PEG bør fremstilles frisk før blanding med fibrinogenopløsning eftersom holdbarheden af ​​vandig PEG er kort (4-5 timer).
  • Inkubationstid på fibrinogen-PEG-blandingen bør ikke overstige 25 minutter (ved 37 ° C), idet over-inkubation kan forårsage en uklar uigennemsigtig udfældning under gelering.
  • Efter tilsætning thrombin til PEGyleret fibrinogenopløsning, skal blandingen dispenseres til dyrkning inserter øjeblikkeligt (efter forsigtig blanding med en pipette). Holder opløsningsblanding i pipettespidsen i længere tid (> 30 sek) kan forårsage gelering i pipettespidsen, og vanskeligheder med at opnå jævnt hældt geler.
  • Brug af ensartet størrelse mikrokugler og jævnt fordelt celler over den CSM sengen er afgørende for optimal celle læsning. CSM størrelse variation i diameter direkte indflydelse areal til rådighed for cellebinding pr milligram af mikrokugler, mens jævnt fordelt ASC-CSM direkte påvirker celle migration til tHan stillads. Den celle-fyldte mikrosfærer (ASC-CSM) skal fordeles jævnt oven på kollagengelen at sikre jævn vandring af ASC'er i stilladset. Hvis fordelingen af ​​ASC-sikkerhedsmetoder er for tæt, vil cellemigrering blive koncentreret til et bestemt område i gelerne og kan begrænse celle-celle interaktion efter migration.
  • Sikre, at mængden af ​​mediet tilsættes til den ydre brønd i celledyrkningsinsert er højere end menisk af den indre brønd. Typisk en indvendig: ydre volumenforhold på 1:2 er egnet, da dette letter celler knyttet til mikrosfærerne.

Begrænsninger

  • Denne fremgangsmåde er begrænset til det totale overfladeareal findes på mikrokuglerne. Hvis en højere celletal ønskes, er mere mikrosfærer kræves for at forøge overfladearealet.
  • Idet cellerne er beregnet til at migrere fra mikrosfærer, kan en tidsforsinkelse der observeres for den første migration af celler på og inden for gelerne.
  • Mikrosfærerne er i grænsefladen af ​​to geler (kollagen og PEG-fibrin), og dette kan begrænse / tage længere tid for migrationen af ​​celler til distale ender af gelerne.
  • Under konstruktion af dobbeltlaget, har PEGyleret fibrinogen-thrombin blanding, der skal tilsættes hurtigt i løbet af en CSM-ASC bed oven på collagen. Dette kan forårsage en ujævn omfordeling af ASC-sikkerhedsmetoder. I tilfælde af ujævn omfordeling af ASC-sikkerhedsmetoder ved grænsefladen under PEG-fibringel støbning, kan gelen konstruktionen langsomt omrørt manuelt til hurtigt at omfordele mikrosfærerne før fuldstændig gelering.
  • Denne fremgangsmåde er begrænset til celler, der har migrerende egenskaber og kan ikke være egnet til at levere forankringsuafhængig celletyper.
  • Kollagenopløsningen før fibrillering forbliver i surt pH og begrænser direkte blanding af celler i kollagengeler. Som sådan, hvis ikke justeres inden for en rimelig tid (~ 30 min) kan cellelevedygtighed blive kompromitteret.
  • Idet glerne, der anvendes i denne konstruktion er individuelt lag, en eventuel afbrydelse eller adskillelse af gelerne kan forekomme under håndteringen. Derfor kan begrænse lethed i håndtering under in vivo-undersøgelser.

Eventuelle ændringer

  • ASC-sikkerhedsmetoder kan fordeles jævnt indenfor de enkelte gelerne i stedet for lejringstrin dem ved grænsefladen.
  • ASC'er kan blandes direkte i individuelle geler i stedet for levering af CSM, men dette kan begrænse udviklingen af ​​stærkt organiserede celle-mønstrede vævskonstruktioner.
  • For at undgå ujævn omfordeling af ASC-sikkerhedsmetoder under PEG-fibrin støbning kan ASC-sikkerhedsmetoder suspenderes i en lille mængde vandig chitosan-opløsning (1% w / v) og fordeles jævnt over kollagengeler. Dette vil sikre fast fastgørelse af ASC-sikkerhedsmetoder på kollagengelen lag og vil forhindre forskydning af ASC-sikkerhedsmetoder fra collagen overfladen.
  • Konstruktet i sig selv kan anvendes i en omvendt måde, dvs PEG-fibrin geler kan støbes første og ASC-sikkerhedsmetoder kan frø på toppen af ​​PEG-fibrin-geler, efterfulgt af kollagengeler. Dermed tillader brugeren at støbe fibrillerede kollagenopløsningen over (ASC-CSM)-PEG-fibrinlag mere forsigtigt, i modsætning PEG-fibrin-geler, kræver fibrilleret kollagenopløsning ekstra tid (30 min) til at størkne. Med vedtagelsen af ​​denne proces kan man sørge for at opretholde en jævn fordeling af ASC-CSM.
  • Gelerne (kollagen og / eller PEG-fibrin-geler) kan inkorporeres med mitogener, såsom vækstfaktorer (fx, vaskulær endotelvækstfaktor, fibroblastvækstfaktorer), således at inducere hurtigere cellemigration og proliferation.

Fejlfinding

  • Under fibrillering af collagen-opløsning, hvis pH overskrider det isoelektriske pH> 7,2, bør pH justeres ved enten at tilsætte mere kollagen stamopløsning, sænkning af pH ved anvendelse af svag syre.
  • Ved udarbejdelsen af ​​CSM, hvis en stor variation i størrelse erhvervspsykoloRS, så et antal parametre kan justeres til opnåelse af den ønskede CSM størrelse (viskositet af chitosan stamopløsning, volumen overfladeaktivt middel, omrøringshastighed, etc.).
  • I tilfælde af langsom cellemigration ved udfyldning af de geler, kan et større antal ASC-sikkerhedsmetoder anvendes til at øge antallet af celler migrerer ud af CSM til geler.
  • Processen af ​​PEG-fibrinogen gelering kan retarderes ved nedbringelse af mængden af ​​thrombin tilsat til blandingen (typisk 900 ul i stedet for 1 ml) eller fremstilling af en lavere koncentration lager af thrombin (20 U / ml i stedet for 25 U / ml) . Dette giver mulighed for langsommere geldannelse af PEG-fibrinogen blandingen og dermed giver ekstra tid til forsigtig støbning af PEGyleret-fibrinogen og thrombin blandingen over ASC-fælles sikkerhedsmetoder.
  • Under inkubation (mellem kollagen og fibringel), hvis en faseseparation forekommer, kan en steril teflon "O" ring anbringes ovenpå konstruktionen for at sikre fastgørelse af gel faser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen konkurrerende økonomiske interesser eksisterer.

Forbehold

De udtalelser eller påstande, der er indeholdt heri, er de private synspunkter fra de forfattere, og er ikke fortolkes som tjenestemand eller afspejler de synspunkter, som Department of Defense og den amerikanske regering. Forfatterne er medarbejdere i den amerikanske regering, og dette arbejde blev udarbejdet som en del af deres officielle pligter. Alt arbejde blev støttet af den amerikanske hær Medical Research og Materiel Kommando. Denne undersøgelse blev gennemført i henhold til en protokol revideret og godkendt af US Army Medical Research og Materiel Kommando Institutional Review Board og i overensstemmelse med den godkendte protokol.

Acknowledgments

SN blev understøttet af en postdoc Fellowship Grant fra Pittsburgh Tissue Engineering Initiative. DOZ understøttes af et tilskud fra Genève Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
Bearbejdning af et dobbeltlag Hydrogel at styre ASC differentiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter