Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

הנדסת Hydrogel Bilayered לשלוט בידול ASC

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

פרוטוקול זה מתמקד ניצול היכולת הטמונה בתאי גזע כדי לקחת את המקל מ מטריקס הסובבת אותם תאי ו להיגרם להתמיין פנוטיפים רבים. זה כתב היד שיטות משתרע תיאור שלנו ואפיון של המודל ניצול הידרוג bilayered, המורכבת PEG-הפיברין וכן קולגן, בו זמנית לשתף להבדיל השומן שמקורם בתאי גזע

Abstract

פולימרים טבעיים לאורך השנים זכו חשיבות גדולה יותר בגלל biocompatibility המארח שלהם ואת היכולת לתקשר עם תאים במבחנה in vivo. תחום מחקר זה טומן בחובו הבטחה ברפואה רגנרטיבית הוא השימוש קומבינטורית של biomaterials הרומן ותאי גזע. האסטרטגיה הבסיסית בתחום של הנדסת רקמות הוא השימוש תלת ממדי הפיגום (למשל, decellularized תאי מטריקס, הידרוג, מיקרו / ננו חלקיקים) על בימוי תפקוד התא. טכנולוגיה זו התפתחה מן הגילוי כי תאים צריך המצע שעליו הם יכולים להתאים, מתרבים, ומבטאים פנוטיפ מובחן הסלולר שלהם פונקציה 2-3. לאחרונה, הוכח גם קבע כי התאים לא רק להשתמש אלה מצעים של דבקות, אלא גם לתקשר ולקבל רמזים מן המצע מטריקס (Matrix למשל, תאית, ECM) 4. לכן, התאים ופיגומים יש קשר גומלין זהמשמש לשלוט בפיתוח רקמות, ארגון ותפקוד האולטימטיבי. השומן שמקורם בתאי גזע (ASCs) הם mesenchymal, לא hematopoetic בתאי גזע הנמצאים ברקמות השומן שניתן להציג רב שושלת דיפרנציאציה לשמש מקור וזמין של תאים (כלומר מראש כלי דם endothelia ו pericytes). ההשערה שלנו היא כי השומן שמקורם בתאי גזע יכולה להיות מופנית כלפי פנוטיפים שונים בו זמנית, פשוט על ידי שיתוף culturing אותם מטריצות bilayered 1. המעבדה שלנו מתמקדת בריפוי פצעים עורי. לצורך כך, יצרנו מטריצה ​​מורכב אחד מן biomaterials טבעיים, הפיברין, קולגן, ו chitosan שיכולים לחקות את המאפיינים והפונקציות של הסביבה עורי ספציפי ריפוי הפצע ECM.

Protocol

1. בידוד השומן שמקורם בתאי גזע (ASCs) 1, 5

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. לבודד את השומן עכברוש perirenal ו epididymal ולשטוף עם פתרון שנאגרו האנק של מלח סטרילית (HBSS) המכיל 1% בסרום שור עוברית (FBS) כפי שתואר קודם לכן 5. מחקר זה נערך בהתאם לחוק לרווחת בעלי חיים, רווחה תקנות ליישום בעלי חיים ועל פי עקרונות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
  2. לרכך את הרקמה ולהעביר 1-2 גרם בתוך 25 מ"ל של HBSS המכילים FBS 1% אל תוך צינור 50 מ"ל ו - 500 גרם צנטריפוגות ב 8 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. איסוף הספונטנית רקמת שומן שכבת והעברה Erlenmeyer בקבוק 125 מ"ל, ולטפל עם 25 מ"ל של collagenase מסוג II (200 יח' / מ"ל) ב HBSS 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (125 סל"ד). מוציאים בזהירות את החלק היחסי נוזלי (להלן נפט שכבת השומן) על ידי pipeting ולסנן אותו ברצף עד 100 - מסנן ניילון מיקרומטר רשת - מיקרומטר ו 70. בצנטריפוגה תסנין ב 500 גרם 10 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב supernatant, ולשטוף גלולה פעמיים עם 25 מ"ל של HBSS.
  4. Resuspend תא גלולה ב 50 מ"ל של מדיום הגידול (MesenPRO בינוני RS בסל) השלימו עם תוספת RS צמיחה MesenPRO, אנטיביוטיקה antimycotic (100 U / mL של פניצילין G, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סולפט סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של amphotericin B), ו 2 מ"מ של גלוטמין-L ותאי פיפטה לשתי צלוחיות T75 (25 מ"ל / בקבוק).
  5. תרבות ASC ב 5% 2-CO humidified החממה ב 37 ° C (המעבר 2-4 ASCs משמשים לניסויים בכלל).

2. הכנת Chitosan microspheres (CSMs)

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

    5. Emulsify בתמיסה מימית של chitosan (6 מ"ל של chitosan 3% w / v ב 0.5 M של חומצה אצטית) ל -100 מ"ל של תערובת שמן השלב המורכב שמן סויה, N-octanol (01:02 v / v) ו - 5 sorbitan-מונו oleate% (טווח 80) מתחלב, באמצעות תקורה (1,700 סל"ד) ו בחישה מגנטי (1000 סל"ד) בו זמנית בכיוונים מנוגדים. בשיטה הכפולה של ערבוב מבטיח כי micelles נוצרו בשלב מוקדם לפני cross-linking מתרחשת יכול להישאר פתרון ולא להסתפק לתחתית. יתר על כן, מערבבים המגנטי בר מסייע דה צבירה chitosan במהלך היווצרות micelle ו rigidization.
  1. המהומה עוררה תערובת ברציפות במשך שעה כ 1 עד האמולסיה יציבה מים על שמן מתקבל. ליזום צלב יונית קישור עם תוספת של 1.5 מ"ל של הידרוקסיד W / V 1% אשלגן דקות N-octanol 15 עבור כל 4 שעות (24 בסך הכל מ"ל)
  2. לייבש את התחומים התאוששה תא ייבוש ואקום וניתוח ללא עיבוד נוסף. אתה יכול לקבוע את גודל החלקיקים הממוצע CSM, שטח הפנים מיליגרם, והיקף יחידת מעוקב באמצעות Analyzer גודל החלקיקים.
  3. ניסויים שבאו לאחר מכן, לשטוף את CSM שלוש פעמים עם מים סטריליים כדי להסיר מלחים שיורית לעקר על ידי שטיפה לילה עם 5 מ"ל של אתנול מוחלט.

3. קביעתמספר קבוצות אמינו חופשיות ב CSMs

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. לקבוע את מספר קבוצות אמינו חופשיות הנמצאים CSMs לאחר צלב יונית קישור באמצעות benzenesulfonic trinitro (TNBS) assay של חומצה Bubnis ו Ofner 6. דגירה של 5 מ"ג microspheres עם 1 מ"ל של תמיסת TNBS 0.5% בצינור 50 מ"ל כוס של 4 שעות ב 40 מעלות צלזיוס, hydrolyze עם תוספת של 3 מ"ל של HCl 6N על 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  2. לקרר את דגימות לטמפרטורת החדר ולחלץ את TNBS בחינם על ידי הוספת 5 מ"ל מים deionized ו 10 מ"ל של אתיל אתר.
  3. לחמם aliquot 5 מ"ל של שלב מימית עד 40 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות להתאדות בכל האתר שיורית, מצננים לטמפרטורת החדר, לדלל עם 15 מ"ל מים.
  4. למדוד את ספיגת ב 345 ננומטר עם ספקטרופוטומטר באמצעות פתרון TNBS ללא chitosan כמו ריק chitosan המשמש CSM עמ 'פיצוי על מנת לקבוע את המספר הכולל של קבוצות אמינו. להעריך את מספר קבוצות אמינו חופשיות של CSM ביחס chitosan.

4. טוען ASC ב CSM

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. לאזן 5 מ"ג CSMs מעוקרות של סעיף 2.5 ב HBSS סטריליים לילה ולהוסיף 8 - נקבוביות מיקרומטר בגודל הממברנה התרבות להוסיף צלחת (24 גם צלחת).
  2. לאחר CSMs את התיישבו על הממברנה, בזהירות לשאוב את HBSS ולהוסיף 300 μL של מדיום הגידול הפנימי של הכנס ו 700 μL של התקשורת הצמיחה החיצוני של הכנס.
  3. ASCs Resuspend בריכוז המתאים (1 × 4-04 אוקטובר 10 × 4) 200 μL של המדיום צמיחה זרע על CSM בתוך להוסיף את הצלחת התרבות. היקף הסופי של המדיום תוך הוספה התרבות, לאחר זריעה, הוא 500 μL.
  4. Incubאכלו seeded ASC על CSMs עבור H 24 ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C.

5. קביעת אחוז טוען ASC ו כדאיות התא ב CSMs

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. לאחר מכן, הדגירה CSM pipet ASC טעונים בצינור 1.5-מ"ל סטרילי microcentrifuge מבלי להפריע את התאים אשר היגרו אל קרום הוספה.
  2. להסיר את שאריות בינוני ומוסיפים 250 μL של מדיום הגידול טרי הצינור.
  3. אל צינור זה, להוסיף 25 μL של MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד] פתרון (5 מ"ג / מ"ל) ו - דגירה של 4 שעות ב CO 5% 2 humidified חממה ב 37 ° C.
  4. לאחר הדגירה, הסר בינוני, מוסיפים 250 μL של sulfoxide דימתיל, ואת המערבולת התערובת במשך 2-5 דקות כדי solubilize מורכבת formazan.
  5. בצנטריפוגה CSM על 2700 גרםבמשך 5 דקות, pipet את supernatant ולקבוע ספיגת אורך הגל שלה ב 570 ננומטר ו 630 ננומטר באמצעות קורא צלחת רגילה, על פי מפרט היצרן של MTT.
  6. לקבוע את מספר הסלולרי הקשורים CSMs יחסית לערכים שהתקבלו מוגדרים מספרי עולה בתרבית לפתח עקומת סטנדרטי.

6. הכנה ואפיון של ASC-CSM משובץ ב-PEG הפיברין ג'ל

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. פוליאתילן גליקול (PEG) הפיברין (PEG-הפיברין) הידרוג שהוכן על ידי Suggs ואח' 7 על ידי המסת glutarate succinimidyl פוליאתילן גליקול שונה (PEG, 3400 דה). באמצעות 4 מ"ל של לעקר טריס שנאגרו מלוחים (TBS, pH 7.8) ו פילטר עם מסנן 0.22 מיקרומטר, ממש לפני תחילת הניסוי. PEG מומס יעיל רק יישום זה על 3-4 שעות הראשונות.
  2. מערבבים 500 &MU, אני המניות פיברינוגן (40 מ"ג / מ"ל ב TBS, pH 7.8) ו 250μl מלאי PEG בתרבות גם צלחת 6-גם וגם דגירה של 20 דקות 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C. תערובת זו מהווה יחס ריכוז טוחנת של 1:10, SG-PEG-SG: פיברינוגן.
  3. קח 250 μl של ASC-CSM בריכוז של 5 מ"ג של CSM, (≈ 2 × 10 4 תאים) ומערבבים עם פתרון פיברינוגן pegylated.
  4. מיד להוסיף 1 מ"ל של תרומבין המניות (25U/mL) ובמהירות triturate פעם או פעמיים עם טפטפת. לאחר ערבוב thrombin עם פיברינוגן-PEG, מיד להניח את התערובת תאים ג'ל בצלחת 12-טוב ו מודגרות ב 5% CO 2 באינקובטור humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, כדי לאפשר gelation מלאה. מאז הפעם gelation הוא מהיר, לא ניסו לקיים את הפתרון ג'ל בתוך קצה פיפטה במשך יותר מ 5 שניות. פיברינוגן pegylated הוא ביקע ידי תרומבין ויוצר הידרוג הפיברין pegylated. כמו ה כזה,המוצר הסופי דואר ג'ל המכונה PEG-הפיברין.
  5. לשטוף את PEG-הפיברין ג'ל פעמיים עם HBSS ו דגירה עם התקשורת אלפא חיוניים מינימליים (α-MEM) השלימו עם FBS של 10% 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 מעלות ג
  6. שימו לב נדידת תאים CSM לתוך הג'ל על פני תקופה של 11 יום באמצעות תקן שיטות מיקרוסקופיה אור.

7. הכנה ואפיון של ASC-CSM משובץ ג'ל קולגן

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. מערבבים ASC-CSM (5 מ"ג המכיל ≈ 2 × 10 4 תאים) עם קולגן סוג 1 (7.5 מ"ג / מ"ל) המופק גידים זנב עכברוש לפי השיטה של בורנשטיין 8 ו לרעוד לאחר התאמת נתוני pH 6.8 כדי שימוש 2N NaOH.
  2. מוסיפים את תערובת פירפר קולגן-ASC-CSM לצלחת 12-טוב ו דגירה של 30 דק 'ב 5% 2 CO humidified החממה ב 37 ° C.
  3. לאחר פרפור מלאה, דגירה של קולגן-ASC-CSM ג'ל של עד 11 יום ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C.
  4. שימו לב נדידת תאים CSM לתוך הג'ל על פני תקופה של 11 יום באמצעות שיטות מיקרוסקופיה רגילות.

8. פיתוח Bilayered PEG-הפיברין-(ASC-CSM), בונה קולגן ג'ל

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. לפתח bilayer לבנות, להכין הן את הקולגן ואת PEG-הפיברין ג'ל כפי שתואר לעיל, בשינויים קלים. בקצרה, כדי ללמוד את המאפיינים נודדות ושיתוף אינדוקציה של מקור יחיד בתאי גזע באמצעות שני bioscaffolds, "כריך" ASC-CSMs בין הקולגן ואת PEG-הפיברין פיגומים על ידי שימוש בתהליך ארבעה שלבים: 1) טען ASC על CSM, 2) להטיל ג'ל קולגן פירפר את שכבת ASC-CSM חרוזים על collagen ג'ל, 3) PEG-הפיברין יצוקה ג'ל על ג'ל ASC-CSM-קולגן ולאפשר ג'ל לחזק, ו 4) להוסיף בינוני עד טוב להכניס ללמוד תאים במבחנה או להסיר הוספה של יישומים ב vivo (ראה איור 1 ).
  2. להכין סוג 1-1 מ"ל קולגן (7.5 מ"ג / מ"ל) תערובת כמתואר לעיל 7.1, מבלי להוסיף ASC-CSM לתערובת. מניחים את התערובת להוסיף 6-גם רקמת תרבות (8-מיקרומטר גודל הנקבוביות) ו דגירה של 30 דק 'ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C.
  3. אחר שכבה שלמה פרפור, על פני 5 מ"ג של קולגן ASC-CSM (10, 000 תאים / מ"ג) תלויה בתקשורת תרבות (200 μl). לאחר microspheres התיישבו על ג'ל, להכין ג'ל PEG-הפיברין כאמור בסעיף 6.0, מבלי להוסיף ASC-CSM לתערובת, שכבת פתרון pegylated פיברינוגן / thrombin על ASC-CSM-קולגן שכבות. בעת הכנת ג'ל PEG-הפיברין, השתמש 250 μl של המדיום תרבית תאים במקום tהוא 250 μl של המדיום שבו נמצאים התאים.
  4. לאחר השלמת, דגירה המבנים למשך 30 דקות ב 5% CO 2 באינקובטור humidified להשיג gelation שלם לפני האכילה מבנה בינוני עם התרבות.
  5. לאחר gelation מלאה, מקום 1 מ"ל של מדיום בחדר העליון על מבנה ו 3 מ"ל של מדיום בתא התחתון.

9. ביצוע פתרונות מניות

הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  • סידן כלוריד המניות (40 מ"מ): השתמש רק CaCl 2 0.2 H 2 O. ממיסים 588.4 מ"ג של CaCl 2 0.2 H 2 O עם 100 מ"ל מים deionized. לעקר באמצעות מסנן 0.22-מיקרומטר.
  • פוליאתילן גליקול: PEG הוא תגובתי עם חמצן יכול להיות מחומצן כאשר נחשף לאוויר החדר. ככזה, PEG יש לאחסן מתחת חנקן (N 2) אווירה. ACCurately שוקל 32 מ"ג בצינור 2-ml צנטריפוגות (לוודא לטהר את הצינורות עם N 2 לפני השימוש) ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. להמיס 32 מ"ג של PEG ב 4 מ"ל של תמיסת כפות לפני השימוש.
    הפתרונות הבאים חייב להיות טרי לפני כל ניסוי.
  • כפות פתרון: (pH 7.75-7.77 במהירות של 25 ° C, ה-pH של 25 ° C חיוני מאוד). להכין 15 מ"ל של תמיסת TBS, בזהירות לפזר טבליה אחת למאגר מים, מסנן עיקור deionized ולהתאים את ה-pH הנדרש. אין לאחסן את מלאי פתרון להכין אותו טרי בכל פעם.
  • פתרון פיברינוגן: (40 מ"ג / מ"ל). לפזר אבקת פיברינוגן ב TBS לעשות ריכוז פיברינוגן 40 מ"ג / מ"ל. לפזר אותו בין לילה באמצעות stirrer מגנטי ב 4 ° C. קל יותר לפרק את כל כמות 1-g עם הסכום הנדרש של TBS. למחרת, הסר פיברינוגן מ 4 ° C (בדרך כלל מעונן) ולאפשר לולחמם באמבט מים עד פתרון אחיד מתקבל. לבסוף, לסנן לעקר פיברינוגן באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר.
  • פתרון תרומבין (25 יחידות למ"ל): כדי להפוך את הפתרון תרומבין, לשקול את הסכום הנדרש לפרק 40 מ"מ מוכן CaCl 2 0.2 H 2 O. זה תמיד מומלץ להשתמש בקבוקון שלם של תרומבין לעשות המניות. דוגמה: להמיס בקבוק 5 KU thrombin עם 200 מ"מ של CaCl 2 0.2 H 2 O, aliquot וחנות ב -20 ° C.

10. נציג תוצאות

המטרה הכללית של הטכניקה המוצגת כאן היא להדגים את הפוטנציאל של בידול מטריקס מונחה סימולטני של ASC אל פנוטיפים מרובים באמצעות CSM ככלי משלוח. אנחנו מדגימים אסטרטגיה במבחנה לספק בתאי גזע CSMs אל bilayered קולגן-PEG-הפיברין הפיגום. אפיון ASC מוטבע בתוך זה reveale פיגוםד כי ASC טעונים CSMs ניתן "דחוקה" בין שכבת קולגן PEG-הפיברין בו זמנית באופן דיפרנציאלי את האות משני סביבות תאיים לשגשג בתנאים החדשים. אנחנו הראשונים שאפיינו את היכולת של מערכת מודל לשמור על יכולת הקיום של תאים יכולות הנדידה. קולגן נתמך היכולת של ASCs לשמור על "stemness," שלהם כפי שהודגם על ידי הביטוי שלהם Stro-1 ומורפולוגיה פיברובלסטים כמו שלהם (איור 2 ד ו 2F). לעומת זאת, גרמו PEG-הפיברין את ASCs להבדיל כלפי פנוטיפ כלי הדם, כפי שעולה ידי המורפולוגיה שלהם, מבנה דמוי צינור, תא ספציפי ביטוי האנדותל שלהם גורם Willebrand פון (2E איור ו 2G), ו pericyte ספציפי ביטוי של NG2 ו-derived טסיות גורם הגדילה לקולטן בטא (PDGFRβ) (מידע לא מוצג). יתר על כן, אלו פנוטיפים הנצפות נראה להתרחש בשלב מוקדם של התרבות נשמרו על 11 ימים, כמו demonstrated באיור 3.

טבלאות ומספרים

היתרונות של בניית bilayer:

  • לבד פיגום ללא תאים יכולים לבצע כמו פיגום ביו.
  • PEG-הפיברין יכול לגרום לתאי גזע להבחין ללא תוספת של גורמי גדילה.
  • קולגן יכול לסייע בשמירה על תא גזע הפנוטיפ של ASCs.
  • מבנה bilayer יכול לשמש מצע פעיל סוגי תאים אחרים כדי להעביר מתרבים (למשל לתאי אנדותל, פיברובלסטים, קרטינוציטים, לתאי שריר חלק, pericytes).
  • ניתן להשתמש בו עם רקמה קשה כמו עצם פיגומים הנדסה hydroxyaptite או demineralized כדי לחדש רקמות רך וקשה.
  • זה יכול לשמש לפיתוח רב שכבתית, לבנות רקמות מגוון מהונדסים (כמו עורי, כלי דם, כלי דם, אפיתל, עורי, כלי דם, hypodermal וכו ').
  • היא משתמשת מקור יחיד תאים בו זמנית לפתחמדורים תאיים.
  • יש לו את הפוטנציאל לשלב עם רקמת המארח שכן הוא מקור טבעי.
  • CSM בתוך מבנה ג'ל מספק פלטפורמה עבור תאים לעבור מ.
  • Chitosan, נהגה להכין את CSM, הוא ידוע פעיל הכימותרפיה attractant.
  • הרעיון הכללי ליישם פרוטוקול זה של "בידול מטריקס מונע בתאי גזע" ניתן להחיל סוגי תאים אחרים גזע. עם זאת, מחקר נוסף מתבקשת לקבוע את הכדאיות של בידול מטריקס מונחה. Bilayered ג'ל הפיגום יכול לשמש כמאגר כדי לספק את התאים בצורה מתמשכת ומבוקרת.
  • לאחר השיקום, הג'לים עדיין יכול להפריד למרכיבים בודדים.

איור 1
באיור 1. סכמטי המתאר את המטרה הכללית תהליך של הטכניקה. 1) השומן שמקורם בתאי גזע (ASCs) הם loaded על chitosan microspheres. 2) קולגן הוא שפך לתוך הוספת 6-היטב, pH מותאם לרעוד קולגן, וכן הוספה להציב לתוך חדר 6-גם צלחת. ASC טעונים התחומים CSM בשכבות אז על קולגן. 3) פיברינוגן pegylated ואז הוא שפך על קולגן (ASC-CSM) ו בג'ל על ידי תוספת של תרומבין. 4) מבנה bilayer הסופי לאחר מכן ניתן להסיר את הכנס תרבות להשתמש במבחנה או ניתוח vivo.

איור 2
איור 2. אפיון ASC בתרבית בתוך קולגן PEG-הפיברין מטריצות 3D. א) שלב, לעומת זאת photomicrograph של מבודד ASC passaged ומתוחזק באמצעות שגרת 2 ממדי תרבות טכניקות סלולריים. Photomicrographs B, D, ו-F מתארים ASC-CSM בתרבית בתוך ג'ל 3 מימדי הקולגן, ואילו C, E, ו-G Show ASC-CSM בתרבית בתוך 3 מימדי PEG-הפיברין ג'ל, הן ביום 12. ב B ו-C), ASCs מוצגים נודדות הרחק מתחום CSM בשני סוגי הפיגום. ASCs נראה כי שטוח, ציר כמו המורפולוגיה של קולגן (ב '), תוך שמירה על הביטוי שלהם סמן לתאי גזע Stro-1 (D, חץ). כאשר בתרבית PEG-הפיברין ASCs להפגין יותר מבנים דמויי צינור והם גרמו להביע כאלה סמנים סלולריים כלי דם כגורם Willebrand פון (ה). במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מתאר מורפולוגיה טיפוסית שמפגינים ASCs בתוך כל הפיגום. ASCs ב ג'ל קולגן נראה כי filopodia קטן יותר (פלורידה) המשתרעת הגוף של התא (F), ואילו ASCs נוצר בדרך כלל lumenal (שכותרתו L) מבנים (G; החץ).

איור 3
איור 3. ניתוח מורפולוגי של ASC-CSMs בין bilayers הקולגן PEG-הפיברין ג'לים. ASC-CSMs היו "דחוקה" בין קולגן PEG-הפיברין ג'ל ומתוחזק בתרבות במשך 11 ימים. שמאל column מתאר ASCs נודדות, מתרבים בתוך מטריצת הקולגן ומופיעים לקחת על מורפולוגיה ציר דמוי. העמודה הימנית מתארת ​​ASCs נודדות הרחק CSMs את ויוצרים צינור כמו מבנים ברחבי ג'ל PEG-הפיברין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ASCs ידועים, כדי להקל על הבידוד שלהם היכולת להבדיל כלפי סוגי תאים שונים. עם הטכניקות המתוארות בכתב היד הזה, אנו יכולים לנצל את הגמישות של ASCs ידי חשיפת תאים אלה כדי biomatrices מרובים בו זמנית. כמו תאים נודדים הרחק מבסיס CSM שלהם ולהיכנס סביבתו שלהם תאיים, התאים את הרמז מן הפיגום והוא יכול גם לשמור על "stemness" (קולגן) או להיגרם להבדיל כלפי סוגי תאים של כלי הדם, ועל כלי הדם, הפיברין (תומכת). מאז במעבדה שלנו מעוניינת העור הפצע הרקמות הרכות ריפוי, יישמנו אסטרטגית bilayer של קולגן הפיברין מאז קולגן תומך התחדשות עורי ואת אפידרמיס על ידי המארח, ואילו הפיברין באופן טבעי גורמת להיווצרות רשת כלי דם 9. יתר על כן, הוא הבין כעת כי בין שיחת מתרחשת בין מתרבים קרטינוציטים בעור, פיברובלסטים, ורשת כלי הדם הבסיסי, וזה מורכבהמנגנון הוא קריטי ביותר עבור ריפוי פצעים נכונה 10. ללא רשת כלי הדם הבסיסית, רקמות מהונדסות שתלי עור מתקשים inosculating עם רקמות המארח. לכן, ההנחה הכללית שלנו היא כי קולגן הפיברין, כאשר שימש bilayer בשילוב עם ASCs, יקטין ריפוי הפצע על ידי שיפור זמני אחד או יותר בשלבים של כלי דם, עורי, מחדש epithelialization תהליכים.

הפיברין הוא biopolymer צדדי שנוצר לאחר המחשוף thrombin בתיווך של fibrinopeptide נגזר מן פיברינוגן monomeric. הפיברין נעשה שימוש קליני כסוכן עוצר דמום (שאושר על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני) והן איטום במגוון רחב של יישומים קליניים, כולל הליכים כגון דיסקציה רקמות רכות. הידרוג הפיברין של פיברינוגן allogeneic מטוהרים מסחרית thrombin היה בשימוש נרחב במגוון של רקמות הנדסת יישומים בעשור האחרון. עם זאת, כמה חסרונות גדולים אניn באמצעות הידרוג הפיברין יכול להיות 1) פוטנציאל הפיגום להתכווץ, 2) נוקשות מכנית נמוכה, 3) ירידה מהירה לפני היווצרות התקינה של רקמות מהונדסות מבנים. כדי להתגבר על בעיות אלה, הפיברין צריך להיות שונה לפני השימוש לשמש טוב יותר תלת מימדי רקמות הנדסה הפיגום. גישה אחת כזו copolymerizing הפיברין עם פוליאתילן גליקול (PEG-הפיברין). עבודה ראשונית שלנו הוכיחה כמה תכונות ייחודיות של PEG-הפיברין זה עושה את זה יתרון ריפוי הפצע תחבושות על הידרוג'ל אחרים, כולל הפיברין שלא עברה כל שינוי. Pegylated-הפיברין מציג תכונות ייחודיות של שני הידרוג סינתטיים וחומרים טבעיים. באופן ספציפי, נוכחות של PEG מספק hydrated ביותר (> 90% מים) סביבה לחה לניהול exudates. שנית, קיומם של הפיברין מקנה פריקות ביולוגית לחומר, אולם תוצאות קודמות הראו כי הפיברין pegylated משמעותית יציב יותר מאשר במבחנה הפיברין unPEGylated

המרכיב השני של bilayer שלנו הוא קולגן. קולגן הוא ביולוגי טבעי בכל מקום בגוף לידי ביטוי היונקים ומשמש כאתר ישירה של הקובץ המצורף על סוגים שונים של תאים. רקמות שונות לבטא סוגים שונים של קולגן (סוג 1-type29), בהתאם לסוג של צורך פונקציונלי של רקמות. תכונות הטבועות אחרים של קולגן שהופכים אותו לאטרקטיבי ביותר במודל שלנו הן כי 1) היא לא דלקתית, 2) שני רכיבים שלמים מושפל של קולגן הם ביולוגית, 3) הוא הידרוג'ל נקבובי ביותר, 4) הוא תומך חדירה לתא והגירה, 5) היא שומרת multipotency בתאי גזע, 6) הוא מתכונן על ידי ניסוח ויסות, ו 7) זה בקלות inosculates עם רקמות המארח. ללימודים שלנו התחדשות העור ורקמות רכות, מורכב bilayer בהיקף של קולגן הוא בחירה טבעית שכןזה בא לידי ביטוי ביותר ברחבי העור, כולל אזורים עורי עמוק, והוא יכול לשמש כסמן אימונוהיסטוכימיה כדי להעריך את עומק הפצע.

בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את הטכניקה בו זמנית לשמור על "stemness" של ASCs תוך הבחנה ASCs כלפי סוגי תאים שונים של כלי הדם. לצורך המחקר של העור ורקמות רכות הבסיס שלה, קולגן PEG-הפיברין חלים באופן ישיר. עם זאת, חומרים אחרים bioscaffold יכול להיות מיושם כדי ללמוד את היכולות הייחודיות שלהם לחקור כדי לגרום ASC לתוך תאים מסוגים אחרים. הטכניקה מיושמת כאן עוזר להדגיש את החשיבות של מטריקס תאיים בשליטה סלולריים פנוטיפים גזע מעניק אמינות חקירה של חומרים מרוכבים שכבתיים להתחדשות העור.

תקציר

שלבים קריטיים

  • קולגן יש להתאים את ה-pH איזואלקטרית הנכון (pH6.8-7.1) כדי לגרום פרפור ולקבל str ג'ל יציבucture.
  • PEG יש להכין טרי לפני ערבוב עם פתרון פיברינוגן מאז את חיי המדף של PEG מימית הוא קצר (4-5 שעות).
  • זמן הדגירה של תערובת פיברינוגן-PEG לא יעלה על 25 דקות (ב 37 ° C) מאז יתר הדגירה עלול לגרום למשקעים אטום עכור במהלך gelation.
  • לאחר הוספת thrombin לפתרון פיברינוגן pegylated, התערובת יש לוותר על התרבות מוסיף מיד (לאחר ערבוב עדין עם טפטפת). מחזיק את התערובת פתרון קצה פיפטה זמן רב יותר (> 30 שניות) עלול לגרום gelation בתוך קצה פיפטה וקושי בהשגת ג'ל זרמו באופן שווה.
  • באמצעות תאים בגודל אחיד microspheres ומופץ באופן שווה על פני המיטה CSM הוא קריטי טוען התא האופטימלית. גודל CSM וריאציה בקוטר משפיע ישירות על שטח זמין עבור הקובץ המצורף תא מיליגרם של microspheres, בעוד יחולקו בצורה שווה ASC-CSM משפיע ישירות על נדידת תאים לתוך tהוא הפיגומים. התא טעון microspheres (ASC-CSM) צריך להיות מופץ באופן שווה על גבי ג'ל קולגן כדי להבטיח גם הגירה של ASCs בתוך הפיגום. אם חלוקת ASC-CSMs היא צפופה מדי, הגירה התא יקבל מרוכזים לאזור מסוים בתוך הג'לים ועלול להגביל תאים תאים אינטראקציה שלאחר ההגירה.
  • ודא את נפח התקשורת הוסיף גם החיצוני של הוספת תרבית תאים גבוהה יותר של המניסקוס הפנימי גם כן. בדרך כלל, פנימי: יחס חיצוני בנפח של 1:02 מתאים, שכן הדבר מאפשר היצמדות תאים microspheres.

מגבלות

  • שיטה זו מוגבלת שטח הפנים הכולל הזמין microspheres. אם מספר תאים גבוה יותר הוא הרצוי, microspheres יותר נדרשים להגדיל את שטח הפנים.
  • מאז התאים נועדו לעבור מ microspheres, פסק זמן בפיגור אפשר לראות את המעבר הראשוני של התא על גבי ובתוך הג'לים.
  • Microspheres הם בממשק של שתי ג'לים (קולגן PEG-הפיברין), וזה עלול להגביל / לקחת זמן רב יותר על ההגירה של התאים אל הקצוות המרוחקים של הג'לים.
  • במהלך בניית bilayer, תערובת pegylated פיברינוגן-thrombin יש להוסיף במהירות מעל המיטה CSM-ASC על גבי קולגן. דבר זה עלול לגרום אחידה מחדש חלוקת ASC-CSMs. במקרה של חלוקה מחדש אחידה של ASC-CSMs בממשק במהלך PEG-הפיברין ג'ל הליהוק, לבנות את הג'ל ניתן נסער לאט באופן ידני כדי להפיץ במהירות microspheres לפני gelation מלאה.
  • שיטה זו מוגבלת תאים בעלי תכונות נודדות ואין מתאים כדי לספק סוגים עגינה תאים עצמאיים.
  • פתרון קולגן לפני פרפור נשאר pH חומצי ומגביל את תערובת ישירה של תאים בתוך ג'ל קולגן. לפיכך, אם לא מותאם בתוך פרק זמן סביר (~ 30 דקות), כדאיות התא עלול להיות בסכנה.
  • מאז gאלס המשמשים מבנה זה הם שכבות בנפרד, שיבוש אפשרי או הפרדה של הג'לים עלולה להתרחש במהלך טיפול בתהליך. לכן, זה עלול להגביל את הקלות בטיפול במהלך במחקרים vivo.

שינויים אפשריים

  • ASC-CSMs יכול להיות מופץ באופן שווה בתוך ג'ל בודדים במקום בשכבות אותם על הממשק.
  • ASCs יכול להיות מעורב ישירות בתוך ג'ל בודדים ולא על ידי מתן CSM, אבל זה עלול להגביל את ההתפתחות של תאים המאורגנים ביותר בדוגמת בונה רקמות.
  • כדי למנוע אחיד מחדש חלוקת ASC-CSMs במהלך PEG-הפיברין הליהוק, ASC-CSMs עשוי להיות מושעה בנפח קטן של פתרון chitosan מימית (1% w / v) ומופץ באופן שווה על פני ג'ל קולגן. פעולה זו תבטיח מצורף של חברת ASC למוצרי CSMs על גבי שכבת ג'ל קולגן ימנע פירוק של ASC-CSMs מפני השטח קולגן.
  • המבנה כשלעצמו יכול להיות מנוצל בצורה הפוכה, כלומר, PEG-fג'ל ibrin ניתן להטיל 1 ו-ASC CSMs יכול להיות זרע על גבי PEG-הפיברין ג'ל ואחריו ג'ל קולגן. פעולה זו מאפשרת למשתמש להטיל את הפתרון על גבי שכבת קולגן פירפר (ASC-CSM)-PEG-הפיברין ביתר זהירות שכן, שלא כמו PEG-הפיברין ג'לים, הפתרון קולגן פירפר דורש זמן נוסף (30 דקות) כדי לחזק. על ידי אימוץ התהליך הזה אפשר להבטיח לשמור גם חלוקת ASC-CSM.
  • הג'לים (קולגן ו / או PEG-הפיברין ג'ל) יכול להיות משולב עם mitogens, כמו גורמי גידול (למשל, גידול כלי דם גורם אנדותל, גורמי גדילה פיברובלסטים), כדי לגרום נדידת תאים מהר יותר התפוצה.

פתרון בעיות

  • במהלך פרפור של פתרון קולגן, אם ה-pH עולה על ה-pH של איזואלקטרית> 7.2, pH צריך להיות וסידרה או על ידי הוספת עוד מניות פתרון קולגן, ובכך מפחית את החומציות באמצעות פתרון חומצה חלשה.
  • בעת הכנת CSM, אם שונות רבה בגודל occuRS, אז כמה פרמטרים ניתן לשנות את גודל להניב CSM הרצוי (צמיגות של פתרון המניות chitosan, נפח של פעילי שטח, מהירות ערבוב וכו ').
  • במקרה של נדידת תאים איטי כאשר אכלוס בג'לים, מספר גבוה יותר של ASC-CSMs ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר התאים נודדים אל מחוץ CSM לתוך ג'ל.
  • תהליך gelation PEG-פיברינוגן יכול להיות מפגר ידי חיתוך נפח thrombin הוסיף לתערובת (בדרך כלל 900 μL במקום 1 מ"ל), או להכין מלאי ריכוז נמוך של תרומבין (20 יח' / מ"ל, במקום 25 יח' / מ"ל) . זה מאפשר gelation איטי יותר של תערובת PEG-פיברינוגן ולכן נותן זמן נוסף על הליהוק זהירה של פיברינוגן-pegylated תערובת thrombin על ASC-CSMs.
  • במהלך הדגירה, אם מתרחשת הפרדת פאזות (בין קולגן הפיברין ג'ל), טבעת 'O' סטרילי טפלון ניתן למקם על מבנה הדף על מנת להבטיח לחיזוק שלבי ג'ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים.

הבהרה

חוות הדעת או וטיעונים הכלולות במסמך זה הן את הדעות הפרטיות של הכותבים ואינם להתפרש הרשמי או משקף את הדעות של משרד הביטחון או ממשלת ארה"ב. הכותבים הם עובדי ממשלת ארה"ב, ואת העבודה הזאת הוכנה במסגרת תפקידיהם הרשמיים. כל עבודה נתמך על ידי הצבא האמריקני למחקר רפואי ו פיקוד אמצעי. המחקר נערך תחת פרוטוקול נבדקה ואושרה על ידי הצבא האמריקני למחקר רפואי ו פיקוד אמצעי ביקורת מוסדי ראשי ועל פי פרוטוקול שאושר.

Acknowledgments

SN נתמך על ידי מענק מלגה דוקטורים מן היוזמה הנדסת רקמות פיטסבורג. Doz נתמך על ידי מענק הוענק מטעם קרן ז'נבה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
הנדסת Hydrogel Bilayered לשלוט בידול ASC
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter