Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

استعمال الدوائي، التحدي الرنين المغناطيسي الوظيفي في مرحلة ما قبل السريرية للبحوث: بالتطبيق على النظام 5-HT

doi: 10.3791/3956 Published: April 25, 2012

Summary

الهدف من هذه التقنية هو لتقييم وظيفة السيروتونين الناقل العصبي (5-HT) في الحيوانات الحية والحرة في التنفس، مع الدوائية التصوير بالرنين المغناطيسي (phMRI) وتحديا في الوريد مع مثبطات امتصاص السيروتونين الانتقائية (SSRI)، فلوكستين.

Abstract

الدوائية التصوير بالرنين المغناطيسي (phMRI) هو وسيلة جديدة واعدة لدراسة آثار المواد على وظائف المخ التي يمكن أن تستخدم في النهاية لكشف الآليات العصبية الحيوية الكامنة وراء عمل المخدرات والاضطرابات العصبية ذات الصلة، مثل الاكتئاب وADHD. مثل معظم أساليب التصوير (PET، SPECT، CT) فإنه يمثل تقدما في التحقيق في اضطرابات الدماغ وظيفة ذات الصلة من الممرات العصبية بطريقة غير الغازية مع الاحترام للاتصال والعصبية عموما. وعلاوة على ذلك فإنه يوفر أيضا أداة مثالية للترجمة إلى التحقيقات السريرية. التصوير بالرنين المغناطيسي، في حين لا يزال وراء استراتيجيات في التصوير الجزيئي مقارنة PET و SPECT، لديه ميزة كبيرة لديهم ارتفاع القرار المكانية وهناك حاجة للحقن من وكيل أو على النقيض من جزيئات الراديو المسمى، وبالتالي تجنب التعرض المتكرر إلى الإشعاعات المؤينة . ويستخدم على نطاق واسع وظيفية التصوير بالرنين المغناطيسي (الرنين المغناطيسي الوظيفي) في إعداد البحوث والسريرية، حيث أنه من زجنبا إلى جنب مع enerally مهمة النفسية والحركية. phMRI هو التكيف من الرنين المغناطيسي الوظيفي تمكن من تحقيق وجود نظام عصبي معين، مثل السيروتونين (5-HT)، في ظل ظروف فيزيولوجية أو مرضية بعد تفعيل عن طريق إدارة المخدرات تحديا محددة.

والهدف من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو تقييم المخ 5-HT وظيفة في التنفس الحرة الحيوانات. من خلال تحدي النظام 5-HT في حين الحصول على وظيفية صور الرنين المغناطيسي في وقت واحد على مر الزمن، لا يمكن للاستجابة من الدماغ لهذا التحدي يمكن تصور. وقد أثبتت العديد من الدراسات على الحيوانات بالفعل أن المخدرات التي يسببها ارتفاع في مستويات من خارج الخلية على سبيل المثال 5-HT (وكلاء الإفراج، الانتقائية إعادة امتصاص حاصرات، الخ) تستثير منطقة معينة التغيرات في مستوى الأوكسجين في الدم اشارات التصوير بالرنين المغناطيسي التي تعتمد (غامق) (إشارة بسبب إلى تغيير في مستويات خضاب الدم المؤكسج / امؤكسج التي تحدث أثناء تنشيط المخ من خلال زيادة تدفق الدم لإمداد الأوكسجين وزlucose إلى الخلايا العصبية مطالبين) وتوفير فهرس وظيفة النواقل العصبية. وقد تبين أيضا أن يمكن عكس هذه الآثار من خلال العلاجات التي الانخفاض 5-HT توفر 16،13،18،7. في الفئران البالغين، وقد وصفت التغييرات إشارة BOLD بعد الحاد SSRI الادارة في عدة 5-HT مناطق الدماغ ذات الصلة، والمناطق القشرية أي الحصين، تحت المهاد والمهاد 9،16،15. ويمكن تنشيط النظام 5-HT وردها على هذا التحدي وبالتالي تستخدم كمقياس لوظيفته في كل من الحيوانات والبشر 2،11.

Protocol

إعداد الحيوان للتصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير في الجسم الحي

1. الجراحية كيفية تركيب الكانيولا

  1. تخدير الفئران (ذكور ويستار الفئران، 200-300 ز) مع (الاستقراء 5٪ ثم خفضت الى 1،5-2٪ للصيانة من التخدير خلال إعداد الحيوانية والمسح الضوئي) isoflurane تعطى في الهواء الطبية (21٪ O BOC المملكة المتحدة) . تأكد من أن هذا الحيوان هو تخدير جيدا ويسلك أي رد على قرصة اصبع القدم. ومقنى في شريان الفخذ والوريد للغاز في الدم وقياس ضغط الدم والإدارة للتحدي المخدرات على التوالي. خلال العملية الجراحية، ويتم رصد درجة حرارة جسم الحيوان والمحافظة عليه من خلال التحقيق الذي تجريه المستقيم وبطانية الحرارية (هارفارد جهاز).
  2. يتم وضع تخدير الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس تحت المجهر تشريح في الاستلقاء الظهري. حلق منطقة منتصف الفخذ، ومسحة من الجلد مع الكحول. جعل الجلد سم 2 شق على طول تجعد التي شكلتها البطن والفخذ الأيمن.ويستخدم تشريح حادة في العضلات المقربة لتصور الشريان الفخذي، وريد والعصب الفخذي. فصل بعناية السفن.
  3. ربط ربطة حرير بلطف تماما قرب نهاية البعيدة للسفينة ووضع آخر التعادل مع نصف عقدة جراحية فضفاضة في موقع القريبة. تطبق الجر لكلا الحروف المركبة، لتسد تدفق الدم في الجزء الأوسط المتبقي من سفينة تتعرض بين الحروف المركبة. جعل شق صغير من حوالي ثلث محيط السفينة في هذا الجزء من السفن للسماح ادراج PE-50 قنية (0.54 مم القطر الداخلي و0.96mm لقطرها الخارجي في حالة من الفئران الذكور البالغين، وإلا 0،40 ملم ومعرف 0،80 ملم ED) في الإناء.
  4. وينبغي إدراج قنية ملم عدة (على الأقل 5) في الإناء. مرة واحدة في التجويف، تدفق كمية صغيرة من المياه المالحة heparinized (15 UI / مل) من خلال السفينة لتجنب أي تشكيل من تجلط الدم. وligated أيضا في الحلقة القريبة من الحرير تماما لإصلاح قنية. REPEAT هذا الإجراء للسفينة الثانية. غراء الجلد باستخدام لاصق الأنسجة Vetbond (3M المملكة المتحدة المجلس التشريعي الفلسطيني، براكنيل، المملكة المتحدة) على حد سواء عندما cannulas في مكانها الصحيح. انظر الشكل 1 للوضع الدقيق للcannulas.
  5. وضع الحيوان في المجسم MR السرير متوافقة (M2M التصوير كورب، الولايات المتحدة الأمريكية) في وضعية الرقود. المحافظة على رأس الحيوان من خلال إدخال قضبان الأذن وبار الأسنان. عند هذه النقطة، يمكن وضع هذا الحيوان في الماسح الضوئي لتصوير بالرنين المغناطيسي. الحيوان لا يزال تخدير وغير خالية من التنفس في جميع أنحاء الإجراء التصوير كله.

2. الرصد

أثناء إجراء تصوير كامل، ينبغي أن الاستجابات الفسيولوجية عدة لرصد مستمر وثابت أن تبقى كما قدر الإمكان. هذا أمر ضروري، لأن هذه الردود يمكن أن تختلف بشكل كبير على مدى إطار نفس الوقت إشارة phMRI وتؤثر أيضا على إشارة من الاهتمام. من المهم أيضا، بالنظر إلى أن سيتم وضع الحيوانات في أماهGNET، وبالتالي بعيدا عن الأنظار وغير قابلة للفحص مستوى عمق مخدر (مثل قرصة اصبع القدم)، لضمان كاف مخدر عمق. بالإضافة إلى ذلك، نظرا إلى أن العديد من الأدوية تغير معالم القلب والأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم، وقياس هذه أمر بالغ الأهمية لضمان ويمكن أن تؤخذ في الاعتبار الآثار الفسيولوجية عمل عالمية للعقار في البيانات phMRI. انظر أيضا القسم (4) لقيم خط الأساس والردود المتوقعة على ضخ فلوكستين مغ / كغ 5.

  1. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم عند 37 ± 1.5 درجة مئوية عن طريق نظام تسخين الهواء الدافئ (SA الآلات، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). أن تكون على علم بأن السيد التصوير يمكن أن تؤثر على قياس درجة الحرارة، والتحقق من هذا مع النظام الخاص بك.
  2. رصد وتسجيل معدل الحيوان التنفس باستخدام الكفة في الجهاز التنفسي بالإضافة إلى جهاز استشعار الضغط (SA الآلات، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية).
  3. تسجيل الغازية ضغط الدم الشرياني باستخدام محول الضغط (TSD104A، Biopac أنظمة كورب، الولايات المتحدة الأمريكية)، وسحب دوريا 1د تحليل عينات من غاز الشرايين الدموية (RapidLab وسيمنز للتشخيص) عن طريق الشريان الفخذي مقنى أثناء التصوير لرصد PCO الشرايين (2) والضغط الجزئي للأكسجين (ص 2).
  4. استخدام الوريد الفخذي مقنى باعتبارها خط ضخ رئيسي للتحدي الدوائية (فلوكستين (هيدروكلوريد فلوكستين من سيغما الدريخ، المملكة المتحدة) حل، 5 مغ / كغ، الذائبة في المياه المالحة).

في الجسم الحي التصوير

ويرد التمثيل التخطيطي للإعداد التجريبية الرنين المغناطيسي الوظيفي في الشكل 2.

3. معلمات التصوير

  1. مرة واحدة يتم وضع الحيوان داخل الماسح الضوئي، ولا تزال تظهر الاستجابات الفسيولوجية مستقرة، يمكن أن يبدأ التصوير. في دراساتنا، استخدمنا 4،7 T صغير نظام التصوير بالرنين المغناطيسي الحيوانية (اجيلنت التكنولوجيات) مع التربيع أسطواني نقل / استقبال الترددات اللاسلكية لفائف بقطر 72 ملم الداخلية (M2M التصوير كورب، الولايات المتحدة الأمريكية). جعل الكشفية الطائرة الثلاثة صورة إلى ف بشكل صحيحosition الدماغ في منتصف حقل التصوير بالرنين المغناطيسي من عرض واستخدام مترجم تصحيح الرقائق (تسلسل fastmap) لتحسين التجانس المجال المغناطيسي في الدماغ.
  2. لكل حيوان، والحصول على أول T2 المرجحة حجم صورة تشريحية لأغراض التسجيل وتجزئة. كنا صدى تدور توربو تسلسل مع طول القطار صدى = 8؛ مصفوفة حجم = 256 × 256؛ FOV = 50 × 50 مم مع اكتساب معشق من شرائح 30 الاكليلية متجاورة مع سماكة 1 ملم، وتركزت 8 ملم الذيلية إلى الحافة الخلفية من البصلة الشمية، المتوسطات = 4؛ TR / TE = 5112/60 مللي.
  3. تأكد من أن الحيوان استجاباته الفسيولوجية ثابتة قبل البدء في المسح phMRI. للمرة اكتساب سلسلة، استخدمنا نفس T2 المرجحة تدور الصدى توربو تسلسل مع طول القطار صدى = 16؛ مصفوفة حجم = 128 × 128، مع اكتساب معشق من 20 شرائح متجاورة مع سماكة 1 مم تركزت على موقف واحد؛ TR / TE = 4915/60 مللي. في المجموع، وحصلنا على نقاط 32 مرة مع 1cquisition مرة ثانية من 158 في سلسلة حجم الوقت والوقت مسح ما مجموعه 84 دقيقة. ويستخدم المجلد الأول بأنها "تفحص وهمية" لمعالجة آثار التشبع T1 وعدم استخدامها في تحليل البيانات. ويمكن أيضا تسلسل الرنين المغناطيسي الوظيفي الأخرى مثل الصدى الانحدار أو صدى مستو التصوير (EPI) متواليات يمكن استخدامها. تأكد لتقييم استقرار إشارة من تسلسل لكم الاختيار قبل بدء تجربتك.
  4. الحصول على عدد من أحجام خط الأساس، قبل إدارة الدواء التحدي. نقترح على الأقل 10 دقائق من اكتساب الأساس في ظل ظروف مستقرة. بدء ضخ في نفس الوقت بالضبط لجميع الحيوانات. في بروتوكول لدينا، بدأنا الادارة في بداية من حجم 9 (بعد حوالي 21 دقيقة المسح الأساسي). بعد التسريب، واصلت الحصول على الصور لمدة 60 دقيقة (32 مجلدات في المجموع). تأكد من أن فترة ما بعد التسريب غير طويلة بما يكفي لرؤية التغييرات والتوصل إلى حالة ثابتة أو استرداد الإشارة، حسب questi البحث الخاصة بكوعلى اختيارك للتحدي المخدرات.
  5. عندما يتم الانتهاء من الحصول على الصور، وإزالة الحيوان من الماسح الضوئي. إجراء غاز الدم نهائي قياس لضمان استقرار المعلمات غاز الدم وتمكين تقييم آثار المخدرات على علم وظائف الأعضاء الأساسية.

معالجة البيانات

4. الفسيولوجية الردود

الاستجابات الفسيولوجية المتوقع أن التحدي تعتمد على الدواء الذي تم اختياره. أدناه، وترد القيم الأساسية المقبولة عموما (من الفئران الذكور البالغين) والردود من المتوقع ان ضخ الرابع من فلوكستين مغ / كغ 5.

  1. وينبغي أن معدل التنفس يكون مستقرا في 45-75 الأنفاس / دقيقة. التحدي الدوائية للفلوكستين يدفع ارتفاع قصير (15-20٪) في معدل التنفس.
  2. وينبغي أن يكون ضغط الدم المستمر وبين 100-150 مم زئبق (Biopac أنظمة كورب، Goweta، الولايات المتحدة الأمريكية). التحدي فلوكستين يؤدي الى انخفاض حاد لكن قصير من نحو 20٪ في ضغط الدم الشرياني. وهذا ينبغي أن يتعافى في غضون 5-10 دقائق. ويظهر هذا في الشكل 3.
  3. وينبغي أن قيم غاز الدم تكون مستقرة (قياس مرتين على الأقل)، وضمن النطاقات التالية قبل البدء في المسح phMRI: PCO 35-45 مم زئبقي، ص 80-130 مم زئبق، درجة الحموضة، 7،35-7،45. دائما التحقق من هذه القيم مرة أخرى بعد المسح الضوئي لمعرفة ما اذا كان الحيوان ظلت مستقرة وتمكين تقييم آثار المخدرات على علم وظائف الأعضاء الأساسية. وارتفاع PCO 2 القيم حث توسع الأوعية، وسوف نشهد تغييرات وبالتالي تجنب إشارة جريئة.
  4. تأكد من أن هذا الحيوان هو تحت مستوى مستمرا وثابتا من التخدير (2 ± 0.25٪، مستويات أعلى يمكن أن يسبب الاكتئاب من التفاعل الدماغية والتخدير غير كاف، وبالتالي أقل حركة)، قبل البدء في المسح phMRI والأهم من ذلك، تجنب أي تعديلات في ويمكن النظام التخدير (على سبيل المثال٪ isoflurane و / أو تدفق الغاز) خلال الحصول على الصور وظيفية وهذا يؤثر أيضا على إشارة جريئة.

معشوقة = "jove_title"> 5. البيانات وتجهيزها والتصوير بالرنين المغناطيسي

نحن هنا وصف العديد من الخطوات في تجهيزها للبيانات MR من أجل optimalize البيانات للتحليل الإحصائي. نذكر الأدوات التي يتم استخدامها في المختبر، ولكن أدوات مختلفة كثيرة متاحة.

5.1 إعداد البيانات

  1. وضع الصور الخام في الشكل الصحيح لملف البرنامج تحليل التصوير بالرنين المغناطيسي الذي كنت تفضل استخدام (NIfTI1.1 أو Analyze7.5 شكل لبرامج FSL). تحويل ملف عدة برامج مجانية على شبكة الإنترنت. اعتمادا على الماسح الضوئي المستخدم، قد يكون من الضروري لبناء أول 3D (مسح التشريحية) أو 4D (phMRI المسح) صورة من جميع شرائح 2D منفصلة. يمكن القيام بذلك باستخدام برنامج معالجة الصور، مثل يماغيج 1.
  2. من أجل ضمان التوافق مع خوارزميات تحليل مصممة للاستخدام مع البيانات البشرية (مثل برامج FSL)، فوكسل حجم يجب أن مضروبا في عامل 10 (ويمكن أيضا أن يتم ذلك على سبيل المثال باستخدام يماغيج). في دراستنا، أدى هذا في حجم فوكسل من 3.91 X 3.91 X 10 ملم 3.
  3. تحقق بصريا الصور الخاصة بك لمخالفات في التوجه، والمصنوعات اليدوية، والحركة. يجب الحرص على عدم استخدام المسح الضوئي مع القطع الأثرية واضحة أو حركة مفرطة في التحليلات الخاصة بك لأنها سوف تشوه لك النتائج.
  4. وينبغي أن توجه جميع بالاشعة تكون مماثلة بين الصور التشريحية والوظيفية والتوافق مع الدماغ المرجعية المستخدمة. في دراستنا، وكنا في الدماغ الفئران المجسم قالب التي وصفها شفارتز 14. ويمكن استخدام الأمر FSL fslswapdim لإعادة توجيه.

5.2 الحركة تصحيح

  1. لتصحيح أي حركة القطع الأثرية في السلسلة الزمنية 4D، استخدمنا أداة تصحيح McFlirt الحركة (تصحيح الحركة باستخدام FMRIB في صورة التسجيل خطي أداة، وهي جزء من مكتبة برامج FMRIB، و www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT هو تصحيح الحركة داخل قصر مشروط أداةigned للاستخدام على سلسلة زمنية الرنين المغناطيسي الوظيفي، وبناء على التحسين والتقنيات المستخدمة في تسجيل اللعوب، أداة مؤتمتة بالكامل لخطي (أفيني) المتعدد الوسائط الدماغ تسجيل صورة. تحقق دائما وبعد ذلك إذا كانت النتيجة مرضية.

5.3 تقسيم المخ

  1. حذف جميع أنسجة الدماغ من غير صورة للرئيس كامل لكل من السلسلة الزمنية 4D كصورة التشريحية 3D. لهذا استخدمنا BET أداة FSL (المخ استخراج ضد أداة 2.1، جزء من مكتبة برامج FMRIB، و www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). يتم وضع الإعدادات الافتراضية للاستخدام مع عقل الإنسان، وبالتالي ليست مثالية للدماغ الفئران. كنا المعلمات التالية: كسري عتبة كثافة، و = 1.0؛ التدرج العمودي في عتبة كثافة كسور، ز = 0.1، ورئيس دائرة نصف قطرها (مم)، ص = 175 بالنسبة لمعظم الحيوانات. إذا لزم الأمر، يمكنك تحسين هذه القيم في هذا الموضوع.

6. s تحليل البياناتق

الهدف من التحليل الإحصائي للبيانات MR هو تحديد voxels التي تظهر الفرق إضافية تعزى إلى مستوى التحدي المخدرات بطريقة قوية إحصائيا. الأساليب المنهجية المختلفة المتاحة لهذا، وحتى حزم البرامج numerable. واختيارك يتوقف على توافر البرمجيات والمعرفة / تجربة في المختبر الخاص بك وسؤالك بحثية محددة. هنا نعطي الأسلوب المقترح كما يستخدم في المختبر.

6.1

  1. قبل تحليل البيانات التصوير بالرنين المغناطيسي، وتحديد نموذج عام الخطي (GLM) حيث سيتم تزويد البيانات. هذا يمكن ان يكون مربع بسيط على الخروج نموذج (إيقاف لمرحلة ما قبل المخدرات وعلى لمرحلة ما بعد تسريب المخدرات) أو نموذج معين، استنادا إلى البيانات. وقد استخدمنا هذا البرنامج حفز 21 لتحديد نموذج GLM بيانات القاعدة.
  2. تنفيذ اثنين من عينة اختبار (ت) (على سبيل المثال في تحفيز) على كافة وحدات التخزين الأساسية مقابل كافة وحدات التخزين في مرحلة ما بعد التحدي. اختياريا، وترك سالتحرير المجلد الأول (ق) وحجم يمنح خلالها التحدي، ومنذ تلك قد لا تمثل حالة استقرار التصوير. بعد ذلك، تميز كل voxels مع أكثر من تغيير بعض٪ من خط الأساس. استخدمنا كل voxels مع نسبة التغيير أكثر من 1.
  3. ، متوسط ​​الدورة المقبلة في وقت voxels كل هذه، والتي تعطي انطباعا مسبقا من شكل نموذج. ويمكن بهذه الطريقة يتم تحديد ما إذا التحدي 1) له تأثير فوري أو مؤجل، 2) إذا وعندما يكون تأثير يصل إلى هضبة و / أو الذروة و، 3) إذا كان أو عندما يكون تأثير ينخفض ​​مرة أخرى خلال وقت تفحص. وتظهر الأمثلة في الشكل 4A و 4B.

6.2

والخطوة التالية هي بعد ذلك لاختبار إحصائيا في الوقت 4D الخام صورة سلسلة من كل حيوان ضد النموذج السابق GLM المعمول بها. لهذا، استخدمنا برنامج FSL الفذ (FMRI أداة تحليل الخبراء، v5.98) 17،24. ومع ذلك، وغيرها من أدوات تحليل الرنين المغناطيسي الوظيفي لعن توافربلي كذلك. ضمن أداة التحليل، وتحليل المستوى الأول لابد من اقامة. وهذا يتطلب الخطوات التالية:

  1. تأكد من استخدام نفس الإعدادات لكل حيوان. وقد اخترت لحذف الأولى (2) وحدات التخزين قبل التحليل، منذ قد لا الحالة المستقرة التصوير يتم التوصل حتى الآن في تلك المرحلة. تعيين TR، وهذا هو الوقت (بالثواني) بين بداية كل وحدة تخزين على التوالي. منذ كنت تبحث في الآثار التي قد تستمر لوقت مسح كامل، ليست هناك حاجة لوضع فلتر تمريرة عالية أو منخفضة.
  2. تمهيد مكانيا البيانات من أجل الحد من الضجيج وتحسين إشارة إلى نسبة (SNR) ضوضاء. اخترنا نواة FWHM من 8 ملم.
  3. الآن تشغيل نموذج GLM المطلوب على البيانات الخاصة بك. وهذا هو المتغير التفسيري الرئيسي (EV)، أي الموجي كنت اختبار بياناتك ضد. يمكن رؤية GLM التي كانت مصممة على أساس البيانات الخاصة بنا في 4C الشكل. وهناك أيضا إمكانية إضافة مزيد من الخلط بين EV مثل حركة المعلمات،الضوضاء المنخفضة التردد (الانجراف الماسح الضوئي) أو حتى المعلمات الفسيولوجية مثل ارتفاع ضغط الدم لإزالة العام الفسيولوجية للأدوية آثار.
    ضمن الفذ: استخدام prewhitening فيلم. إضافة مشتق الزمانية. في علامة التبويب التباين & F-الاختبارات، التي أنشئت على النقيض. لتحويل EV واحد في صورة إحصائية Z، تعيين قيمته النقيض إلى 1. هذا يتيح لك كل voxels التي يمكن من خلالها مسارها مرة وأوضح كبير من قبل GLM. وتعيين القيمة إلى -1 إعطاء تفعيل سلبي.
  4. بعد إجراء اختبار أولي الإحصائية، وصورة إحصائية الناتجة يحتاج إلى thresholded لإظهار التي يتم تنشيطها voxels أو مجموعات من voxels على مستوى أهمية خاصة. هناك حاجة إلى العديد من المقارنات تصحيح بسبب وجود عدد كبير من voxels الدماغ التي تم اختبارها. هذا الانجاز برنامج FSL يستخدم الآلي كتلة القائمة على تصحيح مقارنات متعددة استنادا إلى نظرية (جاوس حقل عشوائي) GRF 25.
  5. أخيرا، يجب أن تكون البيانات المكانية تطبيع إلى صورة مرجع، من أجل أداء وإحصاءات جماعة. أولا تسجيل بيانات وظيفية للحيوانات الدماغ استخراج صورة تشريحية ومن ثم إلى صورة مرجع. كنا في الدماغ الفئران المجسم قالب التي وصفها شفارتز (14)، في الدماغ إشارة.
  6. بعد هذا، يمكن الجمع بين التحليلات المستوى الأول من جميع الحيوانات في أعلى تحليلات (المجموعة) على المستوى الإحصائي. هذا يعتمد اعتمادا كبيرا على التصميم الخاص بك الدراسة الخاصة، وأسئلة البحث.

6.3

بعد هذا، يمكن الجمع بين التحليلات المستوى الأول من جميع الحيوانات في أعلى تحليلات (المجموعة) على المستوى الإحصائي. هذا يعتمد اعتمادا كبيرا على التصميم الخاص بك الدراسة الخاصة، وأسئلة البحث.

6.4

يمكن أن يقترن الاستجابات الفسيولوجية المخدرات أو ربطها إشارة MR، اذا شئت. انظر أيضا القسم 6.2.3 حول إضافة تفنيد EV ل.

7. ممثل النتائج

ove_content "> عندما المخدرات الصعبة (5 مغ / كغ الرابع فلوكستين) يدخل في الأوعية الدموية، وينبغي أن يكون ردا واضحا الفسيولوجية تكون واضحة في معدل التنفس (حتى)، وضغط الدم (لأسفل). هذه الردود تطبيع في المتوسط ​​في غضون 5-10 دقيقة في الشكل (3) هذا الانخفاض في ضغط الدم واضحة للعيان.

وينبغي في الوقت إشارة متوسط ​​بالطبع تظهر أساسية مستقرة نسبيا ولها تأثير واضح لهذا التحدي. ويفضل، وينبغي أن يكون هناك أي انحراف التحدي المستقلة في الإشارة. ويمكن رؤية مثال ممثل دورة إشارة متوسط ​​الوقت في الشكل 5A. القطع الأثرية، مثل الاكتئاب تنفس / فشل أو تغييرات في التخدير وغالبا ما تكون واضحة للعيان في الإشارة. والاكتئاب في الجهاز التنفسي تؤثر سلبا على إشارة في الدماغ كله. ويمكن ملاحظة هذا في الشكل 5B.

بعد تحليل المستوى الأول، من المتوقع أن نمط التفعيل لتكون إيجابية بشكل رئيسي والمحلىتيد في مناطق محددة فقط (المناطق القشرية أي الحصين، تحت المهاد والمهاد، وانظر الشكل 6A). إذا تم إلغاء تنشيط الدماغ كله، وهذا غالبا ما يكون مؤشرا على تخدير عميق جدا و / أو نقص الأوكسجين أثناء المسح. ويمكن رؤية مثال على هذا في الشكل 6B.

الشكل 1
الشكل 1. الموقع من موضع cannulas في شريان الفخذ والوريد.

الشكل 2
الشكل 2 تمثيل تخطيطي من الإعداد التصوير بالرنين المغناطيسي؛. جميع المعدات يجب أن يكون غير المغناطيسية، وهذا مرتبط إلى نظام وحدة الذي يسمح اكتساب بوابات صور تجنب التدخلات من الحركة نظرا ل/ والتنفس أو خفقان القلب. وينظم درجة حرارة الجسم أيضا من خلال وحدة التسخين لرصد ومراقبة درجة حرارة الحيوان أثناء التصوير. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر .

الشكل (3)
الشكل 3. سبيل المثال الممثل للبيانات ضغط الدم. هناك انخفاض واضح في ضغط الدم واضحة مباشرة بعد بدء ضخ (شريط أحمر). يتم الوصول إلى القيم الطبيعية مرة أخرى في غضون 10 دقيقة. بعد ادارة التحدي.

الشكل 4
الشكل 4. أ) نمط تفعيل المتوقعة باستخدام برنامج تحليل التصوير بالرنين المغناطيسي تحفيز (الأحمر هو تفعيل إيجابي، الأزرق هو تفعيل سلبية). B) طبعا معدل الوقت من كل voxels المنشط (≥ 1٪ من تغير خط الأساس) في جميع الحيوانات. C) مثال للنموذج GLM مما أدى إلى FSL / الفذ. الكلورإك هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية.

الشكل 5
الشكل 5.

  1. مثال على التفاعل الإيجابي. دورة الوقت في voxels المنشط (الحمراء) وبعد ما يقرب من شكل نموذج GLM. بدأ ضخ الدواء حول نقطة مرة 8.
  2. مثال لتفعيل السلبية في الدماغ كله بعد تخدير عميق جدا. دورة الوقت في voxels تنشيط سلبا (الأزرق) تبين انخفاض عام في إشارة وليس له تأثير من التحدي هو مرئي.

اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل (6)
الشكل 6.

  1. المتوقع تفعيل نمط بعد تحليل المستوى الأول. تفعيل مجموعات من voxels (الأحمر إلى ذellow)، إلا في مناطق محددة في الدماغ.
  2. مثال من "سيئة" نمط التنشيط. كل تنشيط الدماغ السلبية (الأزرق) في نفس الحيوان كما في الشكل 5B.

Discussion

5-HT phMRI هو أداة واعدة لتقييم وظيفة النواقل العصبية في الحيوانات في الجسم الحي. انه يتصور استجابة المخ لتحد 5-HT مع التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي. التصوير بالرنين المغناطيسي لديه ميزة كبيرة لديهم ارتفاع القرار المكانية، وليس بحاجة إلى حقن من وكيل أو على النقيض من جزيئات الراديو المسمى وبالتالي تجنب التعرض المتكرر إلى الإشعاعات المؤينة. هذه التقنية قابلة للتطبيق في المواد البشرية والحيوانية على حد سواء، وبالتالي مناسبة جدا للبحث متعدية نظم العصبي والاضطرابات النفسية. تطبيقه هو بطبيعة الحال لا تقتصر على المسار 5-HT وسبق أن استخدمت على نطاق واسع لتقييم آثار المخدرات الدوبامين في كل من الحيوانات والبشر 5،15 22.

ومع ذلك، phMRI في الحيوانات الصغيرة لا تزال صعبة، كما أشرنا في مقالات المراجعة بواسطة مارتن و 11 Sibson وستيوارد 20. واحدة من هذه التحديات هو س صيانةو المعلمات الفسيولوجية مستقرة خلال الحصول على الصور. يمكن لمعظم مواد التخدير تغيير وظيفة القلب والأوعية الدموية، وبالنظر إلى أن phMRI يعتمد بشكل حاسم على المعلمات القلب والأوعية الدموية / الدورة الدموية لا بد من التأكد من أن أي تغييرات الدورة الدموية يمكن أن تعزى فقط إلى مستوى التحدي دواء معين. ولذا فمن المهم للغاية أن PCO 2 مستويات تظل ثابتة خلال اقتناء خط الأساس. يمكن التهوية الميكانيكية للمساعدة على ضمان استقرار الفسيولوجية، وغالبا ما تستخدم في هذا النوع من التجارب. اخترنا لكن لاستخدام الحرة في التنفس الحيوانات لترك الباب مفتوحا أمام إمكانية إجراء دراسات طولية في المستقبل. بدلا من ذلك، نحن مراقبة على نطاق واسع (وتتغير) معدل التنفس وقيم غاز الدم لضمان الاستقرار الفسيولوجية داخل نطاقات العادية قبل بدء الفحص وظيفية وبهذه الطريقة للحفاظ على تفاعل الأوعية الدموية، وبالتالي مستقر T2 * / إشارة T2. الأدب حول آثار التخدير العام في ديناميكا الدم الدماغي وmetabolisم وفيرة 20 و خارج نطاق هذه المخطوطة. اخترنا لاستخدام التخدير الغاز مع ± 2٪ isoflurane في هذا بروتوكول معين، لأنه مع التخدير استنشاق، وعمق التخدير يمكن أن يكون سريعا والسيطرة عليها بسهولة. وهذا هو المهم في الإعداد لدينا لضمان نطاق مستقر طبيعي PCO 2 مستويات قبل بداية الحصول على الصور. Isoflurane هو الأكثر شيوعا مخدر المستنشق اليوم، ويتيح استقراء سريع والانتعاش، وهو أمر مهم لدراسات طولية. كما أنها تنتج الحد الأدنى من الاكتئاب القلب والأوعية الدموية والجهاز التنفسي ويؤدي الى استرخاء جيدة من عضلات الهيكل العظمي.

ثانيا، في الوريد إدارة المخدرات تحديا أكثر تعقيدا في الحيوانات الصغيرة من بين البشر. عملية جراحية أن هناك حاجة لإقناء؛ إدخال القنية من شريان الفخذ والوريد يتطلب وجود موظفين مدربين تدريبا جيدا وذوي الخبرة. وبسبب هذه الإجراءات الغازية هو في الوقت الراهن تستخدم أساسا في الإجراءات النهائية. ومع ذلك، يمكن أن تستخدم غير الغازية رصد توازن الدم وذيل حقن الوريد للدراسات طولية 23.

وبالإضافة إلى ذلك، هناك بعض القيود الأكثر عمومية للتقنية، والتي ليست محددة لphMRI الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك، كما أشار إلى ذلك مارتن وSibson 11، والخلط بين إمكانات جميع دراسات الرنين المغناطيسي الوظيفي هو أنه يفترض أن التغيرات في نشاط الدماغ التي حركها التحدي تعكس التغيرات في نشاط الخلايا العصبية بدلا من التأثيرات الشاملة الطرفية. لا سيما في البنى العميقة في الدماغ، فهم فقراء نسبيا من اقتران الوعائية العصبية (العلاقة بين التغيرات نشاط الخلايا العصبية والتغيرات الدورة الدموية) لا يزال قائما. دراسات من هذا النوع يقوم بها Logothetis 10 لتحديد اقتران الوعائية العصبية في القشرة حتى الآن لم يتم تنفيذها في أجزاء أخرى من الدماغ. ومن غير المعروف ما لذلك زيادة في إشارة جريئة في هياكل هامة مثل هذا المخطط أو اللوزة هو تيلينز لنا عن نشاط الخلايا العصبية. أفضل ما يمكن أن نقول في هذه اللحظة هو أن منطقة الدماغ يتفاعل مع التحدي معين، وذلك اعتمادا على معالجة و / أو الظروف، ونحن يمكن رصد التغيرات الهامة للتفاعل الدماغ. ويمكن الى حد كبير هذا يمكن التحقق منها من خلال النظر في البيانات على حد سواء التصوير بالرنين المغناطيسي والاستجابات الفسيولوجية. وينبغي أن النمط العام لتنشيط الدماغ تكون منطقة محددة ومقتصرة على المناطق التي توجد فيها، في هذه الحالة، على نسبة عالية تعصيب 5-HT، وليس بقدر ما هو استجابة الأوعية الدموية العامة. أيضا، ومن المتوقع تشكيل جانبي مختلف الزمني بين التغيرات الأوعية الدموية والدورة الدموية. في حين أن التغيرات في ضغط الدم بالعودة إلى القيم الأساسية في غضون عدة دقائق، وتأثير هذا الدواء على تنشيط الجريئة في حالة فلوكستين مرئية حتى نهاية الحصول على الصور وتتوافق مع الخصائص الدوائية تعرف من هذا الدواء. أخيرا، ينبغي أن الاستجابات الفسيولوجية من جميع الحيوانات تكون مشابهة من أجل جعل ما بين موضوع المقارنة. Nonetheleس، وأنه من المعروف أن لائحة العصبية من تدفق الدم المحلية HT-5 وجود 4. ولذلك لا يمكن استبعاد أن التغيرات المحلية للإشارة الجريء قد تنسب إلى تغيرات الأوعية الدموية من المقرر أن يصدر من HT-5 في القرب من السفن. على الرغم من أن لا ترتبط هذه الآثار إلى تنشيط الخلايا العصبية المحلية، وبالتالي يمكن اعتبار نتائج ايجابية كاذبة، بل هي أيضا مؤشر من وظيفة محددة الشامل للنظام 5-HT (انظر أيضا 3).

الخطوات الحاسمة لهذه التقنية وهي بالتالي لرصد الاستجابات الفسيولوجية وعلى نطاق واسع للتأكد من أن الشروط الفسيولوجية للحيوان في حالة مستقرة قبل وأثناء الحصول على الصور. أيضا يجب أن الظروف الماسح الضوئي أن تكون مستقرة قدر الإمكان، وبالضبط نفس الشيء بالنسبة لكل حيوان. وينبغي التحقق من استقرار إشارة من تسلسل الخاص، وأكد قبل بدء تجربتك. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن يكون دائما ما يكفي من القوة الإحصائية كبير، حتى مع جروب موضوع صغيرPS. لاستعراض لطيف على الاعتبارات التجريبية من phMRI الحيوانية بشكل عام، انظر ستيوارد 20 و للحصول على مثال إضافي لبروتوكول تجريبي للالرنين المغناطيسي الوظيفي الدوائية في الجرذان والفئران، انظر فيراري 5.

التعديلات الممكنة للتقنية وصفها هنا هي عديدة. يمكن واحد:

  1. استخدام دواء مختلفة لمدة 5-HT التحدي، ومثل آخر أو اس اس اراي مستقبلات 5-HT (النمل) ناهضات 16،13،18،7 أو حتى تحديا مزدوجا من أجل الكشف عن الآليات الأساسية لعمل الدواء 6،19؛
  2. استخدام إعداد مختلف التجارب، مثل نظام التخدير المختلفة، والتهوية الميكانيكية، وعوامل التباين حمام الدم بدلا من BOLD 15، الدراسات الطولية (حيوان يحتاج إلى أن يوضع على قيد الحياة، لذلك لا الغازية قياس ضغط الدم غاز / الدم و / أو التهوية الميكانيكية هي ممكنة)، أو مزيج حتى مع أساليب (الغازية) الأخرى مثل تسجيل نشاط الخلايا العصبية باستخدام MR-متوافق مع ايلىctrodes 10 أو PET / SPECT دراسات (4)؛
  3. استخدام مختلف أساليب التصوير بالرنين المغناطيسي وتحليل البيانات مثل طريقة 'ع كتلة "ماكي من 12 أو وظيفي تحليل الربط 15.

التي الخيارات التي تقوم بها في الإعداد التجريبية تعتمد بشكل كبير على إمكانيات و / أو خبرة في المختبر الخاص بك ونوع السؤال البحثي كنت ترغب في الإجابة.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgments

ويتم تمويل هذا العمل من قبل المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO) (شفني لا. 916.86.125)، التي منحت لReneman L.. وكان الممول لم يكن له دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة. ليس هناك تضارب في المصالح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott Laboratories No B506 Mix with medical air
Medical air BOC Healthcare
Heating pad Harvard Apparatus 507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Silk ligature Harvard Apparatus 2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631
PE-50 Cannula Scientific Laboratory Supplies LTD Portex Tubing PE 0.58x0.96mm 0.58 ID 0.96 OD mm
Heparin sodium Leo Laboratories Heparin sodium 1000IU/ml 15 U/ml
Vetbond Tissue Adhesive 3M MVetbond Tissue Adhesive
Monitoring system SA Instruments http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system Monitors respiration and temperature
Pressure transducer Biopac Systems, Inc. BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW Monitors blood pressure
RapidLab blood gas analyzer Siemens AG RAPIDLab 248/348 Systems
4.7T animal scanner Agilent Technologies 4.7T frequency 199.845 MHz
MR compatible stereotactic bed m2m Imaging Corp Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Coil m2m Imaging Corp Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Fluoxetine Hydrochloride Sigma-Aldrich F-132 5mg/kg in saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  2. Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
  3. Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
  4. Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
  5. Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
  6. Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
  7. Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
  8. Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
  9. Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
  10. Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
  11. Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
  12. McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
  13. Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
  14. Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
  15. Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
  16. Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
  17. Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
  18. Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
  19. Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
  20. Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
  21. Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
  22. Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
  23. Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
  24. Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. OUP. (2001).
استعمال الدوائي، التحدي الرنين المغناطيسي الوظيفي في مرحلة ما قبل السريرية للبحوث: بالتطبيق على النظام 5-HT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).More

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter