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Biology

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

doi: 10.3791/3954 Published: May 20, 2012

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Modell für die Stimulierung der Angiogenese im Rattengekröse. Das Modell stellt eine dramatische Steigerung der Kapillare sprießen, vaskulären Bereich und vaskuläre Dichte über einen relativ kurzen Zeit natürlich in einem Gewebe, das en face Visualisierung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken bis auf die Ebene einzelner Zellen ermöglicht.

Abstract

Microvacular Netzwerk Wachstum und Umbau sind kritische Aspekte der Wundheilung, Entzündung, diabetische Retinopathie, Tumorwachstum und anderen Krankheitszuständen 1, 2. Netzwerk-Wachstum wird im Allgemeinen Angiogenese, wie das Wachstum neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßen definiert zugeschrieben. Die angiogenen Prozess wird auch direkt an Arteriogenese verbunden, definiert als der Kapillare Erwerb einer perivaskuläre Zelle Beschichtung und Behälter Erweiterung. Unnötig zu sagen, ist die Angiogenese komplex und beinhaltet viele Spieler auf zellulärer und molekularer Ebene 3. Zu verstehen, wie ein mikrovaskulären Netzwerk wächst erfordert die Ermittlung der räumlichen und zeitlichen Dynamik entlang der Hierarchie eines Netzwerks über den zeitlichen Verlauf der Angiogenese. Diese Informationen sind kritisch für die Entwicklung von Therapien zu manipulieren Schiff Wachstum ausgerichtet.

Die Exteriorisation Modell in diesem Artikel beschrieben stellt ein einfaches, reproduzierbares Modell für stimuliertLating Angiogenese im Rattengekröse. Es wurde von Wundheilung Modelle der Rattengekröse 4-7 ausgebildet, und ist eine Alternative, um die Angiogenese im Mesenterium über ip Injektionen von pro-angiogenen Mittel 8, 9 zu stimulieren. Die Exteriorisation Modell ist attraktiv, weil es eine minimale chirurgische Eingriffe erfordern und für dramatische, reproduzierbare Erhöhung der Kapillare Sprossen, Gefäßbereich und Gefäßdichte innerhalb eines relativ kurzen zeitlichen Verlauf in einem Gewebe, das für die zweidimensionale Darstellung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken ermöglicht bis zu einzelnen Zellebene. Das stimulierte das Wachstum spiegelt natürliche angiogene Antworten in physiologischer Umgebung ohne Störungen von ausländischen angiogenen Molekülen. Mit immunhistochemischen Methoden Kennzeichnung, ist dieses Modell als äußerst hilfreich erwiesen bei der Identifizierung neuer zellulärer Ereignisse an der Angiogenese beteiligt. Forscher können leicht korreliert die angiogenen Metriken während des Zeitverlaufs der Umbau mit der Zeit specific Dynamik, wie zum Beispiel zellulare phänotypischen Veränderungen oder zelluläre Wechselwirkungen 4, 5, 7, 10, 11.

Protocol

1. Chirurgisches Vorgehen Set-Up Hinweise

  1. Vor der Operation zu sterilisieren chirurgisches Material und Instrumente. Zubehör für das sterilen chirurgischen Verfahren für jede Ratte verwendet werden, umfassen ein Abdecktuch an sich als eine sterile Oberfläche für die Platzierung der Instrumente gelegt werden, einem Tuch, mit einer vorgeschnittenen Öffnung etwa 0,5 x 1,5 in der in der Mitte über der Ratte platziert werden und Gaze. Die vorgeschnittene Loch auf dem Abdecktuch wird mit dem Einschnitt an der Ratte angeglichen. Instrumente für die Operation erforderlich sind 1 Standard-Schere verwendet werden, um Nahtmaterial geschnitten werden, zwei Zangen und einer feinen Nadel Halter für den Umgang mit und Greifen des Fadens, und ein Skalpell mit einer Klinge. Wir haben die gemeinsame Instrumente durch unser Labor in der Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeuge verwendet werden aufgelistet. Allerdings hängt endgültige Auswahl-Werkzeug auf Experimentator Präferenzen.
  2. Bereiten Sie die Operation Raum. Stellen Sie ein 100 ml 0,9% iger steriler Saline-Tasche unter einem Heizkissen um sicherzustellen, dass die Salzlösung, die in Kontakt kommt wit dem Mesenterium Gewebe wird auf ca. 37 vorgewärmt ° C. Als Alternative zur Saline, können Sie mit Ringer-Lösung oder einen anderen physiologischen Puffer. Legen Sie sterilisierte chirurgische Instrumente und Zubehör auf einem sterilen Tuch für einen einfachen Zugang während des Verfahrens Exteriorisation. Außerdem benötigen Sie sterile Wattestäbchen Applikatoren und die entsprechenden 3 Arten von Nähten (4-0, 5-0 und 7-0). Stellt sicher, dass Pakete sind so voreingestellt, dass die Materialien eröffnet mit sterile Handhabung zugegriffen werden kann. Schließlich desinfizieren zuvor modifizierten Kunststoff Stufe durch Eintauchen in 100% Ethanol für mindestens 5 Minuten. Die Bühne ist eine 100 mm Petrischale mit einem elliptischen Loch in der Mitte (Abbildung 1) zu schneiden. Ein Dremel-Tool kann verwendet werden, um zunächst zu machen und, falls erforderlich, erweitern Sie das Loch werden. Nachdem das Loch gemacht wird, werden die Ränder des Schnittes Kunststoff glatt mit Schleifpapier unterschiedlicher Körnung. Die Bühne wird dann gewaschen und schließlich entweder inert Modelliermasse (gekauft von einem lokalen Handwerks speichern) oder Silicam Klebstoff auf des Lochs Kante hinzugefügt, um einen erhöhten, glatte Oberfläche bereitzustellen. Vor mit dem Gewebe in Kontakt, wird die Stufe müssen ausreichend mit steriler Kochsalzlösung gespült werden.
  3. Für dieses Modell der Angiogenese, wir verwenden in der Regel erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (350 ± 25 g). Andere Rattenstämmen und Altersstufen verwendet werden kann. In unserem Labor sind Ratten betäubt durch intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,08 mg / kg KG). Nach ca. 5 Minuten, wird die Wirkung der Anästhesie bestätigt und der Ratte Bauchhaut rasiert wird.

2. Rattengekröse Exteriorisation Modell

  1. Positionieren Sie den narkotisierten Ratte auf dem Rücken auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. Aseptische Techniken werden während des chirurgischen Eingriffs verwendet. Trage sterile Handschuhe und erlauben keine Apparaten und Materialien zu nicht-sterilen Oberflächen außer den Rattengeweben kontaktieren.
  2. Säubern Sie Bauch-Bereich mit wechselnden Tücher USIng die sterile Gaze in 70% igem und Jod getränkt.
  3. Mit dem Skalpell, einen kleinen (ca. 0,75 Zoll) Längsschnitt entlang der Haut und dann der Linea alba ca. 1 cm unterhalb des Brustbeins.
  4. Platzieren Sie die vorgeschnittenen Tuch über die abdominale Abschnitt so daß die Öffnung ausgerichtet ist mit dem Einschnitt.
  5. Durch leichten Druck um den Einschnitt. Dies wird in der Regel in der Exposition des Dünndarms genug, um es leicht identifiziert werden können führen.
  6. Mit den Wattestäbchen Applikatoren, ziehen Sie vorsichtig einen Abschnitt des Dünndarms und suchen Sie das Ileum. Da das Mesenterium herausgezogen wird, sollte sie vorsichtig gelegt werden, sind im Kunststoff-Stufe (Abbildung 2).
  7. Identifizieren 6-8 vaskularisierten mesenterialen Fenstern. Ein mesenterica Fenster wird als dünne durchlässige Membran zwischen den Arterien / Venen Paaren Zuführen des Dünndarms (2) definiert.
  8. Notieren Sie sich die Startzeit der Entäußerung. Verlassen Sie die mesentery Abschnitt exteriorisiert für 20 Minuten. Während der Periode Exteriorisation, verwenden Sie eine sterile Spritze (5 ml), um intermittierend füllet die Saline in der Petrischale, um sicherzustellen, dass das Gewebe eingetaucht bleibt und nicht austrocknet.
  9. Während der 20-minütigen Einwirkzeit, markieren Sie die zwei zentral gelegenen mesenterialen Fenster mit sterilem Nahtmaterial 7-0. Die Markierungen sollten in dem Fett in der Nähe des Darmes vorgenommen werden.
  10. Senden Sie das exteriorisierten Region des Mesenteriums in die Bauchhöhle.
  11. Schließen Sie die Bauchmuskeln mit 5-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen.
  12. Schließen Sie die Haut mit 4-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen.
  13. Wischen Sie die Fläche mit wechselnden vernäht Tücher über die sterile Gaze in 70% isopropoyl und Jod getränkt.
  14. Verbreiten Augensalbe Gel auf beiden Augen der Ratte. Der Zweck der Schmierung des Auges ist, um ein Austrocknen der Hornhaut während des chirurgischen Eingriffs und Wiederherstellung zu verhindern. Die Anwendung von Schmiermittel Auge angewendet werden solltevor Beginn des chirurgischen Eingriffs. Falls nötig, tragen Sie Auge Schmiermittel vor Rückgabe der Ratte in den Käfig für die Verwertung.

3. Tissue Ernte und Fixierung

  1. Am Tag der Zinsen nach Stimulation, betäuben und einschläfern die Ratte. In unserem Labor sind Ratten über eine intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,8 mg / kg KG) und dann über intrakardiale Injektion von beuthanasia eingeschläfert betäubt. Beuthanasia ist ein Pentobarbital-Natrium / Phenytoin Lösung, die für eine schnelle und schmerzlos Euthanasie verwendet werden können. Pro Ratte unserem Labor üblicherweise injiziert 0,1 bis 0,2 ml.
  2. Öffnen Sie erneut die Bauchhöhle und entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm, und suchen Sie die beiden markierten Fenstern.
  3. Schneiden Sie jede der exteriorisierten mesenterialen Fenster mit einer Pinzette und Mikro-Schere. Einschließlich einer Grenze von Fett pro Fenster ist von Vorteil für die spätere Verbreitung Gewebe auf Objektträger. SofortTauchen Sie jedes Fenster in PBS. Beim Schneiden, versuchen zu vermeiden, Durchschneiden der Arterien / Venen-Paare innerhalb des Fett-Grenze der Fenster, um potenzielle Blutfüllung der Fenster zu minimieren. Außerdem minimieren Schneiden durch den Darm führt, dass Darminhalt die Fenster Kontakt.
  4. Verwenden einer Pinzette, um Gewebe auf positiv geladene Objektträger ausgebreitet. Zwei Gewebe können pro Folie montiert werden.
  5. Lassen Sie das Gewebe teilweise zu trocknen und mit einem Skalpell entfernen Sie das überschüssige Fett.
  6. Die Gewebe sind nun bereit, fixiert werden. Typische Befestigungsmethoden verwendet werden. In unserem Labor haben wir häufig zu fixieren Sie die Folien in Methanol (-20 ° C) für 30 min. Erfolgreiche Kennzeichnung hat auch mit nicht fixierten Gewebe durchgeführt. Fixation Methoden könnten auf Ihre bevorzugte Antikörper abhängen.

4. Tissue Immunmarkierung

  1. Die Gewebe können in der Regel nun entsprechend den Anweisungen pro Antikörper für die Immunhistochemie gekennzeichnet werden. Da unser Interesse an der Identifizierung der Rollenvaskulärer Perizyten während der Angiogenese, unserem Labor üblicherweise markiert für Endothelzellen und perivaskuläre Zellen 10, 12, 13. Nützliche Markierungen an Endothelzellen entlang der Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken zu identifizieren sind ein anti-PECAM-Antikörper oder BSI-Lektin. Perivaskuläre Zellmarker in diesem Gewebe verwendet werden, umfassen NG2, Desmin, SM-α-Actin, PDFGRβ und Klasse III β-Tubulin. Unten, in Abschnitt 3.3 haben wir Protokolle zur colorimetrischen und fluoreszenten PECAM Immunomarkierung Protokolle aufgelistet.
  2. Vor der ersten primären Antikörper Inkubation sind Dias Vakuum getrocknet, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Auch werden die Gewebe zunächst mit einem Wachsschreiber erläutert, um unkontrollierten Antikörperlösungen vom Gewebe zu verhindern. Schließlich werden alle Schritte Kennzeichnung von Wasch-Schritte folgen. Für Waschschritte werden gleitet im Inneren Färbeschalen platziert. Die Pufferlösung wird 3-mal während des Waschvorgangs Dauer ausgetauscht.
  3. Endothelzellen Antikörpermarkierung Verfahren: <p class = "jove_step"> PECAM Kolorimetrische Lableing

    1. Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
    2. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten.
    3. Sekundäre Antikörper-Inkubation: Drip sekundären Antikörper-Lösung (Vectastain Elite ABC-Lösung von Vector Laboratories, ein Streptavidin-Peroxidase sekundären Antikörper-Lösung) auf der Oberseite des Gewebes. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    4. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten.
    5. Inkubieren Gewebe mit Vector Red Nova für 15 Minuten. Dann steigen Gewebe mit Wasser.
    6. Berg Dias: Dip Slides in 95% Ethanol 10 mal. Objektträger in 100% Ethanol für 2 Minuten. Objektträger in einem anderen 100% Ethanol sosung für 2 Minuten. Dann Objektträger in aufeinander folgenden 100% Xylol-Lösungen für jeweils 2 Minuten. Trocknen lassen und decken Gewebe mit einer dünnen Schicht aus VectaMount und einem Deckglas.

    PECAM Fluorescent Labeling

    1. Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
    2. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten.
    3. Sekundäre Antikörper-Inkubation. Drip sekundären Antikörper-Lösung ((1:100 Streptavidin-CY3 in Antikörper-Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite des Gewebes bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert.
    4. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten.
    5. Berg Dias: Drip 50:50 PBS mit Glycerin auf der Oberseite des Gewebes. Deckenmit Deckglas. Dann verwenden Nagellack, die Lücke zwischen Deckglas und Objektträger zu versiegeln.

5. Repräsentative Ergebnisse

Repräsentative Bilder Rattengekröse Gewebe immunhistochemisch für PECAM beschriftet sind in Abbildung 3 dargestellt. PECAM Kennzeichnung identifiziert alle Schiffstypen entlang der Hierarchie der Umbau mikrovaskuläre Netzwerke und können verwendet werden, um angiogenen Metriken zu bestimmten Zeitpunkten nach Stimulation zu quantifizieren. PECAM Kennzeichnung ermöglicht auch die Bestimmung von Arteriolen gegenüber Venolen. Zuführen Arteriolen typischerweise kleinere Durchmesser und länglichen Endothelzell-Morphologie im Vergleich zu paarenden Venolen (Abbildung 4). Kapillaren und Kapillare Sprossen können auf Basis ihrer Gefäßdurchmesser und die relative Position in einem Netzwerk identifiziert werden. Typische Merkmale der Umbau Netzwerke sind eine erhöhte Kapillar sprießen, Gefäßdichte, vaskularisierten Bereich und venulären tortuosITY. Quantifizierung verschiedener Metriken angiogenen identifiziert den zeitlichen Verlauf der das Wachstum des Netzwerks (5). Kapillar sprießen aus bereits bestehenden Gefäßen, Spitzen zwischen Tag 3 und Tag 5 und kehrt in den unstimulierten Niveau von Tag 10. Diese vorübergehenden Anstieg der Keimung wird durch Erhöhung der Gefäßdichte und vaskularisierten Bereich folgten. Als Beweis für die Neugestaltung von größeren Schiffen in diesem Modell ist die Zahl der Arteriolen und Venen Segmenten erhöht sich auch über den Zeitverlauf.

In unserem Labor ist dieses Modell verwendet, um zelluläre phänotypische Veränderungen bei bestimmten Zeitpunkt während dieser Umbauprozess 10, 11 zu identifizieren. Zum Beispiel identifiziert Klasse III β-Tubulin-Perizyten entlang angiogenetischen Gefäßen (Abbildung 6). In nicht stimulierten Geweben, ist der Klasse III β-Tubulin-Expression spezifischer Nerven. Im Gegensatz dazu auf dem Höhepunkt der Kapillare sprießen, wird der Klasse III β-Tubulin durch perivaskuläre Zellen exprimiert. Diese Artvon Ergebnis unterstreicht die Verwendung dieser einfachen und robusten angiogenen Modell, um neue Zelltypen im angiogenen Prozess beteiligt sind.

1
Abbildung 1. Bilder des Kunststoff-Bühne Pre-und Post-Modifikation. Die zuvor modifizierten Stufe ist ein 100 mm Petrischale. Modifikationen umfassen einen elliptischen Schnitt Loch in der Mitte und die anschließende Zugabe von Knetmasse oder Silikonkleber auf das Loch der Rand für die Schaffung einer erhöhten, glatte Oberfläche. Diese Oberfläche bietet eine innere Grenze, die Superfusion der exteriorisierten mesenterialen Fenstern erleichtert. Maßstabsbalken ist 1 cm.

2
Abbildung 2. Das Bild von exteriorisierten mesenterialen Region. Mesenteriale Fenster sind wie die dünne lichtdurchlässige Membranen zwischen den Arterien / Venen-Paare Fütterung der Dünndarm definiert. Während der ExteriorisationDauer ist die mesenterialen Bereich angelegt und in Kochsalzlösung eingetaucht in einem modifizierten Petrischale. Inerten gelben Modelliermasse bietet eine glatte Oberfläche für das Mesenterium, um durch die vorgestanzten Löcher gezogen werden. Maßstabsbalken ist 1 cm.

Abbildung 3
Abbildung 3. Repräsentative Bilder mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10 Tage nach der Entäußerung des Mesenteriums. PECAM Kennzeichnung identifiziert die Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich, Arteriolen (A), Venolen (V) und Kapillaren (C). Beitrag Stimulation, erscheint mikrovaskulären Netzwerken eine Zunahme der Kapillare sprießen (Pfeilspitzen) und Gefäßdichte. Maßstabsbalken ist 100 um.

Abbildung 4
Abbildung 4. Repräsentative Bilder Arteriole / Venole Paare innerhalb erwachsenen Ratte mesenterialen mikrovaskulären Netzwerks. In beiden Abbildungen können Arteriolen (A) von Venolen (V) basierend auf einem kleineren Durchmesser und relativ länglichen Endothelzell-Morphologie unterschieden werden. Scale-Bars sind 20 um.

Abbildung 5
Abbildung 5. Vertreter Quantifizierung der Angiogenese-Metriken über den zeitlichen Verlauf der mikrovaskulären Wachstum Beitrag Mesenterium Exteriorisation. A) Vascular Fläche pro Gewebebereich. B) Zahl der kapillaren Sprossen pro vaskulären Bereich. C) Gesamt vaskulären Länge pro vaskulären Bereich. * Steht für signifikanten Unterschied im Vergleich zu nicht stimulierten Gruppe. Statistische Vergleiche wurden mit einem One-Way ANOVA durch Dunn-Test gefolgt. (P <0,05). UN stellt unstimulierten.

6
Abbildung 6. Vertreter fluoreszierende Bilder von mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10Tag posten Exteriorisation des Mesenteriums. Immunfluoreszenz PECAM Kennzeichnung (rot) identifiziert Endothelzellen und Klasse III β-Tubulin-Kennzeichnung (grün) identifiziert Nerven (Pfeilspitzen) und perivaskulären Zellen (Pfeile). Perivaskulären Zellen transient hochreguliert Klasse III β-Tubulin während Kapillare sprießen. In unstimulierten mikrovaskulären Netzwerken ist Klasse III β-Tubulin-spezifischen Nerv und keine perivaskulären Zellen zu identifizieren. 3 Tage nach der Stimulation, Klasse III β-Tubulin-positiv markiert perivaskulären Zellen entlang Mikrogefäße. Am Tag 10, beginnt der Klasse III β-Tubulin-Expression auf den unstimulierten Szenario zurückkehren. Scale-Bar ist 50 um.

7
Abbildung 7. Bilder unterstützen die Machbarkeit der Tracking voretikettiert lokal applizierten Zellen während der mikrovaskulären Netzwerk Wachstum durch das Mesenterium Exteriorisation stimuliert. Die Zellen wurden über Mesenter superfundiertIC-Fenster während des 20-minütigen Zeitraum Exteriorisation. 1 Tag nach der Operation, DiI-markierten Zellen (rot) in der Brennebene Dame mit PECAM positiven Mikrogefäße (grün) beobachtet. A, B) Beispiele für DiI markiertem Knochenmarkszellen aufweist gerundet und Morphologien verlängert. In einigen Fällen (Pfeile)-Zellen wurden zusammen Mikrogefäße verlängert. C) Beispiel eines Clusters von DiI markiertem mesenchymalen Stammzellen in der Nähe der Spitze einer Kapillare sprießen (Pfeil). Scale-Bars sind 50 um (A), und 20 um (B, C).

Discussion

Die Exteriorisation Modell wurde im Jahr 2006 gemeldet und wird von früheren mechanischen Verletzung Rattengekröse Modellen der Angiogenese 7.4 angepasst und führt zu ähnlichen Ergebnissen zu etablierten ip Injektion Modelle, die Nutzen aus der Rattengekröse 9. Die 20 Minuten Exteriorisation Zeit wurde experimentell bestimmt, um eine robuste angiogene Reaktion zu erzeugen. Während dieses Zeitraums konnte variiert werden, gestattet aber die für die lokale Anwendung von angiogenen Inhibitoren 4 für mechanistische Studien und direkte Anwendung von exogenen Zellen für die Zelllinie Studien. Machbarkeit der Zelle Einbau in Umbau mesenterialen Gewebe wird durch Voruntersuchungen in unserem Labor mit voretikettiert Knochenmarkszellen und mesenchymalen Stammzellen (Abbildung 7), und durch den Erfolg der Untersuchung des Schicksals der menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen Injektion IP 14 unterstützt . In unserem Labor haben wir dieses Modell verwendet, um Perizyten phen identifizierenotypic Veränderungen über den Zeitverlauf der angiogene Antwort 10 und die angiogene Potential bei pathologischen Bedingungen, wie Bluthochdruck 12 zu bewerten. Die angiogene Reaktion und Zell-Phänotyp bei diesem Modell Veränderungen verbunden sind, können auch in anderen Ratte mesenterica angiogenen Modelle einschließlich chronischer Hypoxie Exposition 10, 11 beobachtet werden.

Eine Begrenzung der Exteriorisation Modells ist, dass die genauen Mechanismen der Angiogenese auszulösen unbekannt sind. Veräußerlichung des Mesenteriums hat Mastzelldegranulation und erhöhte Histamin-Spiegel 6 in Verbindung gebracht worden, dennoch sind weitere Untersuchungen nötig, um mehr Einblick zu gewinnen. Die angiogenen Stimulus ist zweifellos multifaktorielle und produziert einen robusten Umbau Reaktion über die Hierarchie eines mikrovaskulären Netzwerk. Während die unbekannte Mechanismen eine große Kritik an diesem Modell zu bleiben, machen ihre Reproduzierbarkeit und Einfachheit sie attraktiv für die Identifizierung von zellulären Dynamik INVOLved in der Natur aus komplex Kapillare Keimenprozeß. Die Reproduzierbarkeit des Modells wird durch angiogenen vergleichbar Metriken über den zeitlichen Verlauf der mikrovaskulären Netzwerk Wachstum über mehrere Rattenstämmen (männliche Wistar und weiblichen Sprague-Dawley) in zuvor veröffentlichten Studien aus unserem Labor 10, 12 unterstützt. Da die Mehrheit der erwachsenen Ratte mesenterica Gewebe vaskularisiert sind, erlaubt das Modell auch für mehrere Gewebe für jedes Tier untersucht werden. Leider ist dieses Modell nicht für offensichtlich genetische Mausmodelle als Maus mesenterialen Fenster weniger nativen Vaskularisierung haben und nach unserer Erfahrung, häufig fehlt es beobachtbar Verzweigung Netzwerke. Zukünftige Anwendungen umfassen die Untersuchung von Schiff-Funktionalität während der Angiogenese mit intra-vital-Mikroskopie zu bestimmten Zeitpunkten und die Untersuchung der damit verbundenen zellulären Dynamik in Lymphangiogenese und Neurogenese beteiligt. Obwohl das Ausmaß der nativen Vaskularisierung pro mesenterialen Fenster scheint rou seinHinzu kommen rd proportional mit dem Alter haben wir beobachtet, Verzweigung mikrovaskulärer Netzwerke in männlichen Wistar-Ratten im Alter von 4-5 Wochen alt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass das Modell auch konnte Exteriorisation angewandt, um die Unterschiede zwischen den Altersgruppen angiogenen zu vergleichen.

Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Und der Tulane Hypertonie und Nieren Center of Excellence von NIH finanziert P20RR017659-08 (PI: Diese Arbeit wurde vom Board of Regents des Staates Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (WL Murfee PI) unterstützt : L. Gabriel Navar).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12"x12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instruments Co. RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge;0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length
4-0 suture Ethicon Inc. 699G (1.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
5-0 suture Ethicon Inc. 8556 (1.0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blue Monofilament
7-0 suture Ethicon Inc. 1647G (0.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
Castroviejo Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-02 Tip Width:0.6mm
Clamping Length:5mm
Length:9cm
Straight tip
Castroviejo Needle Holder Fine Science Tools 12565-14 Tip Shape:Straight
Tip Width:1.5mm
Clamping Length:10mm
Scissors:No
Lock:Yes
Length:14cm
Serrated:Yes
Scalpel Handle Roboz Surgical Instruments Co. RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-13 Beveled Ridge, Slippable
Table of Specific Surgical Materials and Tools.
Beuthanasia Merck & Co. MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium
Ketamine Fort Dodge Animal Health MWI #: 000680 Kateset 100 mg/ml
Xylazine Lloyd, Inc. MWI #: 009307 Anased 100 mg/ml (Ordered from MWI Veterinary Supply)
Saline Hospira Inc. 94-217-JT
PBS Sigma-Aldrich 011M8207
Saponin Sigma-Aldrich BCBB4080
PECAM (CD31) BD Biosciences 553371
Streptavidin-CY3 Jackson ImmunoResearch 016-160-084
BSA Jackson ImmunoResearch 096555
VECTASTAIN Elite ABC Vector Laboratories PK-6100
Vector Nova Red Vector Laboratories SK-4800
VectaMount Vector Laboratories H-500
Table of Specific Reagents

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References

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Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).More

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).

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