Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

doi: 10.3791/3954 Published: May 20, 2012

Summary

מאמר זה מתאר מודל פשוט של גירוי אנגיוגנזה ב לפדר את העכברוש. המודל מייצר עליות דרמטיות באזור נימי, מצמיח כלי דם וצפיפות כלי הדם במשך זמן קצר יחסית ברקמות המאפשר en להדמיה פני רשתות שלמות כלי הדם עד לרמה תא בודד.

Abstract

הצמיחה לרשת שיפוץ Microvacular והם היבטים קריטיים של ריפוי פצעים, דלקות, רטינופתיה סוכרתית, הגידול ותנאי מחלות אחרות 1, 2. הצמיחה לרשת מיוחסת בדרך כלל אנגיוגנזה, כהגדרתו צמיחה של כלי דם חדשים מתוך קיימים כלי. תהליך angiogenic הוא גם מקושר ישירות אל arteriogenesis, כהגדרתו רכישת נימי של ציפוי תא perivascular והגדלת כלי. למותר לציין, אנגיוגנזה הוא מורכב ומעורבים בו מספר שחקנים ברמה תאית ומולקולרית 3. ההבנה כיצד רשת כלי הדם גדל דורש לזהות את הדינמיקה במרחב ובזמן, יחד היררכיה של הרשת במהלך תקופה של אנגיוגנזה. מידע זה הוא קריטי להתפתחות של טיפולים שמטרתם מניפולציה צמיחה כלי.

המודל החצנה המתוארת במאמר זה מהווה מודל פשוט, לשחזור של stimulating אנגיוגנזה ב לפדר את העכברוש. זה הותאם מפצע ריפוי מודלים בחולדה לפדר 4-7, והוא אלטרנטיבה לעורר אנגיוגנזה ב לפדר באמצעות זריקות IP של Pro-angiogenic סוכני 8, 9. המודל החצנה הוא אטרקטיבי כי זה דורש התערבות כירורגית מינימלית ומפיק דרמטיים, עולה ב לשחזור נבטים נימי, אזור כלי הדם וצפיפות כלי הדם במשך זמן קצר יחסית ברקמות המאפשר הדמיה דו ממדית של רשתות שלמות כלי הדם עד יחיד התא ברמה. הגידול משקף מגורה תגובות angiogenic טבעיים בסביבה ללא הפרעה פיזיולוגית של מולקולות angiogenic זרים. באמצעות שיטות תיוג immunohistochemical, מודל זה הוכח מאוד שימושי בזיהוי אירועים הסלולר הרומן המעורבים אנגיוגנזה. החוקרים יכולים בקלות לתאם את המדדים angiogenic במהלך תקופה של שיפוצים עם הזמן specific Dynamics, כגון שינויים פנוטיפי סלולריים או אינטראקציות הסלולר 4, 5, 7, 10, 11.

Protocol

1. הגדרת ניתוח הערות

  1. לפני הניתוח לעקר ציוד ומכשירים כירורגיים. חומרים מתכלים המשמשים ההליך הכירורגי הסטרילי של עכברוש אחד כוללים 1 וילון להיות layed בתור משטח סטרילי עבור מיקום של מכשירים, אחד עם חור וילון מראש לחתוך כ -0.5 x 1.5 בשנת במרכז כדי להיות ממוקם על עכברוש , ו גזה. חור חתוך מראש על וילון יהיה ליישר עם החתך נעשה על עכברים. הכלים הדרושים לניתוח כולל 1 זוג מספריים רמת לשמש לחתוך חומרים לתפירה, שני מלקחיים ואת בעל מחט בסדר לטיפול ותופס של תפר, ואת אזמל עם להב. יצרנו עבורכם רשימה הכלים הנפוצים בשימוש במעבדה שלנו בטבלה של חומרים כירורגית כלים ספציפיים. עם זאת, בחירת הכלי הסופי תלוי בהעדפות הנסיין.
  2. להכין את שטח הניתוח. מניחים 100 מ"ל 0.9% שקית מלח סטרילית תחת כרית חימום על מנת להבטיח כי מי מלח כי בא במגע Wרקמת ith לפדר הוא מראש לחמם כ 37 ° C. כחלופה מלוחים, ניתן להשתמש בתמיסת רינגר או אחרת חיץ פיזיולוגית. פריסת מכשירי ניתוח מעוקרות ואספקה ​​על וילון סטרילי עבור גישה נוחה במהלך ההליך החצנה. כמו כן, תצטרך סטריליים עצה כותנה applicators ואת המתאימים 3 סוגי תפרים (4-0, 5-0, ו 7-0). עושה חבילות בטוח הם מראש נפתחה כך את החומרים ניתן לגשת עם טיפול סטרילי. לבסוף, לחטא את שלב טרום שונה פלסטיק ידי טבילה אותו אתנול 100% במשך לפחות 5 דקות. הבמה היא 100 מ"מ צלחת פטרי עם חור אליפטי לחתוך במרכז (איור 1). כלי Dremel ניתן בתחילה לעשות, ואם יש צורך, להרחיב את החור. לאחר חור הוא עשה, בקצוות של פלסטיק חתך עשויים חלקה באמצעות נייר של גרגרי חול שונים. בשלב נשטף אז, סוף סוף, חימר או דוגמנות אינרטי (שנרכש בחנות אמנות מקומית) או silicעל דבק נוסף אל שפת הבור על מנת לספק הרים, משטח חלק. לפני מגע עם רקמות, שלב יהיה צורך לשטוף כראוי עם תמיסת מלח סטרילית.
  3. עבור דגם זה של אנגיוגנזה, אנו משתמשים בדרך כלל חולדות זכרים בוגרים Wistar (350 ± 25 גרם). זני עכברים אחרים והגילאים ניתן להשתמש. במעבדה שלנו, חולדות הן בהרדמה באמצעות זריקה תוך שרירית עם קטמין (80 מ"ג / ק"ג BW), xylazine (8 מ"ג / ק"ג BW), וכן אטרופין (0.08 מ"ג / ק"ג BW). לאחר כ 5 דקות, השפעת ההרדמה הוא אישר עור הבטן של חולדה מגולח.

2. לפדר עכברוש החצנה דגם

  1. מקם את החולדה הרדים על גבו על כרית חימום לשמירה על חום גופם. טכניקות אספטיים משמשים במהלך ההליך הכירורגי. ללבוש כפפות סטריליות ואינם מאפשרים מכשירים וציוד ליצור קשר לא סטריליים משטחים שאינם הרקמות חולדה.
  2. נקו את אזור הבטן עם מגבונים לסירוגין USIng גזה סטרילית ספוגה איזופרופיל 70% ויוד.
  3. באמצעות להב סכין המנתחים, לעשות חתך קטן (כ 0.75 אינץ') אורך לאורך העור ואז Linea alba כ 1 ס"מ מתחת עצם החזה.
  4. מניחים את וילון מראש על קיצוץ בסעיף הבטן, כך פתח מתיישר עם החתך.
  5. להפעיל לחץ בעדינות סביב החתך. בדרך כלל זה יהיה לגרום לחשיפה של המעי הדק מספיק כדי להיות מזוהה בקלות.
  6. באמצעות קצה applicators כותנה, משוך בעדינות את החלק של המעי הדק ולאתר מעי. כמו לפדר הוא שלף, יש layed בעדינות החוצה בשלב פלסטיק (איור 2).
  7. זהה 6-8 חלונות vascularized mesenteric. חלון mesenteric מוגדר קרום שקוף דק בין העורקים / ורידים זוגות המזינים את המעי הדק (איור 2).
  8. רשום את שעת ההתחלה של החצנה. השאירו את mesenteר"י סעיף exteriorized במשך 20 דקות. בתקופה החצנה, השתמש במזרק סטרילי (5 מ"ל) כדי לחדש לסירוגין מלוחים בצלחת פטרי כדי להבטיח רקמות נשאר שקוע ולא להתייבש.
  9. במהלך תקופה של 20 דקות חשיפה, סמן את 2 חלונות mesenteric במיקום מרכזי עם תפר 7-0 סטרילית. הסימנים צריכה להיעשות באזור שומן ליד המעי.
  10. להחזיר את האזור exteriorized של לפדר את חלל הבטן.
  11. סגור את שרירי הבטן עם תפר 5-0 monofilament בתבנית קטע.
  12. סגור את העור עם תפר monofilament 4-0 בתבנית קטע.
  13. לנגב את השטח לצורך איחוי עם מגבונים לסירוגין באמצעות גזה סטרילית ספוגה isopropoyl 70% ויוד.
  14. מורחים ג'ל סיכה עין על שתי העיניים של עכברוש. מטרת סיכה העין היא למנוע התייבשות של הקרנית במהלך הליך ההחלמה כירורגית. יישום של חומר סיכה עין יש להחיללפני תחילת התערבות כירורגית. במידת הצורך, להירשם מחדש חומר סיכה בעין לפני החזרת חולדה לכלוב שלה עבור התאוששות.

3. רקמת קציר קיבוע

  1. ביום גירוי לתגובה עניין, להרדים ו להרדים חולדה. במעבדה שלנו, חולדות הן בהרדמה באמצעות זריקה תוך שרירית עם קטמין (80 מ"ג / ק"ג BW), xylazine (8 מ"ג / ק"ג BW), וכן אטרופין (0.8 מ"ג / ק"ג BW) ואז מורדמים באמצעות הזרקת intracardiac של beuthanasia. Beuthanasia הוא פתרון pentobarbital נתרן / פניטואין, שניתן להשתמש בהם על המתת חסד מהיר ונטול כאבים. לכל העכברים במעבדה שלנו בדרך כלל מזריק 0.1-0.2 מ"ל.
  2. לפתוח מחדש את חלל הבטן בעדינות להסיר את המעי הדק ולאתר את שני החלונות מסומנים.
  3. לחתוך את כל החלונות mesenteric exteriorized באמצעות מלקחיים ומיקרו מספריים. כולל הגבול של חלון לכל שומן יש יתרון על רקמות לאחר מכן מתפשט על שקופיות מיקרוסקופ. מיד, לטבול כל חלון PBS. כאשר חיתוך, מנסים להימנע חיתוך דרך העורק / וריד זוגות בתוך הגבול השומן של Windows כדי למזער את הדם ממלא את הפוטנציאל של Windows. כמו כן, למזער חיתוך דרך המעי כי התוצאות תוכן המעי ליצור קשר עם Windows.
  4. להשתמש במלקחיים כדי להפיץ רקמות על שקופיות מיקרוסקופ בעלי מטען חשמלי חיובי. שתי רקמות יכול להיות מותקן בכל שקופית.
  5. אפשר הרקמות באופן חלקי יבש באמצעות להב סכין המנתחים להסיר את עודפי השומן.
  6. רקמות מוכנים כעת להיות קבוע. שיטות קיבוע אופייניות ניתן להשתמש. במעבדה שלנו, אנחנו בדרך כלל לתקן את השקופיות של מתנול (-20 ° C) למשך 30 דקות. תיוג מוצלח יש גם הופיע עם רקמות יתבטל. שיטות קיבוע יכול לסמוך על הנוגדן המועדף עליך.

4. רקמת Immunolabeling

  1. רקמות יכול עכשיו להיות מתויג בדרך כלל בהתאם להוראות לכל נוגדן עבור אימונוהיסטוכימיה. לאור העניין שלנו לזהות את התפקידיםpericytes של כלי דם במהלך אנגיוגנזה, במעבדה שלנו בדרך כלל תוויות עבור לתאי אנדותל ו perivascular 10, 12, 13. תוויות שימושיים כדי לזהות תאים האנדותל לאורך ההיררכיה של רשתות כלי הדם הם נוגדנים נגד PECAM או BSI-lectin. סמנים סלולריים Perivascular בשימוש ברקמות זו כוללים NG2, desmin, SM-α אקטין, PDFGRβ, ומעמד III-β טובולין. בהמשך, בסעיף 3.3, יש לנו ברשימה פרוטוקולים פרוטוקולי immunolabeling colorimetric ו ניאון PECAM.
  2. לפני הדגירה הנוגדן הראשוני הראשוני, שקופיות הם מיובש שואב להסיר את הפתרון למאגר עודף. כמו כן, רקמות מתוארים תחילה בעט שעווה כדי למנוע זרימה בלתי מבוקרת של פתרונות נוגדנים מן הרקמה. לבסוף, כל הצעדים תיוג מלוות צעדים כביסה. לשטיפת מדרגות, מגלשות ממוקמים בתוך צנצנות צביעה. פתרון חיץ הוא החליף 3 פעמים במהלך תקופת הרחצה.
  3. אנדותל נוגדנים סלולריים תיוג הליכים: <p = "jove_step" המעמד> PECAM Colorimetric Lableing

    1. הנוגדן העיקרי הדגירה: לטפטף כ 100-200 מ"ל נוגדן ראשוני פתרון (1:200 חד שבטי נוגדן עכבר biotinylated CD31 בדילול במאגר נוגדנים (0.1% ב Saponin PBS BSA + 2%)) על גבי כל לרקמות; לוודא את הרקמה כולה מכוסה פתרון נוגדנים. הדגירה של 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
    3. הדגירה נוגדנים משני: נוגדנים משני בטפטוף פתרון (VECTASTAIN עלית פתרון ABC וקטור מעבדות; peroxidase משני streptavidin פתרון נוגדנים) על גבי הרקמות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
    4. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
    5. דגירה רקמות עם וקטור נובה האדום במשך 15 דקות. ואז לעלות רקמות עם מים.
    6. הר שקופיות: טובלים שקופיות אתנול 95% 10 פעמים. לטבול מחליק באתנול 100% למשך 2 דקות. שקופיות לטבול באתנול עוד 100% כדיlution במשך 2 דקות. ואז לטבול שקופיות ב רצופים פתרונות קסילן 100% 2 דקות כל אחד. אפשר לייבש ולכסות הרקמות בשכבה דקה של VectaMount ו coverslip.

    PECAM תיוג פלורסנט

    1. הנוגדן העיקרי הדגירה: לטפטף כ 100-200 מ"ל נוגדן ראשוני פתרון (1:200 חד שבטי נוגדן עכבר biotinylated CD31 בדילול במאגר נוגדנים (0.1% ב Saponin PBS BSA + 2%)) על גבי כל לרקמות; לוודא את הרקמה כולה מכוסה פתרון נוגדנים. הדגירה של 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
    3. הדגירה נוגדנים משני:. נוגדנים משני בטפטוף פתרון ((1:100 streptavidin-CY3 בדילול במאגר נוגדנים (0.1% ב Saponin PBS BSA + 2%)) על גבי הרקמות דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
    4. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
    5. הר שקופיות: לטפטף 50:50 PBS עם גליצרול על גבי הרקמות. לכסותעם תלוש כיסוי. לאחר מכן, השתמש לק כדי לאטום את הפער בין שער תלוש ולהחליק.

5. נציג תוצאות

תמונות מייצגות של לפדר רקמות חולדה שכותרתו immunohistochemically עבור PECAM מוצגים באיור 3. PECAM תיוג מזהה את כל סוגי כלי לאורך ההיררכיה של שיפוץ רשתות כלי הדם והוא יכול לשמש לכמת מדדים angiogenic על גירוי נקודות ספציפיות זמן ההודעה. PECAM תיוג גם מאפשר קביעת arterioles לעומת venules. Arterioles האכלה בדרך כלל מציגים בקטרים ​​קטנים יותר מאורך מורפולוגיה תא האנדותל בהשוואה venules לזווג (איור 4). נימים נבטים נימי ניתן לזהות על פי קוטר כלי שלהם ואת המיקום היחסי בתוך הרשת. מאפיינים טיפוסיים של רשתות שיפוץ כולל עלייה נימי הנבטה, צפיפות כלי שיט, אזור vascularized ו tortuos venularity. כימות מדדים angiogenic שונים מזהה את מהלך הזמן של צמיחה רשת (תרשים 5). נימי צומח קיימים כלי, פסגות בין יום 3 יום ו 5 ו חוזר לרמת unstimulated של 10 יום. עלייה זו חולפת על הנבטה מלווה עלייה בצפיפות כלי הדם באזור vascularized. כראיה על עיצובו מחדש של כלי גדול יותר במודל זה, מספר מגזרים עורקיק ו ורדיד גם מעלה במהלך הזמן.

במעבדה שלנו, מודל זה נעשה שימוש כדי לזהות שינויים פנוטיפי הסלולר בנקודת זמן מסוימת במהלך תהליך זה שיפוץ 10, 11. כך, למשל, בכיתה ג'β-טובולין מזהה pericytes לאורך כלי angiogenic (איור 6). ברקמות unstimulated, מעמד III-β טובולין ביטוי ספציפי העצב. לעומת זאת, בתקופת השיא של נימי הנבטה, בכיתה III-β טובולין באה לידי ביטוי על ידי תאים perivascular. סוג זההתוצאה מדגישה את השימוש במודל זה angiogenic פשוט חזקים כדי לזהות סוגי תאים חדשים המעורבים בתהליך angiogenic.

איור 1
באיור 1. תמונות של שלב פלסטיק לפני ואחרי-שינוי. בשלב שלפני שונה הוא מאכל 100 מ"מ פטרי. השינויים כוללים קיצוץ חור אליפטי במרכז, בנוסף הבאות של פלסטלינה או דבק סיליקון אל שפת הבור ליצירת פני השטח, העלה חלק. משטח זה מספק גבול פנימי המאפשר superfusion של Windows mesenteric exteriorized. סרגל קנה מידה הוא 1 ס"מ.

איור 2
איור 2. תמונה של האזור mesenteric exteriorized. חלונות Mesenteric מוגדרים ממברנות שקופים דקים בין העורקים / ורידים זוגות המזינים את המעי הדק. במהלך החצנהמשך הזמן, באזור mesenteric מונח החוצה שקוע בתוך מי מלח בתוך צלחת פטרי שונה. מודלים אינרטי חימר צהוב מספק משטח חלק של לפדר להימשך דרך חור חתוך מראש. סרגל קנה מידה הוא 1 ס"מ.

איור 3
איור 3. תמונות נציג של רשתות כלי הדם mesenteric מרקמות ורקמות unstimulated ב 3 ו 10 ימים החצנה תפקיד לפדר. PECAM תיוג לזהות את ההיררכיה של רשתות כלי הדם, כולל, arterioles (א '), venules (V) נימים (C). גירוי פוסט, רשת כלי הדם מוצגת עלייה הנבטה נימי (ראשי חץ) וצפיפות כלי. סרגל קנה מידה היא 100 מיקרומטר.

איור 4
באיור 4. נציג תמונות של עורקיק / זוגות ורדיד בתוך mesenteric למבוגרים רשת כלי הדם עכברושs. בתמונות שני, arterioles (א ') ניתן להבדיל בין venules (V) על בסיס בקוטר יחסית קטן יותר מאורך התא מורפולוגיה האנדותל. ברים הם בקנה מידה 20 מיקרומטר.

איור 5
איור 5. כימות נציג מדדים angiogenic במהלך השעה שלאחר כלי הדם החצנה הצמיחה לפדר. א) שטח כלי דם ליחידת שטח הרקמה. ב) מספר נבטים נימי הדם ליחידת שטח. ג) סה"כ אורך כלי הדם ליחידת שטח כלי הדם. * מייצג הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצת unstimulated. השוואות סטטיסטיות נעשו באמצעות ניתוח שונות חד כיווני ואחריו במבחן של דאן. (P <0.05). האו"ם מייצג unstimulated.

איור 6
איור 6. תמונות ניאון נציג של רשתות כלי הדם mesenteric מרקמות ורקמות unstimulated ב 3 ו 10ימים לפרסם החצנה של לפדר. Immunofluorescent PECAM תיוג (אדום) מזהה בתאי האנדותל, ומעמד III-β טובולין תיוג (ירוק) מזהה העצבים (ראשי חץ) ותאי perivascular (חיצים). תאים Perivascular זמני upregulate הכיתה III-β טובולין במהלך נימי הנבטה. ברשתות כלי הדם unstimulated, מעמד III-β טובולין הוא עצב מסוים אינו מזהה תאים perivascular. 3 ימים גירוי לתגובה, מעמד III-β טובולין חיובי תוויות בתאי perivascular יחד microvessels. ביום 10, בכיתה III-β טובולין דפוס הביטוי מתחיל לחזור תרחיש unstimulated. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר.

איור 7
איור 7. תמונות תומכות היתכנות מראש שכותרתו תאים מעקב שימושית מקומית במהלך הצמיחה רשת כלי הדם מומרץ ע"י החצנה לפדר. התאים היו superfused על mesenterIC-Windows בתקופה של 20 דקות החצנה. 1 ביום שלאחר הניתוח, תאים DiI שכותרתו (אדום) נצפו במישור דאם מרחק עם PECAM חיובית microvessels (ירוק). א, ב) דוגמאות DiI בתאי מח העצם שכותרתו מציג מעוגלות מוארך מורפולוגיות. במקרים מסוימים (חיצים) היו תאים מוארכים יחד microvessels. ג) דוגמה מקבץ של DiI שכותרתו בתאי גזע mesenchymal ליד קצה נימי נבט (החץ). ברים הם בקנה מידה 50 מיקרומטר (א), ו -20 מיקרומטר (B, C).

Discussion

המודל החצנה דווח בשנת 2006 והוא מותאם החל מה מכניים חולדה פגיעה מודלים לפדר של אנגיוגנזה 4-7 ומייצרת תוצאות דומות שהוקמו גם דגמים הזרקת ה-IP לנצל עכברוש לפדר 9. השעה החצנה 20 דקות נקבע באופן ניסיוני כדי לייצר תגובה angiogenic חזקים. אמנם זה פרק הזמן יכול להיות מגוונים, זה לאפשר יישום מקומי של מעכבי angiogenic 4 ללימודי מכניסטיים יישום ישיר של תאים חיצוניים ללימודי השושלת סלולריים. הכדאיות של שילוב תאים לתוך הרקמה שיפוץ mesenteric נתמכת על ידי מחקרים ראשוניים במעבדה שלנו באמצעות מראש שכותרתו מח עצם ותאי גזע mesenchymal (איור 7), ועל ידי ההצלחה של חוקרת את גורלו של האדם IP השומן המופק בתאי סטרומה הזרקת 14 . במעבדה שלנו, השתמשנו במודל זה כדי לזהות phen pericyteשינויים otypic במהלך זמן התגובה angiogenic 10 ולהעריך את הפוטנציאל angiogenic במהלך במצבים פתולוגיים, דוגמת יתר לחץ דם 12. בתגובה angiogenic ו פנוטיפ התא שינויים הקשורים מודל זה יכול להיות גם ציין אחרות mesenteric מודלים חולדה angiogenic כולל חשיפה היפוקסיה כרונית 10, 11.

הגבלה של המודל החצנה היא מפעילה את המנגנונים המדויקים של אנגיוגנזה אינם ידועים. החצנה של לפדר נקשר degranulation תא התורן רמות היסטמין גבוהות 6, אך חקירה נוספת נדרשת כדי לקבל תובנה רבה יותר. גירוי angiogenic הוא ללא ספק רב העצרת, ייצור תגובה שיפוץ חזקים מעבר בהיררכיה של רשת כלי הדם. אמנם לא ידועים המנגנונים להישאר הביקורת העיקרי של מודל זה, שחזור שלה ופשטות להפוך אותו למושך לזיהוי הסלולר דינמיקה involved בתהליך מורכב מיסודו הנבטה נימי. שחזור של מודל נתמך על ידי מדדים angiogenic דומים במהלך תקופה של צמיחה רשת כלי הדם על פני מספר רב של זנים של עכברים (Wistar זכר ונקבה Sprague-Dawley) במחקרים שפורסמו בעבר מהמעבדה שלנו, 10, 12. מאז, רוב הרקמות mesenteric עכברים בוגרים הם vascularized, המודל גם מאפשר מספר רב של רקמות כדי להיבדק לכל בעל חיים. למרבה הצער, מודל זה אינו ישים בעליל מודלים העכבר גנטיות כמו mesenteric Windows העכבר יש כלי הדם יליד פחות, מניסיוננו, בדרך כלל אין רשתות הסתעפות הנצפה. יישומים עתידיים כוללים את החקירה של פונקציונליות כלי במהלך אנגיוגנזה באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני בנקודות זמן ספציפיות חקירת הדינמיקה הסלולר הקשורות המעורבים lymphangiogenesis ו neurogenesis. למרות היקף כלי הדם יליד לכל חלון mesenteric נראה המשוגעיחסי ghly עם הגיל, ראינו הסתעפות רשתות כלי הדם אצל הזכר חולדות Wistar החל מגיל 4-5 שבועות. תצפיות מראות כי המודל החצנה יכול להיות מיושם גם להשוות את ההבדלים angiogenic על פני המון זמן.

Disclosures

אין לנו מה למסור.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת העוצרים של מדינת לואיזיאנה LEQSF (2009-12), RD-A-19 (PI: WL Murfee) לבין יתר לחץ דם טוליין מרכז כליות מצוינות ממומן על ידי מענק P20RR017659 NIH-08 (PI : ל 'גבריאל Navar).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12"x12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instruments Co. RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge;0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length
4-0 suture Ethicon Inc. 699G (1.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
5-0 suture Ethicon Inc. 8556 (1.0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blue Monofilament
7-0 suture Ethicon Inc. 1647G (0.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
Castroviejo Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-02 Tip Width:0.6mm
Clamping Length:5mm
Length:9cm
Straight tip
Castroviejo Needle Holder Fine Science Tools 12565-14 Tip Shape:Straight
Tip Width:1.5mm
Clamping Length:10mm
Scissors:No
Lock:Yes
Length:14cm
Serrated:Yes
Scalpel Handle Roboz Surgical Instruments Co. RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-13 Beveled Ridge, Slippable
Table of Specific Surgical Materials and Tools.
Beuthanasia Merck & Co. MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium
Ketamine Fort Dodge Animal Health MWI #: 000680 Kateset 100 mg/ml
Xylazine Lloyd, Inc. MWI #: 009307 Anased 100 mg/ml (Ordered from MWI Veterinary Supply)
Saline Hospira Inc. 94-217-JT
PBS Sigma-Aldrich 011M8207
Saponin Sigma-Aldrich BCBB4080
PECAM (CD31) BD Biosciences 553371
Streptavidin-CY3 Jackson ImmunoResearch 016-160-084
BSA Jackson ImmunoResearch 096555
VECTASTAIN Elite ABC Vector Laboratories PK-6100
Vector Nova Red Vector Laboratories SK-4800
VectaMount Vector Laboratories H-500
Table of Specific Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, 249-257 (2000).
  2. le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. Angiogenesis and hypertension. J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).
  3. Peirce, S. M., Skalak, T. C. Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis. Microcirculation. 10, 99-111 (2003).
  4. Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo. J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).
  5. Ponce, A. M., Price, R. J. Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo. Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).
  6. Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery. Agents Actions. 33, 371-377 (1991).
  7. Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling. Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).
  8. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
  9. Norrby, K. C. Rat Mesentery Angiogenesis Assay. J. Vis. Exp. (52), e3078 (2011).
  10. Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling. Microcirculation. 13, 261-273 (2006).
  11. Stapor, C. P., Murfee, L. W. Identification of class III β-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells. Microvascular Research. Forthcoming (2011).
  12. Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats. Microcirculation. (2011).
  13. Robichaux, J. L. Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery. Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).
  14. Amos, P. J. IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype. Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).
לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).More

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter