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Bioengineering

Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nutzung der inhärenten Fähigkeit von Stammzellen zu Stichwort von der sie umgebenden extrazellulären Matrix induziert nehmen und in mehrere Phänotypen zu unterscheiden. Dieses Verfahren erweitert unser Manuskript Beschreibung und Charakterisierung eines Modells unter Verwendung einer zweischichtigen Hydrogel, von PEG-Fibrin und Kollagen zusammen, um gleichzeitig Co-differenzieren Fettgewebe gewonnene Stammzellen

Abstract

Natürliche Polymere im Laufe der Jahre haben mehr Bedeutung wegen ihrer Biokompatibilität und Host-Fähigkeit, mit Zellen in vitro und in vivo interagieren gewonnen. Ein Forschungsgebiet, das Versprechen hält in der regenerativen Medizin ist die kombinatorische Verwendung von neuartigen Biomaterialien und Stammzellen. Eine grundlegende Strategie im Bereich des Tissue Engineering ist die Verwendung von dreidimensionalen Gerüst (zB dezellularisiert extrazellulären Matrix, Hydrogele, Mikro / Nanopartikel) zum Richten Zellfunktion. Diese Technologie wurde von der Entdeckung, dass die Zellen entwickelt ein Substrat, auf dem sie anhaften können müssen, proliferieren und drücken ihre differenzierten zelluläre Phänotyp und Funktion 2-3. In jüngerer Zeit wurde auch festgestellt, dass Zellen nicht nur diese Substrate für die Einhaltung, sondern auch interagieren und unter dem Einfluss dieser Matrixsubstrat (zB extrazelluläre Matrix, ECM) 4. Daher müssen die Zellen und Gerüsten eine gegenseitige Verbindung,dient dazu, Gewebe-Entwicklung, Organisation und ultimative Funktion zu kontrollieren. Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sind mesenchymale, präsentieren nicht-hämatopoetischen Stammzellen im Fettgewebe, die Multi-Linie Differenzierung aufweisen können und dienen als leicht verfügbare Quelle von Zellen (dh vor der vaskulären Endothelzellen und Perizyten). Unsere Hypothese ist, dass aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen zu unterschiedlichen Phänotypen gleichzeitig einfach durch Co-Kultivierung ihnen in zweischichtigen Matrices 1 gerichtet werden kann. Unser Labor ist auf die dermale Wundheilung konzentriert. Zu diesem Zweck haben wir einen einzigen zusammengesetzten Matrix aus den natürlichen Biomaterialien, Fibrin, Kollagen und Chitosan, die die Eigenschaften und Funktionen eines dermo-spezifischen Wundheilung ECM-Umgebung nachahmen kann.

Protocol

1. Isolieren von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) 1, 5

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  1. Isolieren Ratte perirenalen und Nebenhoden Fettgewebe und wäscht mit sterilen gepufferten Salzlösung Hanks-Lösung (HBSS) mit 1% fötalem Rinderserum (FBS), wie zuvor beschrieben 5. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz, die Umsetzung Tierschutzvorschriften und in Übereinstimmung mit den Grundsätzen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
  2. Hackfleisch und das Gewebe zu übertragen 1-2 g in 25 ml HBSS, enthaltend 1% FBS in einen 50-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 500 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Sammeln der frei schwebenden Fettgewebe Schicht und Übertragung bis 125-ml-Erlenmeyerkolben und Behandlung mit 25 ml Collagenase Typ II (200 U / ml) in HBSS für 45 min bei 37 ° C auf einem Schüttler (125 rpm). Entfernen Sie vorsichtig die flüssige Fraktion (unten Öl-und Fettschicht) durch Pipettieren und filtern Sie sie nacheinander durch eine 100 - und um 70 - um Nylon-Mesh-Filter. Zentrifuge das Filtrat bei 500 g für 10 min bei Raumtemperatur, den Überstand aspirieren, und waschen Sie das Pellet zweimal mit 25 ml HBSS.
  4. Zellpellet in 50 ml Wachstumsmedium (MesenPRO RS Basal Medium) mit MesenPRO RS Growth Supplement, Antibiotika-Antimykotika (100 U / ml Penicillin G, 100 ug / ml Streptomycin-Sulfat, und 0,25 pg / ml Amphotericin ergänzt B) und 2 mM L-Glutamin und Pipette Zellen in zwei T75-Flaschen (25 ml / Flasche).
  5. Kultur der ASC in einer 5% CO 2-befeuchteten Inkubator bei 37 ° C (Passage 2-4 ASCs sind für alle Experimente verwendet).

2. Herstellung von Chitosan Microspheres (CSM)

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

    5 hergestellt. Emulgieren einer wässrigen Lösung von Chitosan (6 ml 3% w / v Chitosan in 0,5 M Essigsäure) in einem 100 ml einer Ölphase bestehend aus Sojaöl, n-Octanol (1:2 v / v) und 5 % Sorbitan-Mono-Oleat (Span 80) Emulgator an Overhead (1700 rpm) und magnetischem Rühren (1000 rpm) gleichzeitig in entgegengesetzte Richtungen. Dieser duale Verfahren zum Mischen sorgt dafür, dass Mizellen früh vor der Vernetzung gebildet tritt in Lösung bleiben kann und nicht auf dem Boden absetzen. Darüber hinaus der magnetische Rührstab hilft bei de-Aggregation Chitosan während Mizellenbildung und rigidization.
  1. Das Gemisch wird kontinuierlich gerührt für etwa 1 Stunde, bis eine stabile Wasser-in-Öl-Emulsion erhalten wird. Initiieren ionischen Vernetzung mit der Zugabe von 1,5 ml von 1% w / v Kaliumhydroxid in n-Octanol alle 15 min für 4 h (24 ml Gesamtvolumen)
  2. Trocknen Sie die wiederhergestellten Sphären in einem Vakuumexsikkator und zu analysieren, ohne weitere Verarbeitung. Sie können bestimmen, die durchschnittliche CSM Partikelgröße, Oberfläche pro Milligramm, und das Gerät Rauminhalt mit einem Partikelgrößenanalyse.
  3. Für die folgenden Experimente, waschen Sie die CSM dreimal mit sterilem Wasser, um restliche Salze zu entfernen und zu sterilisieren durch Waschen über Nacht mit 5 ml absolutem Ethanol.

3. Festlegungdie Anzahl der freien Aminogruppen in CSM

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  1. Bestimmen der Anzahl von freien Aminogruppen in CSM nach ionische Vernetzung unter Verwendung des Trinitro Benzolsulfonsäure (TNBS)-Assay der Bubnis und Ofner 6. Inkubiere 5 mg Mikrosphären mit 1 ml 0,5% TNBS-Lösung in einen 50-ml Glasröhrchen für 4 h bei 40 ° C und Hydrolyse unter Zusatz von 3 ml 6 N HCl bei 60 ° C für 2 Stunden.
  2. Kühlen der Proben auf Raumtemperatur abgekühlt und Extrahieren der freien TNBS durch Zugabe von 5 ml entionisiertem Wasser und 10 ml Ethylether.
  3. Warm eine 5-ml-Aliquot der wässrigen Phase auf 40 ° C in einem Wasserbad für 15 min, um das restliche Ether, auf Raumtemperatur abkühlen, verdampft und verdünnt mit 15 ml Wasser.
  4. Die Absorption bei 345 nm mit einem Spektralphotometer mit TNBS Lösung ohne Chitosan als leer und die Chitosan für CSM p verwendetReparatur, um die Gesamtzahl von Aminogruppen zu bestimmen. Schätzen Sie die Anzahl der freien Aminogruppen des CSM in Bezug auf Chitosan.

4. Lädt ASC in CSM

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  1. Äquilibrieren 5 mg sterilisiert CSM aus Abschnitt 2.5 in sterilem HBSS über Nacht, und fügen Sie an eine 8 - um Porengröße Membran Kulturplatte Einsatz (24-Well-Platte).
  2. Nachdem die CSM auf die Membran niedergelassen haben, sorgfältig absaugen HBSS und 300 ul von Wachstumsmedium auf die Innenseite des Einsatzes und 700 ul des Wachstums Medien an der Außenseite des Einsatzes.
  3. Resuspendieren ASC in der entsprechenden Konzentration (1 × 10 4 bis 4 × 10 4) in 200 ul Wachstumsmedium und Saatgut über den CSM in der Kulturschale Einsatz. Das Endvolumen des Mediums innerhalb der Kultur Einsatz, nach dem Aussäen von 500 ul.
  4. Incubaßen die ASC seeded auf CSM für 24 h in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C.

5. Bestimmung des Prozentsatzes ASC Loading und Zelllebensfähigkeit in CSM

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  1. Nach der Inkubation der Pipette ASC-beladenen CSM in ein steriles 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Zellen, die in den Einsatz Membran gewandert sind.
  2. Entfernen Sie die Reste des Mediums und 250 ml frisches Wachstumsmedium in das Röhrchen.
  3. Zu jedem Röhrchen, fügen Sie 25 ul MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid]-Lösung (5 mg / ml) und für 4 h Inkubation in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C
  4. Nach der Inkubation des Mediums zu entfernen, mit 250 ul Dimethylsulfoxid und Wirbel der Mischung für 2-5 min, um die Formazan-Komplex aufzulösen.
  5. Zentrifugieren Sie die CSM bei 2700 gfür 5 min, Pipette aus dem Überstand und bestimmt das Absorptionsmessung bei 570 nm und 630 nm unter Verwendung eines Standard-Platten-Lesegerät, nach Anspruch MTT Herstellerangaben.
  6. Bestimmen Sie die Zellzahl mit den CSM relativ zu den Werten von Zahlen definiert ASC kultiviert, um eine Standardkurve zu entwickeln, erhalten assoziiert.

6. Herstellung und Charakterisierung von ASC-CSM in PEG-Fibringele Embedded

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  1. Polyethylenglykol (PEG) Fibrin (PEG-Fibrin) Hydrogel, das durch Suggs et al 7 durch Lösen des Sukzinimidylglutarat modifiziertes Polyethylenglykol (PEG und 3.400 Da). Mit 4 ml Tris-gepufferter Salzlösung (TBS, pH 7,8) und Filter sterilisiert mit einem 0,22-um-Filter kurz vor dem Start des Experiments. Gelöste PEG ist nur wirksam in dieser Anwendung für die ersten 3-4 Stunden.
  2. Mischen Sie 500 μ l Fibrinogen Lager (40 mg / ml in TBS, pH 7,8) und 250μl von PEG Lager in einem Kulturmedium Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, Inkubation für 20 Minuten in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C Diese Mischung bildet eine molare Konzentration von 1:10, SG-PEG-SG: Fibrinogen.
  3. Nehmen Sie 250 ul ASC-CSM in einer Konzentration von 5 mg CSM, (≈ 2 × 10 4 Zellen) und mit dem PEGylierten Fibrinogen-Lösung.
  4. Unmittelbar 1 ml Thrombin-Lager (25U/mL) und schnell ein-oder zweimal verreiben mit der Pipette. Nach dem Mischen der Thrombin mit dem PEG-Fibrinogen, sofort den Zell-Gel-Mischung in einem 12-Well-Platte und in einem Inkubator mit 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C für 10 min bis zur vollständigen Gelierung zu ermöglichen. Da die Gelierzeit ist schnell, versuchen Sie nicht, und halten Sie die Gel-Lösung innerhalb der Pipettenspitze für mehr als 5 Sekunden. Das PEGylierte Fibrinogen durch Thrombin gespalten und bildet eine PEGylierten Fibrinhydrogel. Als solches the fertigen Gels Produkt wird als PEG-Fibrin bezeichnet.
  5. Waschen der PEG-Fibrin zweimal mit HBSS und Inkubieren mit alpha Minimalmedium (α-MEM) mit 10% FBS in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator ergänzt bei 37 ° C
  6. Beachten Sie die Migration von Zellen von CSM in das Gel über eine 11-Tage-Frist unter Verwendung von Standard-Techniken der Lichtmikroskopie.

7. Herstellung und Charakterisierung von ASC-CSM in Kollagengelen Embedded

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  1. ASC-Mix CSM (5 mg enthalten ≈ 2 × 10 4 Zellen) mit Typ 1-Kollagen (7,5 mg / ml) aus Rattenschwanzsehnen nach dem Verfahren von Bornstein 8 und Fibrillieren nach Einstellen des pH auf 6,8 mit 2N NaOH extrahiert.
  2. Fügen Sie die fibrillierte Kollagen-ASC-CSM-Mischung auf eine 12-Well-Platte pipettieren und 30 min in einem 5% CO 2 FeuchtigkeitsquerproFied Inkubator bei 37 ° C
  3. Nach der vollständigen Kammerflimmern, bebrüten die Kollagen-ASC-CSM-Gele für bis zu 11 Tage in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C.
  4. Beachten Sie die Migration von Zellen von CSM in das Gel über eine 11-Tage-Frist mit Standard-Mikroskopie-Techniken.

8. Entwicklung von zweischichtigen PEG-Fibrin-(ASC-CSM)-Kollagen-Gel-Konstrukte

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  1. Zur Entwicklung der Doppelschicht aufbauen, bereiten sowohl das Kollagen und das PEG-Fibringele wie oben beschrieben, mit leichten Modifikationen. Kurz gesagt, zu studieren die Zug-und Co-Induktion Eigenschaften einer einzelnen Quelle von Stammzellen mit Hilfe von zwei bioscaffolds, "Sandwich" der ASC-CSM zwischen dem Kollagen und den PEG-Fibrin-Gerüste mit einem vierstufigen Prozess: 1) Last-ASC auf CSM, 2) gegossen fibrillierte Kollagen-Gel-Schicht und die ASC-CSM-Perlen über den Collagen Gel, 3) Besetzung PEG-Fibringel über den ASC-CSM-Kollagen-Gel Gel und lassen sich zu verfestigen, und 4) hinzufügen, mittel bis gut und einfügen, um Zellen in vitro zu studieren oder zu entfernen vom Einsatz für in vivo-Anwendungen (siehe Abbildung 1 ).
  2. Bereiten Sie eine 1-ml-Typ-1-Kollagen (7,5 mg / ml) Mischung wie oben unter 7.1 beschrieben, ohne Zusatz von ASC-CSM zur Mischung. Das Gemisch wird in einem 6-Well-Gewebekulturplatten Einsatz (8-um Porengröße) und Inkubation für 30 min in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C
  3. Nach vollständiger Fibrillation, die über der Oberfläche Kollagen 5 mg ASC-CSM (10 000 Zellen / mg) in Kulturmedien (200 ul) suspendiert. Nachdem sich die Mikrosphären über das Gel niedergelassen haben, stellen die PEG-Fibrin-Gel, wie in Abschnitt 6.0 beschrieben, ohne Zugabe von ASC-CSM zu dem Gemisch, und die Schicht des PEGylierten Fibrinogen / Thrombin-Lösung in den ASC-CSM-Kollagenschichten. Bei der Herstellung des PEG-Fibrin-Gel, mit 250 ul Zellkulturmedium anstelle von ter 250 ul Medium mit den Zellen.
  4. Nach Abschluss des inkubieren Konstrukte für 30 Minuten in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator, um eine vollständige Gelierung vor der Einspeisung des Konstrukts mit Kulturmedium zu erreichen.
  5. Nach der vollständigen Gelierung statt 1 ml Medium in der oberen Kammer über das Konstrukt und 3 ml Medium in der unteren Kammer.

9. Machen Stammlösungen

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.

  • Calciumchlorid-Lager (40 mM): Verwenden Sie nur CaCl 2 · 2 H 2 O. Man löst 588,4 mg CaCl 2 · 2H 2 O mit 100 ml deionisiertem Wasser. Sterilisieren mit einem 0,22-um-Filter.
  • Polyethylenglykol: PEG ist hoch reaktiv und können mit Sauerstoff oxidiert werden, wenn die Raumluft ausgesetzt. Als solches sollte PEG unter Stickstoff (N 2)-Atmosphäre gelagert werden. Accurately wiegen 32 mg in einer 2-ml-Zentrifugenröhrchen (vergewissern Sie sich, um die Rohre mit N &sub2;-Spülung vor der Verwendung) und lagern bei -80 ° C bis zur Verwendung. Man löst 32 mg PEG in 4 ml TBS-Lösung vor der Verwendung.
    Die folgenden Lösungen müssen frisch zubereitet werden, bevor ein Experiment.
  • TBS-Lösung: (pH-Wert von 7,75 bis 7,77 bei 25 ° C, pH bei 25 ° C ist sehr kritisch sind). Um 15 ml TBS-Lösung vorbereiten, sorgfältig auflösen ein Puffertablette in sterilfiltriert entionisiertem Wasser und stellen Sie den gewünschten pH-Wert. Lagern Sie die Stammlösung-bereiten es frisch zubereiten.
  • Fibrinogen-Lösung: (40 mg / ml). Man löst Fibrinogen Pulver in TBS, um die Fibrinogen-Konzentration 40 mg / ml zu ergeben. Lösen Sie es über Nacht mit einem Magnetrührer bei 4 ° C Es ist einfacher, die gesamte 1-g-Menge mit der erforderlichen Menge von TBS lösen. Am folgenden Tag, entfernen Sie das Fibrinogen von 4 ° C (in der Regel trübe) und lassen Sie esin einem Wasserbad erwärmt, bis eine homogene Lösung erhalten wird. Schließlich filtern sterilisieren das Fibrinogen mit einem 0,45-um-Filter.
  • Thrombin-Lösung (25 Einheiten / ml): Um die Thrombin-Lösung machen, wiegen Sie die benötigte Menge und lösen sich mit der vorbereiteten 40 mM CaCl 2 .2 H 2 O. Es ist immer eine gute Übung, um die gesamte Flasche mit Thrombin verwenden, um die Lager zu machen. Beispiel: Lösen Sie eine Flasche von 5 kU Thrombin mit 200 mM CaCl 2 · 2H 2 O, aliquotieren und bei -20 ° C.

10. Repräsentative Ergebnisse

Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Technik ist es, das Potenzial der gleichzeitigen Matrix-gesteuerte Differenzierung von ASC in mehrere Phänotypen mit CSM als Transportvehikel zu demonstrieren. Wir zeigen in vitro eine Strategie zur Gewinnung von Stammzellen aus CSM liefern in eine zweischichtige Kollagen-PEG-Fibrin-Gerüst. Charakterisierung von ASC innerhalb dieses Gerüst eingebettet revealed, dass ASC-beladenen CSM kann "eingeklemmt" werden in einer Schicht zwischen der Kollagen-und PEG-Fibrin gleichzeitig und unterschiedlich Cue nehmen von beiden extrazellulären Umgebungen zu unter ihrem neuen Bedingungen gedeihen. Zunächst charakterisiert die Fähigkeit für das Modellsystem, um die Lebensfähigkeit der Zellen und wandernde Kapazitäten aufrecht zu erhalten. Collagen unterstützt die Fähigkeit von ASC, um ihre "Stammzell-Seins", wie es durch ihre Expression von Stro-1 und ihre Fibroblasten-ähnliche Morphologie (Abbildung 2D und 2F) demonstriert aufrecht zu erhalten. Im Gegensatz dazu induzierte PEG-Fibrin die ASC in Richtung einer den Phänotyp zu differenzieren, wie durch die röhrenförmige Struktur Morphologie, die Endothelzell-spezifischen Expression von von Willebrand-Faktor (2E und 2G) und Perizyten-spezifische Expression nachgewiesen wird, NG2 und platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFRβ) (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus können diese beobachteten Phänotypen zu früh in der Kultur auftreten erschienen und wurden mehr als 11 Tage aufrechterhalten, wie es DMonstrated in 3.

Tabellen und Abbildungen

Vorteile der Doppelschicht Konstruieren:

  • Das Gerüst allein ohne Zellen können als bioaktive Schafott führen.
  • PEG-Fibrin induzieren kann Stammzellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren zu unterscheiden.
  • Kollagen kann bei der Aufrechterhaltung der Stammzell-Phänotyp von ASC unterstützen.
  • Ein Doppelschicht-Konstrukt kann als ein aktives Substrat für andere Zelltypen zu migrieren und sich vermehren (z. B., Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, glatten Muskelzellen, Perizyten) verwendet werden.
  • Es kann mit Hard-Tissue Engineering Scaffolds wie hydroxyaptite oder demineralisiertem Knochen verwendet werden, um harte und weiche Gewebe zu regenerieren.
  • Es kann benutzt werden, um eine vielschichtige, vielfältige Tissue-Engineering-Konstrukt (wie Haut-Kreislauf-, Gefäß-Epithel, Haut-Kreislauf-hypodermalen, etc.) zu entwickeln.
  • Es verwendet eine Single-Cell-Quelle, um gleichzeitig zu entwickelnvielzelligen Fächern.
  • Er hat das Potential, mit dem Host Gewebe zu integrieren, da sie aus natürlichen Ursprungs ist.
  • CSM in dem Gel-Konstrukt stellt eine Plattform für Zellen aus migrieren.
  • Chitosan, CSM verwendet, um vorzubereiten, ist ein bekannter aktiver Chemo-Lockstoff.
  • Das Gesamtkonzept in diesem Protokoll "Matrix-angetriebenen Differenzierung der Stammzellen" angewendet werden kann auf andere Stammzellen angewendet werden. Dennoch sind weitere Untersuchung gerechtfertigt, um die Machbarkeit von Matrix-gesteuerte Differenzierung zu bestimmen. Die zweischichtige Gel Gerüst kann als Reservoir, um die Zellen in einer verzögerten und gesteuerten Weise zu liefern handeln.
  • Nach dem Umbau können die Gele noch in einzelne Komponenten getrennt werden.

1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der übergeordnete Ziel und Prozess der Technik. 1) aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) sind loaded auf Chitosan-Mikrokügelchen. 2) Kollagen wird dann in einer 6-Well-Einsatz, der pH-Wert, um das Kollagen zu fibrillieren und des Einsatzes in einer 6-Well-Platte Kammer angeordnet gegossen. Die ASC-beladenen CSM Kugeln werden dann über das Kollagen geschichtet. 3) Das PEGylierte Fibrinogen wird dann über dem Kollagen (ASC-CSM) gegossen und geliert durch die Zugabe von Thrombin. 4) Die endgültige Doppelschicht-Konstrukt kann dann aus dem Kulturmedium Einsatz entfernt werden und für in vitro oder in vivo-Analyse.

2
Abbildung 2. Charakterisierung von ASC innerhalb Kollagen und Fibrin PEG-3D-Matrices kultiviert. A) Phasenkontrast-Mikrofotografie von isolierten ASC passagiert und gepflegt unter Verwendung von Routine 2-dimensionaler Zellkultur-Techniken. Mikroaufnahmen B, D und F zeigen ASC-CSM innerhalb eines 3-dimensionalen Kollagen-Gel kultiviert, während C, E und G Show ASC-CSM innerhalb eines 3-dimensionalen PEG-Fibrin-Gel, sowohl am Tag 1 kultiviert2. In B und C), sind ASCs gezeigt Migration weg von der CSM Kugel in beiden Gerüst-Typen. ASC scheinen eine abgeflachte, spindelförmige Morphologie in Kollagen (B) haben, unter Wahrung ihrer Expression des Stammzell-Marker Stro-1 (D; Pfeil). Wenn in PEG-Fibrin kultiviert ASCs zeigen mehr röhrenförmige Gebilde und induziert werden, um solche vaskulären Zell-Marker wie von Willebrand-Faktor (E) zum Ausdruck bringen. Die Transmissionselektronenmikroskopie ist die typische Morphologie von ASC in jedem Gerüst demonstriert. ASC in Kollagengel anscheinend kleineren Filopodien (fl) sich von dem Körper der Zelle (F), während ASC typischerweise luminalen (mit L bezeichnet) Strukturen gebildet sind, (G; Pfeil).

Abbildung 3
Abbildung 3. Die morphologische Analyse von ASC-CSM zwischen Doppelschichten von Kollagen und PEG-Fibringele. ASC-CSM wurden "eingeklemmt" zwischen Kollagen und PEG-Fibringele und in Kultur gehalten für 11 Tage. Die linke Column zeigt ASC die Migration und Proliferation innerhalb der Kollagenmatrix und scheinen sich an einer Spindel-ähnliche Morphologie zu nehmen. Die rechte Spalte zeigt ASC Migration von der CSM und Bilden röhrenförmige Gebilde in der PEG-Fibrin-Gel.

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Discussion

ASC werden aufgrund ihrer einfachen der Isolierung und die Fähigkeit, gegenüber verschiedenen Zelltypen differenzieren bekannt. Mit den Techniken, die in diesem Manuskript beschrieben, sind wir in der Lage, die Plastizität der ASC, indem diese Zellen auf mehrere Biomatrices gleichzeitig zu nutzen. Wie Zellen wandern weg von ihren CSM Basis und geben sie umgebenden extrazellulären Umgebung, nehmen die Zellen Cue vom Gerüst und kann entweder zu halten "Stammzell-Seins" (Kollagen) oder induziert in Richtung Kreislauf-und Gefäß-unterstützende Zelltypen (Fibrin) zu unterscheiden. Seit unserem Labor in Haut-und Weichteilinfektionen Wundheilung interessiert ist, wir strategisch eine Doppelschicht von Kollagen und Fibrin seit Kollagen unterstützt dermale und epidermale Regeneration durch den Host, während Fibrin natürlich induziert Gefäßnetz Bildung 9 realisiert. Weiterhin ist es nun verstanden, daß ein Übersprechen zwischen proliferierenden humanen Keratinozyten, Fibroblasten und die vaskuläre Netzwerk auftritt, und dieser KomplexMechanismus ist sehr kritisch für die ordnungsgemäße Wundheilung 10. Ohne eine vaskuläre Netzwerk haben, Tissue-Engineering Hauttransplantationen Schwierigkeit inosculating mit Wirtsgewebe. Daher haben, ist unsere Hypothese, dass Kollagen, Fibrin, wenn sie als Doppelschicht ist, in Kombination mit ASC verwendet wird, wird die Wundheilung Mal durch die Verbesserung einer oder mehreren Stufen des Blutgefäßes, dermale und Re-Epithelisierung Verfahren zu verringern.

Fibrin ist ein vielseitiges Biopolymer nach Thrombin-vermittelte Spaltung von Fibrinopeptid A aus monomeren Fibrinogen abgeleitet ausgebildet. Fibrin wurde klinisch als hämostatisches Mittel (zugelassen von der US Food and Drug Administration) und als Dichtstoff in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen, einschließlich der Verfahren wie Weichteil-Präparation verwendet. Fibrin Hydrogele aus kommerziell gereinigt allogenen Fibrinogen und Thrombin sind weit verbreitet in den letzten zehn Jahren in einer Vielzahl von Tissue-Engineering-Anwendungen verwendet. Allerdings sind einige wesentliche Nachteile in mit einem Fibrinhydrogelmaterial können 1) Das Potenzial für das Gerüst zu schrumpfen, 2) eine geringe mechanische Festigkeit, und 3) einen schnellen Abbau vor ordnungsgemäße Ausbildung der Tissue-Engineering-Strukturen sein. Um diese Probleme zu überwinden, muss Fibrin Änderung vor der Verwendung als bessere dreidimensionale Gewebe-Engineering Gerüst dienen werden. Ein solcher Ansatz wird die Copolymerisation des Fibrin mit Polyethylenglykol (PEG-Fibrin). Unsere Vorarbeiten hat einige einzigartige Eigenschaften von PEG-Fibrin, dass es vorteilhaft machen bei der Wundheilung gegenüber anderen Hydrogelverbände, einschließlich unmodifizierten Fibrin demonstriert. PEGylierten-Fibrin zeigt einzigartige Eigenschaften beider synthetischen Hydrogele und natürlichen Materialien. Insbesondere stellt die Anwesenheit von PEG ein stark hydratisierte (> 90% Wasser) feuchte Umgebung für die Verwaltung Ausscheidungen. Zweitens verleiht das Vorhandensein von Fibrin biologische Abbaubarkeit zu dem Material; zeigen jedoch vor, dass Ergebnisse PEGylierten Fibrin wesentlich stabiler als in vitro unPEGylated Fibrin

Die zweite Komponente unserer Doppelschicht ist Kollagen. Kollagen ist ein natürliches Biomaterial ubiquitär exprimiert in Säugetieren und dient als unmittelbare Stelle der Anhaftung für verschiedene Arten von Zellen. Verschiedene Gewebe drücken verschiedene Arten von Kollagen (Typ 1-type29), je nach der Art der funktionellen Notwendigkeit des Gewebes. Andere inhärenten Eigenschaften von Kollagen, die es sehr attraktiv machen in unserem Modell sind, dass 1) sie ist nicht-entzündlichen, 2) beide gesamten abgebaut Komponenten Kollagen sind biokompatibel, 3) es ist ein sehr porösen Hydrogelmedien, 4) unterstützt Zellinfiltration und Migration, 5) unterhält Multipotenz Stammzellen, 6) ist abstimmbaren durch Modulieren Formulierung und 7) es leicht inosculates mit Wirtsgewebe. Für unsere Untersuchungen in Haut-und Weichteil-Regeneration, ist eine Doppelschicht Komposit, bestehend aus Kollagen eine natürliche Wahl, daes ist besonders in der Haut, einschließlich tiefdermaler Bereichen exprimiert, und kann als Marker für die Immunhistochemie Tiefe einer Wunde beurteilt werden.

In diesem Protokoll zeigen wir eine Technik sich gleichzeitig "-Seins" des ASC, während Differenzieren ASC gegenüber verschiedenen vaskulären Zelltypen. Für die Untersuchung der Haut und das darunter Weichgewebe, sind Kollagen-und PEG-Fibrin direkt anwendbar. Aber auch andere Materialien biologisches Gerüst implementiert, um ihre einzigartigen Fähigkeiten erkundet zu studieren, um ASC in andere Zelltypen zu induzieren. Die Technik hilft hier umgesetzt, um die Bedeutung der extrazellulären Matrix bei der Kontrolle der Stammzell-Phänotypen zu markieren, und stützt die Erforschung des geschichteten Verbundwerkstoffen für die Regeneration der Haut.

Zusammenfassung

Kritische Schritte

  • Collagen sollte auf seine richtige isoelektrischen pH-Wert (pH 6,8-7.1) angepasst werden, um Kammerflimmern zu induzieren und erhalten ein stabiles Gel structure.
  • PEG sollte frisch vor dem Mischen mit Fibrinogen-Lösung, da die Haltbarkeit der wässrigen PEG ist kurz (4-5 Stunden) vorbereitet werden.
  • Inkubationszeit von Fibrinogen-PEG-Mischung sollte nicht länger als 25 Minuten (bei 37 ° C), da über-Inkubation kann eine trübe undurchsichtig Niederschläge während der Gelierung führen.
  • Nach der Zugabe von Thrombin auf die PEGylierten Fibrinogen-Lösung sollte die Mischung an Kultur-Einsätze sofort (vorsichtig mischen und danach mit einer Pipette) verzichtet werden. Halten der Lösung Mischung in der Pipettenspitze für eine längere Zeit (> 30 sec) kann eine Gelierung innerhalb der Pipettenspitze und Schwierigkeiten bei der Gewinnung gleichmäßig gegossen Gele.
  • Mit gleichmäßig große Mikrosphären und gleichmäßig verteilten Zellen über die CSM Bett ist entscheidend für die optimale Beladung der Zellen. CSM Größenänderung Durchmesser direkten Einfluss auf verfügbare Oberfläche für die Zellanheftung pro Milligramm von Mikrokügelchen, während gleichmäßig verteilt ASC-CSM direkten Einfluss auf die Zellmigration in ter Gerüsten. Die Zell-beladenen Mikrosphären (ASC-CSM) gleichmäßig auf dem Kollagengel verteilt werden, um auch die Migration von ASC innerhalb des Gerüsts zu gewährleisten. Wenn die Verteilung der ASC-CSM zu dicht ist, wird die Zellwanderung auf einen bestimmten Bereich innerhalb der Gele konzentriert zu bekommen und können Zell-Zell-Interaktion nach der Migration zu begrenzen.
  • Sicherstellen, dass die Volumen an die äußere Vertiefung des Zellkultureinsatzes hinzugefügt höher ist als der Meniskus des inneren gut. Typischerweise wird eine innere: ist der äußere Volumenverhältnis von 1:2 geeignete, da dies die Zellen an die der Mikrokügelchen.

Einschränkungen

  • Dieses Verfahren wird der gesamten Oberfläche auf der Mikrokügelchen beschränkt. Wenn eine höhere Zellzahl gewünscht wird, werden mehr Mikrokügelchen erforderlich, um die Oberfläche zu vergrößern.
  • Da die Zellen dazu bestimmt sind, von Mikrokügelchen, so kann eine Zeitverzögerung für die erste Migration der Zelle auf und in den Gelen beobachtet werden.
  • Die Mikrosphären sind in der Schnittstelle von zwei Gelen (Collagen und PEG-Fibrin), und dies kann zu begrenzen / längere Zeit für die Migration von Zellen zu den distalen Enden der Gele.
  • Beim Bau der Doppelschicht hat PEGylierten Fibrinogen-Thrombin-Gemisch zu schnell über eine CSM-ASC Bett oben auf Kollagen hinzugefügt werden. Dies kann zu ungleichmäßigen Umverteilung der ASC-CSM. Bei unebenen Umverteilung der ASC-CSM an der Grenzfläche in PEG-Fibrin-Gel Gießen kann das Gel Konstrukt langsam gerührt werden, um schnell manuell verteilen die Mikrosphären vor der vollständigen Gelierung.
  • Dieses Verfahren wird für Zellen, die wandernde Eigenschaften aufweisen und kann nicht geeignet, verankerungsunabhängige Zelltypen zu liefern beschränkt.
  • Die Kollagen-Lösung vor Fibrillation noch in saurem pH-Wert und begrenzt die direkte Mischung von Zellen in Kollagengelen. Als solcher, wenn nicht innerhalb eines angemessenen Zeitraums (~ 30 min) eingestellt, kann die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt werden.
  • Seit der gels in diesem Konstrukt verwendet werden einzeln geschichtet, eine mögliche Störung oder Trennung der Gele können während der Handhabung auftreten. Daher kann es der einfachen Handhabung während der in-vivo-Studien zu begrenzen.

Mögliche Änderungen

  • ASC-CSM gleichmäßig innerhalb der einzelnen Gele statt gerafft an der Grenzfläche verteilt werden.
  • ASC kann direkt innerhalb der einzelnen gemischten Gelen anstatt die Bereitstellung von CSM, aber das kann die Entwicklung von hoch organisierten Zell-gemusterte Gewebe Konstrukte zu begrenzen.
  • Um eine ungleichmäßige Umverteilung der ASC-CSM in PEG-Fibrin Abguss zu vermeiden, kann die ASC-CSM in einem kleinen Volumen der wässrigen Chitosan-Lösung (1% w / v) suspendiert und gleichmäßig über Kollagengele verteilt. Dies wird feste Anbringung von ASC-CSM über die Kollagen-Gel-Schicht zu gewährleisten und wird Ausdrehsicherung von ASC-CSM aus dem Kollagen-Oberfläche.
  • Das Konstrukt selbst kann in einer umgekehrten Art und Weise verwendet werden, dh PEG-fibrin Gele können erste gegossen werden und ASC-CSM können Samen sein, oben auf PEG-Fibringele durch Kollagengelen gefolgt. Dies ermöglicht dem Benutzer, das fibrillierte Kollagenlösung über die (ASC-CSM)-PEG-Fibrinschicht vorsichtiger gegossen, da im Gegensatz PEG-Fibrin, fibrillierte Kollagenlösung Verlängerung (30 Minuten) zu verfestigen erfordert. Mit der Annahme dieses Prozesses kann man sicherstellen, um eine gleichmäßige Verteilung der ASC-CSM aufrecht zu erhalten.
  • Die Gele (Kollagen und / oder PEG-Fibrin) mit Mitogene, wie Wachstumsfaktoren (z. B., den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren) aufzunehmen, um eine schnellere Migration und Proliferation zu induzieren.

Fehlerbehebung

  • Während Fibrillation Kollagenlösung, wenn der pH-Wert über dem isoelektrischen pH-Wert von> 7,2, sollte der pH-Wert sein, entweder durch Hinzufügen mehr Kollagen Stammlösung, Absenken des pH unter Verwendung von Lösung einer schwachen Säure neu eingestellt werden.
  • Bei der Erstellung des CSM, wenn eine große Variation in der Größe OCCUrs, dann eine Reihe von Parametern kann eingestellt werden, um gewünschte Größe CSM (Viskosität von Chitosan Stammlösung Volumen von Tensid, Rührgeschwindigkeit usw.) ergeben.
  • Bei langsamer Zellmigration beim Auffüllen der Gele, kann eine größere Anzahl von ASC-CSM verwendet, um die Anzahl der Zellen Migration aus dem CSM in Gele anzukurbeln.
  • Verfahren nach PEG-Fibrinogen Gelierung kann durch Schneiden des Volumens von Thrombin zu dem Gemisch (typischerweise 900 ul anstelle von 1 ml) oder Herstellung einer geringeren Konzentration von Thrombin Lager (20 U / ml anstelle von 25 U / ml) verzögert . Dies ermöglicht langsamere Gelbildung von PEG-Fibrinogen-Gemisch und gibt somit auch mehr Zeit für vorsichtiges Gießen von pegyliertem Fibrinogen und Thrombin Mischung über den ASC-CSM.
  • Während der Inkubation, wenn eine Phasentrennung auftritt (zwischen Collagen und Fibrin-Gel) kann auch ein steriler Teflon O-Ring auf der Oberseite Konstrukt, um sicherzustellen, Befestigung der Gelphasen abgegeben werden.

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Disclosures

Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Lizenzbestimmungen

Die Meinungen oder Aussagen in diesem Dokument sind die privaten Ansichten der Autoren und sind nicht als offizielle oder die Sichtweise des Department of Defense oder die US-Regierung ausgelegt werden. Die Autoren sind Mitarbeiter der US-Regierung, und diese Arbeit wurde im Rahmen ihrer dienstlichen Aufgaben vorbereitet. Alle Arbeiten wurden von der US Army Medical Research und Materiel Command unterstützt. Diese Studie wurde im Rahmen eines Protokolls überprüft und von der US Army Medical Research und Materiel Command Institutional Review Board und in Übereinstimmung mit dem genehmigten Protokoll genehmigt durchgeführt.

Acknowledgments

SN wurde von einem Postdoctoral Fellowship Grant von der Pittsburgh Tissue Engineering Initiative unterstützt. DOZ wird durch einen Zuschuss aus der Genfer Stiftung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

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References

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Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle
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Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

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