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Biology

चूहा अन्त्रपेशी बाह्यीकरण: सेलुलर angiogenesis में शामिल गतिशीलता जांच के लिए एक मॉडल

doi: 10.3791/3954 Published: May 20, 2012

Summary

इस अनुच्छेद के के चूहा अन्त्रपेशी में angiogenesis उत्तेजक के लिए एक साधारण मॉडल का वर्णन है. मॉडल केशिका अंकुरण, संवहनी और एक ऊतक है कि चेहरा पूरी microvascular नेटवर्क की एकल कोशिका के स्तर के नीचे दृश्य एन की अनुमति देता है एक अपेक्षाकृत कम समय के पाठ्यक्रम पर संवहनी घनत्व क्षेत्र में नाटकीय वृद्धि का उत्पादन.

Abstract

Microvacular नेटवर्क के विकास और remodeling घाव भरने, सूजन, मधुमेह रेटिनोपैथी, ट्यूमर के विकास और अन्य रोग 1 की स्थिति, 2 की महत्वपूर्ण पहलू हैं. नेटवर्क के विकास को सामान्यतः angiogenesis को, पहले से मौजूद जहाजों से नए जहाजों की विकास के रूप में परिभाषित करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है. angiogenic प्रक्रिया भी सीधे arteriogenesis के लिए लिंक, एक perivascular सेल कोटिंग और पोत वृद्धि की केशिका अधिग्रहण के रूप में परिभाषित किया. यह कहना बेकार है, angiogenesis जटिल है और कई खिलाड़ियों के शामिल सेलुलर और आणविक स्तर पर 3. समझ कैसे एक microvascular नेटवर्क बढ़ता angiogenesis के समय के पाठ्यक्रम पर एक नेटवर्क के पदानुक्रम के साथ स्थानिक और लौकिक गतिशीलता की पहचान की आवश्यकता है. यह जानकारी वाहिका विकास से छेड़छाड़ करने के उद्देश्य से चिकित्सा के विकास के लिए महत्वपूर्ण है.

इस आलेख में वर्णित बाह्यीकरण मॉडल एक सरल, stimu के लिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल का प्रतिनिधित्व करता हैचूहा अन्त्रपेशी में angiogenesis lating. यह चूहा 4-7 अन्त्रपेशी में घाव चिकित्सा मॉडल से अनुकूलित किया गया था, और एक समर्थक angiogenic 8 एजेंटों, 9 आईपी इंजेक्शन के माध्यम से अन्त्रपेशी में angiogenesis को प्रोत्साहित करने का विकल्प है. बाह्यीकरण मॉडल आकर्षक है क्योंकि यह न्यूनतम शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता है और एक ऊतक कि पूरे microvascular नेटवर्क के दो आयामी दृश्य के लिए अनुमति देता में एक अपेक्षाकृत कम समय के पाठ्यक्रम पर केशिका अंकुरित, संवहनी क्षेत्र और संवहनी घनत्व में नाटकीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बढ़ जाती है उत्पादन एकल नीचे सेल स्तर. उत्तेजित विकास विदेशी वाहिकाजनक अणुओं के हस्तक्षेप के बिना एक मनोवैज्ञानिक वातावरण में प्राकृतिक angiogenic प्रतिक्रिया दर्शाता है. Immunohistochemical लेबलिंग विधियों का प्रयोग, इस मॉडल उपन्यास सेलुलर angiogenesis में शामिल घटनाओं की पहचान करने में किया गया है अत्यंत उपयोगी साबित हो. जांचकर्ता आसानी से remodeling के समय सपा के साथ समय के दौरान angiogenic मैट्रिक्स सहसंबंधी कर सकते हैंecific की गतिशीलता, सेलुलर प्ररूपी परिवर्तन या सेलुलर बातचीत 4, 5, 7, 10, 11 के रूप में.

Protocol

1. सर्जिकल प्रक्रिया सेट नोट्स

  1. सर्जरी से पहले शल्य चिकित्सा की आपूर्ति और उपकरणों बाँझ. आपूर्ति प्रत्येक चूहे के लिए बाँझ शल्य प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया 1 यंत्र की नियुक्ति के लिए एक बाँझ सतह के रूप में रखी जा कपड़ा शामिल हैं, लगभग 0.5 1.5 x में एक पूर्व में कटौती केंद्र में छेद के साथ एक कपड़ा चूहे पर रखा जा करने के लिए धुंध, और. कपड़ा पर पूर्व में कटौती छेद चूहे पर किए गए चीरा के साथ पंक्ति में होगा. शल्य चिकित्सा के लिए आवश्यक उपकरण एक मानक कैंची की जोड़ी सीवन सामग्री में कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा, दो संदंश और हैंडलिंग और सिवनी की मनोरंजक के लिए एक ठीक सुई धारक, और एक ब्लेड के साथ एक स्केलपेल शामिल हैं. हम आम विशिष्ट सर्जिकल सामग्री और उपकरण के टेबल में हमारी प्रयोगशाला के द्वारा इस्तेमाल किया उपकरण सूचीबद्ध किया है. हालांकि, अंतिम चयन उपकरण experimenter वरीयताओं पर निर्भर करता है.
  2. सर्जरी अंतरिक्ष तैयार. एक हीटिंग पैड के तहत एक 100 एमएल 0.9% बाँझ खारा बैग प्लेस करने के लिए सुनिश्चित करें कि खारा है कि संपर्क w में आता हैith अन्त्रपेशी ऊतक 37 लगभग पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस खारा के लिए एक विकल्प के रूप में, तुम घंटी समाधान या किसी अन्य शारीरिक बफर का उपयोग कर सकते हैं. निष्फल सर्जिकल उपकरणों और आपूर्ति के बाहर बाह्यीकरण प्रक्रिया के दौरान आसान पहुँच के लिए एक बाँझ कपड़ा पर निर्धारित करना. इसके अलावा, आप बाँझ कपास टिप applicators और sutures के उपयुक्त 3 प्रकार (4-0, 5-0, और 7-0) की आवश्यकता होगी. बनाता है यकीन है कि संकुल रहे हैं तो पूर्व खोला कि सामग्री बाँझ हैंडलिंग के साथ पहुँचा जा सकता है. अंत में, यह कम से कम 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में डुबो कर पूर्व संशोधित प्लास्टिक चरण कीटाणुरहित. चरण एक अण्डाकार केंद्र (चित्रा 1) में कटौती छेद के साथ एक 100 मिमी पेट्री डिश है. एक Dremel उपकरण करने के लिए शुरू करने के लिए और यदि आवश्यक हो, छेद को चौड़ा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. छेद किया जाता है, के बाद कटौती प्लास्टिक के किनारों चिकनी विभिन्न अनाज की रेत कागज का उपयोग किया जाता है. मंच और धोया जाता है तो, अंत में, या तो निष्क्रिय मॉडलिंग एक स्थानीय शिल्प की दुकान से खरीदा मिट्टी या silicगोंद पर छेद बढ़त के क्रम में एक उठाया, चिकनी सतह प्रदान करने के लिए जोड़ा जाता है. ऊतक के साथ पहले से संपर्क करें, चरण के लिए पर्याप्त रूप से बाँझ खारा के साथ rinsed होना आवश्यकता होगी.
  3. Angiogenesis के इस मॉडल के लिए, हम आम तौर पर वयस्क पुरुष Wistar चूहों (350 ± 25 ग्राम) का उपयोग करें. अन्य चूहा उपभेदों और उम्र इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में चूहों (bw 80 मिलीग्राम / किग्रा) ketamine, xylazine (bw 8 मिलीग्राम / किग्रा), और atropine (bw 0.08 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ intramuscular इंजेक्शन के माध्यम से संवेदनाहृत हैं. लगभग 5 मिनट के बाद, संज्ञाहरण के प्रभाव की पुष्टि की है और चूहे के पेट की त्वचा के बाल काटे है.

2. चूहा अन्त्रपेशी बाह्यीकरण मॉडल

  1. एक हीटिंग पैड पर अपनी पीठ पर संवेदनाहृत चूहा स्थिति शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए. सड़न रोकनेवाला तकनीक शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाता है. बाँझ दस्ताने पहनें और गैर बाँझ चूहा ऊतकों की तुलना में अन्य सतहों से संपर्क करने के लिए उपकरणों और आपूर्ति की अनुमति नहीं है.
  2. उदर क्षेत्र को साफ पोंछे उसी के साथ बारीएनजी बाँझ धुंध 70% isopropyl और आयोडीन में भिगो.
  3. स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, एक छोटे से (लगभग इंच 0.75) त्वचा के साथ अनुदैर्ध्य चीरा तो और उरोस्थि के नीचे linea अल्बा लगभग 1 इंच.
  4. पेट खंड पर पूर्व में कटौती कपड़ा रखें इतना है कि पहले चीरा के साथ aligns.
  5. धीरे चीरा के आसपास दबाव लागू होते हैं. यह आम तौर पर काफी छोटे आँत के लिए यह आसानी से पहचान करने के जोखिम में परिणाम देगा.
  6. कपास टिप applicators का उपयोग, धीरे बाहर छोटी आंत के एक भाग खींच और लघ्वान्त्र का पता लगाने. के रूप में अन्त्रपेशी बाहर खींच लिया है, यह धीरे प्लास्टिक मंच (चित्रा 2) में किया जाना चाहिए बाहर रखी.
  7. 6-8 vascularized mesenteric खिड़कियों को पहचानें. एक खिड़की mesenteric धमनी / शिरा छोटी आंत (चित्रा 2) खिला जोड़े के बीच में पतली पारदर्शी झिल्ली के रूप में परिभाषित किया गया है.
  8. बाह्यीकरण का मूल्य उस समय रिकॉर्ड है. Mesente छोड़ दोry के अनुभाग 20 मिनट के लिए exteriorized. बाह्यीकरण अवधि के दौरान, एक बाँझ सिरिंज (5 एमएल) का उपयोग करने के लिए पेट्री डिश में रहकर खारा फिर से भरना करने के लिए सुनिश्चित करें कि ऊतक डूबे करता रहता है और सूखी बाहर नहीं.
  9. जोखिम 20 मिनट के समय के दौरान, 2 केन्द्र स्थित बाँझ 7-0 सीवन के साथ mesenteric विंडोज़ निशान. अंक आंत के निकट वसा क्षेत्र में किया जाना चाहिए.
  10. उदर गुहा अन्त्रपेशी की exteriorized क्षेत्र पर लौटें.
  11. बाधित पैटर्न में 5-0 monofilament सीवन के साथ पेट की मांसपेशियों को बंद करें.
  12. बाधित पैटर्न में 4-0 monofilament सीवन के साथ त्वचा को बंद करें.
  13. पोंछे का उपयोग कर बाँझ धुंध 70% isopropoyl है और आयोडीन में लथपथ बारी के साथ sutured क्षेत्र साफ कर लें.
  14. चूहे की दोनों आंखों पर नजर स्नेहक जेल बिखरा हुआ है. आँख स्नेहन के प्रयोजन के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया और वसूली के दौरान कॉर्निया के शुष्क्ीकरण को रोकने के लिए है. नेत्र स्नेहक आवेदन लागू किया जाना चाहिएशल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के शुरू करने के लिए पहले. यदि आवश्यक हो, नेत्र स्नेहक पहले फिर से लागू वसूली के लिए अपने पिंजरे में चूहे लौटने के लिए.

3. ऊतक फसल काटने वाले और फिक्सेशन

  1. ब्याज के बाद उत्तेजना के दिन पर, चतनाशून्य करना, और चूहा euthanize. हमारी प्रयोगशाला में चूहों (bw 80 मिलीग्राम / किग्रा) ketamine, xylazine (bw 8 मिलीग्राम / किग्रा), और atropine (bw 0.8 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ intramuscular इंजेक्शन और फिर beuthanasia की intracardiac इंजेक्शन के माध्यम से euthanized के के माध्यम संवेदनाहृत हैं. Beuthanasia pentobarbital समाधान सोडियम / फ़िनाइटोइन है कि तेजी से और पीड़ारहित इच्छामृत्यु के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 0.2 मिलीग्राम - चूहा प्रति हमारी प्रयोगशाला आम तौर पर 0.1 इंजेक्शन.
  2. उदर गुहा को फिर से खोलने और धीरे से छोटी आंत को हटाने और दो चिह्नित विंडोज़ का पता लगाने.
  3. प्रत्येक exteriorized mesenteric संदंश और सूक्ष्म कैंची का उपयोग कर खिड़कियों के बाहर कटौती. वसा प्रति खिड़की के एक सीमा सहित बाद में ऊतक खुर्दबीन स्लाइड पर के प्रसार के लिए फायदेमंद है. तुरंत, पीबीएस में हर विंडो विसर्जित कर दिया. जब काटने, खिड़कियों की वसा सीमा के भीतर धमनी / शिरा जोड़े के माध्यम से काटने के लिए संभावित खिड़कियों के भरने रक्त कम से कम से बचने का प्रयास करें. इसके अलावा, कम से कम आंत्र है कि आंतों की सामग्री में परिणाम खिड़कियों से संपर्क के माध्यम से काटने.
  4. संदंश का प्रयोग करें सकारात्मक आरोप लगाया खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतकों फैल. दो ऊतकों स्लाइड प्रति घुड़सवार किया जा सकता है.
  5. ऊतकों और आंशिक रूप से सूखे के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग अतिरिक्त चर्बी हटाने की अनुमति दें.
  6. ऊतकों अब तय होने के लिए तैयार हैं. ठेठ निर्धारण के तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम आमतौर पर 30 मिनट के लिए मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) में स्लाइड को ठीक. सफल लेबलिंग के भी unfixed ऊतकों के साथ प्रदर्शन किया गया है. फिक्सेशन तरीके अपना पसंदीदा प्रतिरक्षी पर निर्भर हो सकता है.

4. ऊतक Immunolabeling

  1. ऊतकों आम तौर पर अब immunohistochemistry के लिए एंटीबॉडी के प्रति निर्देश के अनुसार लेबल कर सकते हैं. भूमिकाओं की पहचान में हमारे हित को देखते हुएangiogenesis के दौरान संवहनी pericytes, हमारे प्रयोगशाला सामान्यतः endothelial और perivascular 10 कोशिकाओं, 12, 13 के लिए लेबल है. उपयोगी के microvascular नेटवर्क के पदानुक्रम के साथ endothelial कोशिकाओं की पहचान लेबल एक एंटीबॉडी विरोधी PECAM या बीएसआई - lectin के हैं. Perivascular सेल इस ऊतक में इस्तेमाल किया मार्करों NG2, desmin, एस.एम. α actin, PDFGRβ, और वर्ग β-ट्यूबिलिन III शामिल हैं. नीचे, धारा 3.3 में, हम वर्णमिति और फ्लोरोसेंट PECAM immunolabeling के प्रोटोकॉल के लिए प्रोटोकॉल सूचीबद्ध किया है.
  2. प्रारंभिक प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन से पहले, स्लाइड अतिरिक्त बफर समाधान निकालने के लिए सूखे वैक्यूम कर रहे हैं. इसके अलावा, ऊतकों शुरू एक मोम कलम के साथ रेखांकित कर रहे हैं एंटीबॉडी के समाधान के अनियंत्रित प्रवाह ऊतक से दूर रोकने के. अंत में, सभी लेबलिंग चरणों धोने चरणों द्वारा पीछा कर रहे हैं. चरणों को धोने के लिए, स्लाइड धुंधला जार के अंदर रखा जाता है. बफर समाधान धोने अवधि के दौरान 3 बार बदल जाता है.
  3. Endothelial सेल एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रियाओं: <पी वर्ग> = "jove_step" PECAM वर्णमिति Lableing

    1. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन: 100-200 लगभग एमएल प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1:200 माउस मोनोक्लोनल biotinylated CD31 प्रतिरक्षी बफर में पतला एंटीबॉडी (पीबीएस + 2% BSA में 0.1% Saponin) के) प्रत्येक ऊतक के शीर्ष पर ड्रिप, सुनिश्चित करें कि पूरे ऊतक एंटीबॉडी समाधान के साथ कवर किया. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन.
    2. पीबीएस 30 मिनट के लिए 0.1% में saponin के साथ ऊतकों को धो लें.
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन: ड्रिप माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (वेक्टर प्रयोगशालाओं से VECTASTAIN संभ्रांत एबीसी समाधान, एक streptavidin peroxidase माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान) ऊतकों के शीर्ष पर. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    4. पीबीएस 30 मिनट के लिए 0.1% में saponin के साथ ऊतकों को धो लें.
    5. 15 मिनट के लिए वेक्टर नोवा लाल के साथ ऊतकों को सेते हैं. तो पानी के साथ ऊतकों की वृद्धि.
    6. माउंट स्लाइड: 95% इथेनॉल में डुबकी स्लाइड 10 बार. विसर्जित 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड. एक और 100% इथेनॉल में विसर्जित स्लाइड इतना2 मिनट के लिए lution. फिर लगातार 2 मिनट प्रत्येक के लिए 100% xylene समाधान में विसर्जित स्लाइड. सूखी और VectaMount की एक पतली परत और एक coverslip साथ ऊतकों को कवर करने की अनुमति दें.

    PECAM फ्लोरोसेंट लेबलिंग

    1. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन: 100-200 लगभग एमएल प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1:200 माउस मोनोक्लोनल biotinylated CD31 प्रतिरक्षी बफर में पतला एंटीबॉडी (पीबीएस + 2% BSA में 0.1% Saponin) के) प्रत्येक ऊतक के शीर्ष पर ड्रिप, सुनिश्चित करें कि पूरे ऊतक एंटीबॉडी समाधान के साथ कवर किया. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन.
    2. पीबीएस 30 मिनट के लिए 0.1% में saponin के साथ ऊतकों को धो लें.
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन: ड्रिप माध्यमिक एंटीबॉडी (ऊतकों के शीर्ष पर समाधान (1:100 streptavidin-Cy3 प्रतिरक्षी बफर में पतला (पीबीएस + 2% BSA में 0.1% Saponin) के) के 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    4. पीबीएस 30 मिनट के लिए 0.1% में saponin के साथ ऊतकों को धो लें.
    5. माउंट स्लाइड: 50:50 पीबीएस ऊतकों के शीर्ष पर ग्लिसरॉल के साथ ड्रिप. कवरकवर पर्ची के साथ. फिर, उपयोग के लिए कवर पर्ची और स्लाइड के बीच की खाई को सील करने के लिए नेल पॉलिश.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चूहा अन्त्रपेशी immunohistochemically PECAM के लिए लेबल के ऊतकों के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3 में प्रदर्शित कर रहे हैं. PECAM लेबलिंग में microvascular नेटवर्क remodeling के पदानुक्रम के साथ सभी पोत प्रकार को पहचानती है और विशिष्ट समय अंक के बाद उत्तेजना में angiogenic मैट्रिक्स यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. PECAM लेबलिंग भी arterioles बनाम venules का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है. दूध पिलाने की arterioles आम तौर पर छोटे व्यास बनती venules (चित्रा 4) की तुलना में हैं और लम्बी endothelial सेल morphology दिखा रहे हैं. Capillaries और केशिका अंकुरित उनके पोत व्यास और एक नेटवर्क के भीतर सापेक्ष स्थिति के आधार पर पहचाना जा सकता है. Remodeling के नेटवर्क की विशिष्ट विशेषताओं में शामिल हैं वृद्धि हुई अंकुरण केशिका पोत घनत्व, vascularized क्षेत्र और venular tortuosअल्पसंख्यक. विभिन्न वाहिकाजनक मैट्रिक्स के नेटवर्क के विकास (चित्रा 5) की मात्रा का ठहराव समय पाठ्यक्रम को पहचानती है. दिन 3 और 5 दिन और दिन 10 से unstimulated स्तर के लिए रिटर्न के बीच पहले से मौजूद है, जहाजों चोटियों से अंकुरण केशिका. अंकुरण में यह क्षणिक वृद्धि संवहनी घनत्व और vascularized क्षेत्र में बढ़ जाती है के द्वारा पीछा किया जाता है. इस मॉडल में बड़े जहाजों की remodeling के लिए सबूत के रूप में, समय के पाठ्यक्रम पर धमनिका और venule क्षेत्रों की संख्या भी बढ़ जाती है.

हमारी प्रयोगशाला में, इस मॉडल के इस remodeling के 10 प्रक्रिया है, 11 के दौरान विशिष्ट समय बिंदु पर सेलुलर प्ररूपी परिवर्तन की पहचान के लिए प्रयोग किया गया है. उदाहरण के लिए, वर्ग β-ट्यूबिलिन III pericytes angiogenic वाहिकाओं के साथ (चित्रा 6) को पहचानती है. Unstimulated ऊतकों में वर्ग तृतीय अभिव्यक्ति β-ट्यूबिलिन तंत्रिका विशिष्ट है. इसके विपरीत, अंकुरण केशिका के चोटी के दौरान, वर्ग β-ट्यूबिलिन III perivascular कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है. इस प्रकारपरिणाम की यह सरल और मजबूत angiogenic मॉडल के उपयोग उपन्यास सेल angiogenic प्रक्रिया में शामिल प्रकार की पहचान पर प्रकाश डाला गया.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्लास्टिक चरण से पहले और बाद के संशोधन की छवियाँ. पूर्व संशोधित चरण एक 100 मिमी पेट्री डिश है. संशोधन केंद्र में एक अण्डाकार छेद में कटौती और क्ले मॉडलिंग या सिलिकॉन गोंद के बाद एक उठाया, चिकनी सतह के निर्माण के लिए छेद के किनारे के अलावा शामिल हैं. यह सतह एक आंतरिक सीमा है कि exteriorized mesenteric खिड़कियों की superfusion की सुविधा प्रदान करता है. पैमाने बार 1 सेमी है.

चित्रा 2
चित्रा 2 exteriorized mesenteric क्षेत्र की छवि. Mesenteric विंडोज़ धमनी / शिरा छोटी आंत खिला जोड़े के बीच पतली पारदर्शी झिल्ली के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. बाह्यीकरण दौरानअवधि, mesenteric क्षेत्र से बाहर रखा जाता है और एक संशोधित पेट्री डिश के अंदर खारा में डूबे. निष्क्रिय पीले क्ले मॉडलिंग करने के लिए पूर्व में कटौती छेद के माध्यम से खींचा जा अन्त्रपेशी के लिए एक चिकनी सतह प्रदान करता है. पैमाने बार 1 सेमी है.

चित्रा 3
3 चित्रा, unstimulated ऊतकों और 3 पर अन्त्रपेशी के ऊतकों और 10 दिनों के बाद बाह्यीकरण से mesenteric microvascular नेटवर्क की प्रतिनिधि छवियाँ. PECAM लेबलिंग microvascular नेटवर्क के सहित, (ए) arterioles, venules (वी) और capillaries (सी) के पदानुक्रम की पहचान की. पोस्ट उत्तेजना, microvascular नेटवर्क केशिका (तीर सिर) अंकुरण और पोत घनत्व में वृद्धि का प्रदर्शन किया. पैमाने पर पट्टी 100 माइक्रोन है.

चित्रा 4
चित्रा 4 धमनिका / venule जोड़े वयस्क चूहे mesenteric microvascular नेटवर्क के भीतर प्रतिनिधि छवियोंहै. दोनों छवियों में, arterioles (ए) एक छोटे सापेक्ष व्यास और लम्बी endothelial सेल आकारिकी पर आधारित venules (वी) से विभेदित किया जा सकता है. स्केल सलाखों 20 माइक्रोन हैं.

चित्रा 5
5 चित्रा में microvascular विकास के बाद अन्त्रपेशी बाह्यीकरण के समय के पाठ्यक्रम पर angiogenic मैट्रिक्स के प्रतिनिधि मात्रा का ठहराव. ) एक ऊतक क्षेत्र के प्रति संवहनी क्षेत्र. बी) संवहनी क्षेत्र के प्रति केशिका अंकुरित की संख्या. सी) संवहनी क्षेत्र के प्रति कुल संवहनी लंबाई. * Unstimulated समूह की तुलना में महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करता है. सांख्यिकीय तुलना एक मार्ग डन परीक्षण के बाद एनोवा का उपयोग किया गया. (पी <0.05). संयुक्त राष्ट्र unstimulated का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 6
चित्रा 6 unstimulated ऊतकों और ऊतकों से 3 और 10 प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट mesenteric microvascular नेटवर्क की छवियों.दिन अन्त्रपेशी की बाह्यीकरण पोस्ट. Immunofluorescent PECAM लेबलिंग (लाल) endothelial कोशिकाओं की पहचान है, और तीसरी श्रेणी लेबलिंग β-ट्यूबिलिन (हरा) (तीर सिर) नसों और perivascular कोशिकाओं (तीर) को दिखाता है. Perivascular कोशिकाओं transiently अंकुरण केशिका के दौरान वर्ग β-ट्यूबिलिन III upregulate. Unstimulated microvascular नेटवर्क में, वर्ग β-ट्यूबिलिन III तंत्रिका विशिष्ट है और है perivascular कोशिकाओं की पहचान नहीं है. 3 दिनों के बाद उत्तेजना, वर्ग III β-ट्यूबिलिन सकारात्मक microvessels साथ perivascular कोशिकाओं लेबल. 10 दिन तक, वर्ग III अभिव्यक्ति β-ट्यूबिलिन पैटर्न unstimulated परिदृश्य पर लौटने के लिए शुरू होता है. पैमाने बार 50 माइक्रोन है.

7 चित्रा
7 चित्रा ट्रैकिंग में microvascular नेटवर्क अन्त्रपेशी बाह्यीकरण द्वारा प्रेरित विकास के दौरान पूर्व लेबल स्थानीय रूप से लागू कोशिकाओं की व्यवहार्यता का समर्थन छवियाँ. कोशिकाओं mesenter अधिक superfused किया गयाआईसी विंडोज़ 20 मिनट बाह्यीकरण अवधि के दौरान. 1 दिन के बाद सर्जरी, DiI लेबल की कोशिकाओं (लाल) PECAM सकारात्मक microvessels (हरा) के साथ डैम फोकल हवाई जहाज़ में मनाया गया. DiI लेबल अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की ए, बी) उदाहरण गोल और प्रदर्शन लम्बी morphologies. कुछ मामलों में कोशिकाओं (तीर) microvessels साथ लम्बी गया. सी) उदाहरण DiI के एक क्लस्टर के अंकुर (तीर) केशिका की नोक के पास mesenchymal स्टेम सेल लेबल. स्केल सलाखों 50 (ए), माइक्रोन और 20 माइक्रोन (बी, सी) हैं.

Discussion

बाह्यीकरण मॉडल 2006 की रिपोर्ट में किया गया था और पिछले यांत्रिक angiogenesis को 4-7 की चोट चूहा अन्त्रपेशी मॉडल से अनुकूलित है और अच्छी तरह से स्थापित आईपी इंजेक्शन मॉडल है कि 9 अन्त्रपेशी चूहे का लाभ ले करने के लिए इसी तरह के परिणाम का उत्पादन. 20 मिनट बाह्यीकरण समय प्रयोगात्मक एक मजबूत वाहिकाजनक प्रतिक्रिया का निर्माण करने के लिए निर्धारित किया गया था. जबकि इस समय अवधि अलग किया जा सकता है, यह angiogenic inhibitors के स्थानीय यंत्रवत अध्ययनों और सेल वंश पढ़ाई के लिए बहिर्जात कोशिकाओं के प्रत्यक्ष आवेदन के लिए 4 आवेदन के लिए अनुमति है. Mesenteric ऊतक remodeling के में सेल समावेश की व्यवहार्यता पूर्व लेबल अस्थि मज्जा की कोशिकाओं और mesenchymal स्टेम सेल (चित्रा 7) का उपयोग कर, हमारी प्रयोगशाला में प्रारंभिक अध्ययन और मानव वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं के इंजेक्शन 14 आईपी के भाग्य की जांच की सफलता के द्वारा समर्थित है . हमारी प्रयोगशाला में, हम इस मॉडल का इस्तेमाल किया है pericyte phen की पहचानangiogenic 10 प्रतिक्रिया के समय के पाठ्यक्रम पर और 12 उच्च रक्तचाप के रूप में रोग की स्थिति, के दौरान angiogenic क्षमता का आकलन otypic बदलता है. angiogenic प्रतिक्रिया और सेल phenotype के इस मॉडल के साथ जुड़े परिवर्तन भी अन्य चूहा mesenteric पुरानी hypoxia के 10 प्रदर्शन, 11 सहित angiogenic मॉडल में मनाया जा सकता है.

बाह्यीकरण मॉडल की एक सीमा है कि angiogenesis के सटीक ट्रिगर तंत्र अज्ञात है. अन्त्रपेशी की बाह्य अनुभूति मस्तूल सेल degranulation के और वृद्धि histamine के 6 स्तरों जोड़ा गया है, फिर भी आगे की जांच पड़ताल करने के लिए और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. angiogenic प्रोत्साहन निस्संदेह बहु भाज्य है, एक microvascular नेटवर्क के पदानुक्रम भर में एक मजबूत remodeling प्रतिक्रिया उत्पादन. जबकि अज्ञात तंत्र इस मॉडल का एक प्रमुख आलोचना रहते हैं, अपने reproducibility और सादगी सेलुलर गतिशीलता पूर्णकालिक अध्ययन के दो साल जुड़ी हुई है की पहचान करने के लिए इसे आकर्षक बनानास्वाभाविक जटिल केशिका अंकुरण प्रक्रिया में वेद है. मॉडल के reproducibility में microvascular नेटवर्क कई चूहे उपभेदों के पार (पुरुष Wistar और Sprague Dawley महिला) हमारे 10 प्रयोगशाला, 12 से पहले से प्रकाशित अध्ययन में विकास के समय पाठ्यक्रम पर तुलनीय angiogenic के मैट्रिक्स द्वारा समर्थित है. के बाद से, वयस्क चूहे mesenteric ऊतकों के बहुमत vascularized, मॉडल भी कई पशु के प्रति जांच की जा ऊतकों के लिए अनुमति देता है. दुर्भाग्य से, इस मॉडल को स्पष्ट रूप से आनुवंशिक माउस मॉडल लागू करने के लिए के रूप में माउस mesenteric विंडोज़ कम देशी vascularization है और हमारे अनुभव में, सामान्यतः नमूदार शाखाओं में नेटवर्क की कमी नहीं है. भविष्य अनुप्रयोगों विशिष्ट समय बिंदुओं पर अंतर महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी का उपयोग angiogenesis के दौरान पोत कार्यक्षमता की जांच और संबंधित सेलुलर lymphangiogenesis और neurogenesis में शामिल गतिशीलता की जांच शामिल हैं. हालांकि mesenteric खिड़की प्रति देशी vascularization की हद तक rou हो रहा हैghly उम्र के साथ आनुपातिक है, हम 4-5 सप्ताह की उम्र के रूप में युवा के रूप में पुरुष Wistar चूहों में microvascular नेटवर्क के शाखाओं में मनाया. इन टिप्पणियों का सुझाव कि बाह्यीकरण मॉडल भी उम्र भर angiogenic मतभेदों की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

और Tulane उच्च रक्तचाप और गुर्दे उत्कृष्टता के केंद्र NIH अनुदान द्वारा वित्त पोषित P20RR017659 08 (पीआई: यह काम राज्य लुइसियाना (2009-12) LEQSF आरडी A-19 (WL Murfee PI) के प्रतिनिधियों की बोर्ड द्वारा समर्थित किया गया एल Navar गेब्रियल).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12"x12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instruments Co. RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge;0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length
4-0 suture Ethicon Inc. 699G (1.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
5-0 suture Ethicon Inc. 8556 (1.0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blue Monofilament
7-0 suture Ethicon Inc. 1647G (0.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
Castroviejo Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-02 Tip Width:0.6mm
Clamping Length:5mm
Length:9cm
Straight tip
Castroviejo Needle Holder Fine Science Tools 12565-14 Tip Shape:Straight
Tip Width:1.5mm
Clamping Length:10mm
Scissors:No
Lock:Yes
Length:14cm
Serrated:Yes
Scalpel Handle Roboz Surgical Instruments Co. RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-13 Beveled Ridge, Slippable
Table of Specific Surgical Materials and Tools.
Beuthanasia Merck & Co. MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium
Ketamine Fort Dodge Animal Health MWI #: 000680 Kateset 100 mg/ml
Xylazine Lloyd, Inc. MWI #: 009307 Anased 100 mg/ml (Ordered from MWI Veterinary Supply)
Saline Hospira Inc. 94-217-JT
PBS Sigma-Aldrich 011M8207
Saponin Sigma-Aldrich BCBB4080
PECAM (CD31) BD Biosciences 553371
Streptavidin-CY3 Jackson ImmunoResearch 016-160-084
BSA Jackson ImmunoResearch 096555
VECTASTAIN Elite ABC Vector Laboratories PK-6100
Vector Nova Red Vector Laboratories SK-4800
VectaMount Vector Laboratories H-500
Table of Specific Reagents

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References

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  4. Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo. J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).
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चूहा अन्त्रपेशी बाह्यीकरण: सेलुलर angiogenesis में शामिल गतिशीलता जांच के लिए एक मॉडल
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Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).More

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).

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