Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Anvendelse af farmakologiske-udfordring fMRI i præklinisk forskning: Ansøgning til 5-HT System

doi: 10.3791/3956 Published: April 25, 2012

Summary

Målet med denne teknik er at vurdere serotonin (5-HT) neurotransmitterfunktion i live og frit vejrtrækning dyr med farmakologisk magnetisk resonans (phMRI) og en intravenøs udfordring med en selektiv serotoningenoptagelsesinhibitor (SSRI), fluoxetin.

Abstract

Farmakologisk MRI (phMRI) er en ny og lovende metode til at studere virkningerne af stofferne på hjernens funktion, der i sidste ende kan bruges til at opklare underliggende neurobiologiske mekanismer bag stofvirkningen og neurotransmitter-relaterede lidelser, såsom depression og ADHD. Ligesom de fleste af de billeddannende metoder (PET, SPECT, CT), det repræsenterer et fremskridt i efterforskningen af ​​hjernesygdomme og den tilhørende funktion af neurotransmitter veje på en ikke-invasiv måde med respekt for den samlede neuronale forbindelse. Desuden er det også det ideelle værktøj til oversættelse til kliniske undersøgelser. MRI, medens der stadig bagud i molekylær billeddannelse strategier i forhold til PET og SPECT, har den store fordel at have en høj rumlig opløsning og intet behov for injektion af et kontrastmiddel-middel eller radio-mærkede molekyler, hvorved man undgår den gentagne udsættelse for ioniserende stråling . Funktionel MRI (fMRI) er flittigt brugt i forskning og klinisk miljø, hvor det er generally kombineret med en psyko-motor opgave. phMRI er en tilpasning af fMRI muliggør undersøgelse af en specifik neurotransmitter, såsom serotonin (5-HT), under fysiologiske eller patologiske tilstande efter aktivering via administrering af en specifik udfordrende lægemiddel.

Målet med den her beskrevne fremgangsmåde er at vurdere hjerne 5-HT funktion i fri vejrtrækning dyr. Ved at udfordre den 5-HT system, samtidig med at erhverve funktionelle MR-billeder over tid, kan reaktionen af ​​hjernen på denne udfordring skal visualiseres. Flere undersøgelser på dyr har allerede vist, at narkotika-inducerede stigninger i ekstracellulære niveauer af fx 5-HT (slipmidler, selektive re-uptake-blokkere osv.) fremkalder region-specifikke ændringer i blodets iltning niveau afhængige (BOLD) MRI-signaler (signal på grund af en ændring af oxygenerede / deoxygeneret hæmoglobin forekommer under hjernen aktivering via en forøgelse af blodforsyningen til at forsyne oxygen og glucose til krævende neuroner) tilvejebringelse af et indeks af neurotransmitterfunktion. Det er også blevet vist, at disse virkninger kan vendes ved behandlinger, der sænker 5-HT tilgængelighed 16,13,18,7. Hos voksne rotter, der BOLD signal ændringer efter akut SSRI administration er beskrevet i flere 5-HT-relaterede områder af hjernen, dvs kortikale områder, hippocampus, hypothalamus og thalamus 9,16,15. Stimulering af 5-HT-systemet og dets svar på denne udfordring kan således bruges som et mål for dens funktion i både dyr og mennesker 2,11.

Protocol

Forberedelse dyr til in vivo MRI scanning

1. Kirurgisk kanylering

  1. Bedøve rotte (Wistar hanrotte, 200-300 g) med isofluran (5% induktion og derefter reduceret til 1,5-2% til vedligeholdelse af anæstesi under dyrets forberedelse og scanning) givet i medicinsk luft (21% O2, BOC England) . Sørg for, at dyret er godt bedøvet og udviser ingen reaktion på en tå knivspids. Den femorale arterie og vene er kanyleret for blodgas og blodtryksmålinger og administration af lægemidlet udfordring hhv. Under den kirurgiske procedure, er dyrets krop temperatur overvåges og opretholdes ved hjælp af en rektal sonde og en termisk tæppe (Harvard Apparatus).
  2. Det anæstetiserede dyr er placeret på en opvarmning pude under et dissektionsmikroskop liggende på ryggen. Barber midten af ​​låret og rense huden med alkohol. Foretag en 2 cm incision i huden langs folden dannet af abdomen og højre lår.Stump dissektion af lukkemuskler anvendes til at visualisere den femorale arterie, vene og den femorale nerve. Skil forsigtigt fartøjer.
  3. Forsigtigt binde en silkeligatur fuldstændigt omkring den distale ende af beholderen og placere et bånd med halvdelen af ​​en kirurgisk knude løst i den proximale side. Anvendelse trækkraft til begge ligaturer, at okkludere blodgennemstrømningen i den resterende midterste del af beholderen udsættes mellem ligaturer. Lave et lille snit omkring en tredjedel af fartøjet omkredsen i denne del af beholderen for at tillade indsættelse af en PE-50 kanyle (0,54 mm indre diameter og 0.96mm til udvendig diameter i tilfælde af voksne hanrotter, ellers 0,40 mm ID, og 0,80 mm ED) i beholderen.
  4. Kanylen skal indsættes flere mm (mindst 5) i beholderen. Når først ind i lumen, skylles en lille mængde hepariniseret saltopløsning (15 IE / ml) gennem beholderen for at undgå dannelse af blodkoagel. Den proksimale silke sløjfe er også ligeret helt at rette kanylen. REPEAT denne procedure til den anden beholder. Lim på huden ved hjælp af en Vetbond vævsadhæsiv (3M Storbritannien plc, Bracknell, Storbritannien), når begge kanyler er på plads. Se figur 1 for nøjagtig placering af kanyler.
  5. Sende dyret i en MR kompatibel stereotaktisk bed (M2M Imaging Corp, USA) i en liggende stilling. Bevar hovedet af dyret gennem indsættelse af øre barer og en tand bar. På dette tidspunkt, kan dyret anbringes i MRI scanner til billeddannelse. Dyret er bedøvet, og er frit vejrtrækning hele imagografiproceduren.

2. Overvågning

Under hele imagografiproceduren bør flere fysiologiske reaktioner konstant overvåges og holdes så konstant som muligt. Dette er vigtigt, eftersom disse responser kan variere betydeligt i de samme tidsvindue som phMRI signal og også påvirke signalet af interesse. Det er også vigtigt, eftersom dyret vil blive placeret i magnet, og er derfor ude af syne og ikke egnet til almindelige kontrol af bedøvelse dybde (f.eks tå knivspids), for at sikre tilstrækkelig bedøvelse dybde. Derudover, da mange lægemidler ændre kardiovaskulære parametre såsom blodtryk, måling af disse er afgørende at sikre, kan tages af globale fysiologiske virkninger af lægemidlet indsats i phMRI data. Se også afsnit 4 for de basale værdier og de forventede svar til infusion af 5 mg / kg fluoxetin.

  1. Organ temperaturen holdes på 37 ± 1,5 ° C ved en varm luft varmesystem (SA Instruments, New York, USA). Vær opmærksom på, at MR scanning kan påvirke temperaturmåling, tjekke denne med dit eget system.
  2. Overvåge og registrere dyrets respiration sats ved hjælp af en respiratorisk manchet koblet til tryk sensor (SA Instruments, New York, USA).
  3. Optage invasiv arterielt blodtryk ved hjælp af en tryktransducer (TSD104A, Biopac Systems Corp, USA) og periodisk trække end analysere arteriel blodgas prøver (RapidLab, Siemens diagnostisk) via kanyle femorale arterie under billeddannelse at overvåge arteriel pCO2 og partialtrykket af oxygen (pO2).
  4. Anvende kanyle lårvenen som den primære infusion linie for den farmakologiske udfordring (fluoxetin (fluoxetinhydrochlorid fra Sigma-Aldrich, England), 5 mg / kg, opløst i saltopløsning).

In vivo billeddannelse

En skematisk repræsentation af fMRI forsøgsopstillingen er vist i figur 2.

3. Imaging Parametre

  1. Når dyret er placeret inde i scanneren og fortsætter med at udvise stabile fysiologiske responser, kan billeddannelse begynde. I vores studier, brugte vi en 4,7 T lille dyr MRI-systemet (Agilent Technologies) med en cylindrisk kvadratur sende / modtage RF spole med 72 mm indvendig diameter (M2M Imaging Corp, USA). Foretag en tre plane scout billede til korrekt vrangHOLDNING hjernen i midten af ​​MRI synsfelt og anvende lokaliseret mellemlæg korrektion (fastmap sekvens) for at forbedre magnetfeltet homogenitet i hjernen.
  2. For hvert dyr, får først en T2-vægtet anatomiske billede volumen for registrering og segmentering formål. Vi anvendte en turbo spin-ekko-sekvens med ekko toglængde = 8; matrix størrelse = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm2; med interleaved erhvervelsen af 30 sammenhængende koronale skiver med 1 mm tykkelse, centreret 8 mm caudalt til den bageste kant af lugtekolben; gennemsnit = 4; TR / TE = 5112/60 ms.
  3. Sørg for, at dyret dets fysiologiske reaktioner er konstant, før du starter phMRI scanningen. For tidsserier erhvervelse, brugte vi den samme T2-vægtede turbo spin-ekko sekvens med ekko toglængde = 16; matrix size = 128 x 128, med indskudte erhvervelsen af ​​20 sammenhængende skiver med 1 mm tykkelse centreret på samme position, TR / TE = 4915/60 ms. I alt købte vi 32 tidspunkter med encquisition tidspunkt 158 ​​sek pr tidsserier volumen og en total scanningstid på 84 min. Det første bind bruges som en 'dummy scan "til at løse T1 mætning virkninger og ikke bruges i dataanalyse. Andre fMRI sekvenser, såsom gradient-ekko-eller ekko plane billeddannelse (EPI) sekvenser kan også anvendes. Sørg for at vurdere signalet stabiliteten af ​​din sekvens af valg før start af dit eksperiment.
  4. Erhverve en række baseline mængder, før administration udfordringen medicin. Vi foreslår mindst 10 minutter inden basislinje erhvervelse under stabile betingelser. Start infusionen på præcis samme tid for alle dyr. I vores protokol, begyndte man administration ved begyndelsen af ​​den 9. volumen (efter ca 21 minutter basislinie scanning). Efter infusion, fortsatte billedet erhvervelse i yderligere 60 minutter (32 bind i alt). Sørg for, at post-infusion periode er lang nok til at visualisere ændringer og for at nå steady state eller inddrivelse af signalet, afhængigt af din forskning questiom og dit valg af stof udfordring.
  5. Når billedet erhvervelse er færdig, skal du fjerne dyret fra scanneren. Udfør en endelig blodgas måling for at sikre stabilitet i de blodgasparametre og for en vurdering af virkningen af ​​stoffet på grundlæggende fysiologi.

Databehandling

4. Fysiologiske reaktioner

Forventede fysiologiske responser på udfordringen er afhængig af den valgte lægemiddel. Nedenfor er almindeligt accepterede baselineværdier (af voksne hanrotter) og de forventede svar til intravenøs infusion af 5 mg / kg fluoxetin givet.

  1. Respirationsfrekvensen skal være stabilt på 45-75 vejrtrækninger / minut. Den farmakologiske udfordring fluoxetin inducerer en kort stigning (15-20%) i respirationsraten.
  2. Blodtrykket skal være konstant og mellem 100-150 mmHg (Biopac Systems Corp, Goweta, USA). Fluoxetin udfordring inducerer en kort, men brat fald på omkring 20% ​​i arterielt blodtryk.Dette skulle komme inden for 5-10 minutter. Dette er vist i figur 3.
  3. Blodgas værdier bør være stabil (måle mindst to gange), og inden for følgende områder, før du starter phMRI scanning: pCO 2, 35-45 mmHg, pO 2, 80-130 mmHg, pH, 7,35-7,45. Kontroller altid disse værdier igen efter scanning for at se, om dyret forblev stabil, og for en vurdering af virkningen af ​​stoffet på grundlæggende fysiologi. Høje PCO 2 værdier vil fremkalde vasodilatation og dermed undgå at se BOLD signal ændringer.
  4. Sørg for, at dyret er under en løbende og konstant niveau af anæstesi (2 ± 0,25%; højere niveauer kan forårsage depression af cerebrovaskulær reaktivitet og lavere utilstrækkelig anæstesi og dermed bevægelse), før du starter phMRI scanning og vigtigere, undgå eventuelle justeringer i anæstesi ordning (f.eks% isofluran og / eller gas flow) under den funktionelle billedet købet, da dette kan også påvirke BOLD signal.

Her beskriver vi en række trin i forbehandling af MR data for at optimalize dataene for statistisk analyse. Vi nævner de værktøjer, der anvendes i vores laboratorium, men mange forskellige værktøjer er tilgængelige.

5,1 data forberedelse

  1. Sæt de rå billeder i det korrekte filformat til MRI-analyse software, som du foretrækker at bruge (NIfTI1.1 eller Analyze7.5 format til FSL programmer). Flere gratis File Converter programmer er tilgængelige online. Afhængigt af den anvendte scanner, kan det være nødvendigt først at konstruere et 3D (anatomisk scanning) eller 4D (phMRI scanning) billede af alle separate 2D skiver. Dette kan gøres ved hjælp af et billedbehandlingssystem program, såsom ImageJ 1.
  2. For at sikre kompatibilitet med algoritmer designet til brug med human data (f.eks FSL programmer), voxel størrelse skal ganges med en faktor 10 (dette kan også gøres ved hjælp af for eksempel ImageJ). I vores undersøgelse, resulterede dette i en voxel størrelse på 3,91 x 3,91 x 10 mm 3.
  3. Visuelt kontrollere dine billeder til uregelmæssigheder i orientering, kunstgenstande og bevægelse. Vær forsigtig med ikke at bruge scanninger med tydelige artefakter eller overdreven motion i dine analyser, som de vil forvride dig resultater.
  4. Orienteringen af ​​alle scanninger bør være ens mellem de anatomiske og funktionelle billeder og konkordans med det anvendte henvisning hjernen. I vores undersøgelse, brugte vi det stereotaktiske rottehjernen skabelon beskrevet af Schwarz 14. Den FSL Kommandoen fslswapdim kan anvendes til at omorientere.

5,2 Motion korrektion

  1. For at korrigere for enhver bevægelse artefakter i 4D tidsserier, brugte vi bevægelse korrektion værktøj McFlirt (Motion Correction hjælp FMRIB s Linear Billede Registrering Tool, en del af FMRIB s Software Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT er en intra-modalt motion korrektion værktøj designed til brug på fMRI tidsserier og baseret på optimering og registrering teknikker, der anvendes i FLIRT, et fuldautomatisk værktøj til lineær (affine) intermodal hjerne billede registrering. Kontroller altid bagefter, hvis resultatet er tilfredsstillende.

5,3 Brain segmentering

  1. Slette alle ikke-hjernevæv fra et billede af hele hovedet for både 4D tidsserier som 3D anatomiske billeder. Til dette brugte vi FSL værktøj BET (Brain Extraction Tool v. 2,1, en ​​del af FMRIB s Software Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Standardindstillingerne er udviklet til brug sammen med den menneskelige hjerne, og er således ikke ideelle til rottehjernen. Vi anvendte følgende parametre: fraktioneret intensitet tærskel, f = 1,0; lodret gradient i fraktioneret intensitet tærskel, g = 0,1, og hovedet radius (i mm), r = 175 for de fleste dyr. Hvis det er nødvendigt, kan du optimere disse værdier per emne.

6. Data analysis

Mål for den statistiske analyse af MR data er at fastlægge de voxels, der udviser yderligere varians kan henføres til lægemidlet udfordring i en statistisk robust måde. Forskellige metodiske tilgange er tilgængelige for dette, ligesom utallige softwarepakker. Det valg, du foretager, er afhængig af tilgængeligheden af ​​software og viden / erfaring på dit laboratorium og dit konkrete forskning spørgsmål. Her giver en foreslået fremgangsmåde som anvendes i vores laboratorium.

6,1

  1. Før analysere MRI data, fastsætte en generel lineær model (GLM), som de data, der vil blive monteret. Dette kan være en enkelt kvadratisk on-off model (off for præ-lægemiddel og til post-infusion) eller en specifik model baseret på de data. Vi har brugt programmet stimulere 21 til at bestemme en data-baseret GLM model.
  2. Udføre en to-prøve t-test (f.eks Stimulering) på alle baseline volumener vs alle post-challenge mængder. Eventuelt lade oUT det første bind (r) og lydstyrken under hvilke belastningen er givet, da der ikke kan repræsentere steady state-scanning. Efterfølgende diskriminerer alle voxels med mere end en vis% ændring fra baseline. Vi brugte alle voxels med mere end 1% ændring.
  3. Dernæst, i gennemsnit tidsforløbet i alle disse voxels, som allerede giver dig et indtryk af formen af ​​modellen. På denne måde kan bestemmes, hvis udfordring 1) har en øjeblikkelig eller forsinket virkning, 2), hvis og når effekten når et plateau og / eller top, og 3), hvis eller når effekten falder igen under tidsforløbet for scanne. Eksempler er vist i figur 4A og 4B.

6,2

Det næste trin er derefter statistisk teste rå 4D tidsserier billede af hvert dyrs mod tidligere etablerede GLM model. Til dette brugte vi FSL programmet FEAT (fMRI Expert Analysis Tool, v5.98) 17,24. Men andre fMRI analyseværktøjer er til rådighedwas så godt. Inden for analyseværktøj, har et første niveau analyse, der skal oprettes. Dette kræver følgende skridt:

  1. Sørg for at bruge de samme indstillinger for hvert dyr. Du kan vælge at slette de første (to) mængder, før analysen, da steady-state-scanning ikke kan nås endnu på dette punkt. Indstil TR, dette er den tid (i sekunder) mellem begyndelsen af ​​hver efterfølgende volumen. Da du kigger på virkninger, som kan vare hele scanningen tiden, er der ikke behov for at sætte en høj eller lav pass filter.
  2. Rumligt udjævne data for at reducere støj og forbedre signal-støj (SNR)-forholdet. Vi valgte en FWHM kerne af 8 mm.
  3. Nu kører den ønskede GLM-modellen på dine data. Dette er din vigtigste forklarende variabel (EV), dvs bølgeform du teste dine data imod. GLM der var bestemt baseret på vores egne data kan ses i figur 4C. Der er også mulighed for at tilføje yderligere forvirre elbiler såsom bevægelsesparametre,lavfrekvent støj (scanner drift) eller endog fysiologiske parametre, såsom blodtryk at fjerne generelle fysiologiske lægemiddel-virkning.
    Inden FEAT: Brug FILM prewhitening. Tilføj tidsmæssige derivat. I Kontraster og F-test fanen, der er nedsat en kontrast. Hvis du vil konvertere en enkelt EV i en Z-statistik billede, skal du indstille kontrasten værdi til 1. Dette giver dig alle voxels, hvor dennes tidsforløb kan blive væsentligt forklares ved GLM. Værdien indstilles til -1 giver den negative aktivering.
  4. Efter at have udført den første statistisk test, må det resulterende statistiske billede, der skal tærsklingsbehandles at vise, hvilke voxels eller klynger af voxels aktiveres på et bestemt signifikansniveau. Multiple sammenligninger korrektion er nødvendig på grund af det store antal hjernen testede voxels. Det FSL Programmet FEAT bruger en automatiseret cluster-baseret multiple sammenligninger korrektion baseret på GRF (Gauss Random Field) teori 25.
  5. Endelig bør data være rumligt normaliseret til en reference billede, for at udføre gruppe statistikker. Første registrere de funktionelle data til de dyr, hjerne-udvindes anatomiske billede og derefter til reference billedet. Vi anvendte stereotaktiske rottehjernen template som beskrevet af Schwarz 14 som reference hjerne.
  6. Herefter kan den første niveau analyser af alle dyr kombineres i højere niveau (gruppe) statistiske analyser. Dette er meget afhængig af dit eget studie design og forskningsspørgsmål.

6,3

Herefter kan den første niveau analyser af alle dyr kombineres i højere niveau (gruppe) statistiske analyser. Dette er meget afhængig af dit eget studie design og forskningsspørgsmål.

6,4

Fysiologiske lægemiddel reaktioner kan kobles eller korreleres til det MR-signal, hvis det ønskes. Se også afsnit 6.2.3 om at tilføje forvirre elbiler.

7. Repræsentative resultater

ove_content "> Når udfordrende lægemiddel (5 mg / kg iv fluoxetin) ind i karsystemet, bør en klar fysiologisk reaktion være synlig i respirationsfrekvens (op) og blodtryk (ned). Disse reaktioner normaliseres i gennemsnit inden for 5-10 min I figur 3 dette fald i blodtrykket er klart synlig.

Den gennemsnitlige signal tidsforløb bør vise en forholdsvis stabil baseline og en klar effekt af udfordringen. Fortrinsvis bør der ikke være nogen challenge-uafhængig drift i signalet. Et repræsentativt eksempel på en gennemsnitlig signal tidsforløbet kan ses i figur 5A. Artefakter, såsom respiration depression / fejl eller ændringer i anæstesi er ofte tydeligt i signalet. Respiratorisk depression vil indvirke negativt på signalet i hele hjernen. Dette kan ses i figur 5B.

Efter første niveau analyse, er aktiveringen mønster forventes at være overvejende positiv, og located i specifikke regioner alene (dvs. kortikale områder, hippocampus, hypothalamus og thalamus, se figur 6A). Hvis hele hjernen er deaktiveret, er det ofte et tegn på for dybt anæstesi og / eller iltmangel under scanningen. Et eksempel på dette kan ses i figur 6B.

Figur 1
Figur 1. Placering anbringelse af kanyler i den femorale arterie og vene.

Figur 2
Figur 2 Skematisk repræsentation af MRI opsætning. Alt det udstyr skal være ikke-ferromagnetisk og er forbundet til et modulsystem, som tillader gated erhvervelse af billeder undgå interferens fra bevægelse på grund af vejrtrækning og / eller hjertebanken. Legemstemperatur også reguleres ved hjælp af en opvarmnings-modul for at overvåge og styre dyret temperaturen under billeddannelse. Klik her for at se et større billede .

Figur 3
Figur 3. Repræsentativt eksempel på blodtrykket data. Der er et klart fald i blodtrykket synlig direkte efter starten af ​​infusionen (rød bar). Normale værdier er nået igen i 10 min. Efter udfordringen administration.

Figur 4
Figur 4. A) Forventet aktivering mønster ved hjælp af MRI-analyse programmet stimulere (rød er positiv aktivering, blå er negativ aktivering). B) Gennemsnitligt tidsforløb for alle aktiverede voxels (≥ 1% ændring fra baseline) i alle dyr. C) Eksempel af den resulterende GLM modellen i FSL / FEAT. Click her for at se større figur.

Figur 5
Figur 5.

  1. Eksempel positive aktivering. Tidsforløbet for de aktiverede voxels (rød) følger stort set formen af ​​GLM-modellen. Infusion af lægemidlet startede omkring tidspunkt 8.
  2. Eksempel på negativ aktivering i hele hjernen efter for dyb anæstesi. Tidsforløbet i de negativt aktiverede voxels (blå) viser en generel nedgang i signalet, og ingen effekt af udfordringen er synlige.

Klik her for at se større figur .

Figur 6
Figur 6.

  1. Forventet aktivering mønster efter første niveau analyse. Aktivering af klynger af voxels (rød til yellow), kun i bestemte områder i hjernen.
  2. Eksempel på "dårlig" aktivering mønster. Hele hjernen negative aktivering (blå) i det samme dyr som i figur 5B.

Discussion

5-HT phMRI er et lovende redskab til at vurdere neurotransmitterfunktion i dyr in vivo. Det visualiserer hjernen respons på en 5-HT udfordring med funktionel MR-billeddannelse. MR har den store fordel at have en høj rumlig opløsning og at de ikke har brug for indsprøjtning af kontrast-agent eller radio-mærkede molekyler hvorved man undgår gentagen eksponering for ioniserende stråling. Denne teknik kan anvendes i både mennesker og dyr, og derfor meget velegnet til translational forskning af neurotransmitter systemer og psykiatriske lidelser. Dets anvendelse er selvfølgelig ikke begrænset til 5-HT pathway og er allerede blevet anvendt i vid udstrækning til at vurdere virkningerne af dopaminerge lægemidler i både dyr 5,15 og mennesker 22.

Ikke desto mindre, phMRI i små dyr er stadig en udfordring, som allerede påpeget i review artikler af Martin og Sibson 11 og Steward 20. En af disse udfordringer er at opretholde of stabile fysiologiske parametre under image erhvervelse. De fleste bedøvelsesmidler kan ændre kardiovaskulær funktion, og da phMRI er kritisk afhængig af kardiovaskulære / hæmodynamiske parametre, det er vigtigt at sikre, at alle hæmodynamiske ændringer alene kan henføres til den givne stof udfordring. Det er derfor afgørende vigtigt, at PCO 2 niveauer forbliver konstant under baseline købet. Mekanisk ventilation kan bidrage til at sikre fysiologisk stabilitet og anvendes ofte i denne type eksperimenter. Vi dog valgte at bruge fri-vejrtrækning dyr til at forlade åbne mulighed for at foretage longitudinale undersøgelser i fremtiden. I stedet har vi ekstensivt overvågede (og ændrede) åndedræt og blod gas værdier for at sikre fysiologisk stabilitet inden for normalområdet før start af den funktionelle scanning og på denne måde at bevare en stabil vaskulær reaktivitet og dermed T2 * / T2 signal. Litteratur om effekten af ​​generel anæstesi på cerebrale hæmodynamik og metabolism er rigelig 20 og uden for rammerne af dette manuskript. Vi valgte at bruge gas anæstesi med ± 2% isofluran i denne specifikke protokol, fordi med inhalationsanæstetika, kan dybden af ​​anæstesi være hurtigt og let kontrolleres. Dette er vigtigt i vores setup til at sikre normale stabile PCO 2 niveauer før start af billedet købet. Isofluran er det mest almindeligt anvendte inhalant bedøvelse i dag og giver mulighed for hurtig induktion og nyttiggørelse, som er vigtig for longitudinelle studier. Det producerer også minimal kardiovaskulær og respiratorisk depression og inducerer god afslapning af skeletmuskulatur.

For det andet, at intravenøs administration af den udfordrende lægemidlet er mere kompliceret i små dyr end i mennesker. Operationen, der er nødvendig for kanylering af den femorale arterie og vene kræver veluddannet og erfarent personale. På grund af disse invasive procedurer er i øjeblikket anvendes hovedsageligt i terminalprocedurer. Imidlertid kan ikke-invasiv monitorering af blod homeostase og haleveneinjektion anvendes til forløbsundersøgelser 23.

Derudover er der nogle mere generelle begrænsninger for den teknik, der ikke er specifikke for dyret phMRI. Derudover, som påpeget af Martin og Sibson 11, en ​​potentiel forvirre af alle fMRI studier er, at det antages, at de ændringer i hjernens aktivitet, som fremkaldes ved den udfordring afspejle ændringer i neuronal aktivitet, snarere end perifere systemiske effekter. Især i dybere hjernens strukturer, stadig en forholdsvis ringe forståelse af neurovaskulær kobling (forholdet mellem neuronal aktivitet, ændringer og hæmodynamiske ændringer). Undersøgelser af den art, som udføres af Logothetis 10 for at bestemme neurovaskulær kobling i cortex er endnu ikke blevet udført i andre dele af hjernen. Det er derfor uvist, hvad en stigning i BOLD signal på vigtige strukturer som striatum eller amygdala er Telling os om neuronal aktivitet. Det bedste vi kunne sige på nuværende tidspunkt er, at hjernen region reagerer på den givne udfordring, og at afhængigt af behandling og / eller forhold, kan vi overvåge de væsentlige ændringer i hjernen reaktivitet. Dette kan i vid udstrækning kontrolleres ved at se på både MR data og fysiologiske reaktioner. Det generelle mønster af hjernen aktivering bør være region specifik og begrænset til områder med i dette tilfælde en høj 5-HT innervation, og ikke så meget generel vaskulær reaktion. Desuden er en anden temporal profil mellem vaskulære og hæmodynamiske ændringer forventet. Henviser blodtryksforandringerne vende tilbage til deres basislinieværdier i flere minutter, er virkningen af ​​lægemidlet på BOLD aktivering i tilfælde af fluoxetin synlige, indtil afslutningen af ​​billederhvervelse og svarer til de kender farmakokinetiske egenskaber af dette lægemiddel. Endelig bør fysiologiske responser i alle dyr ligner for at gøre inter-individvariation sammenligninger. Nonetheless er det kendt, at en neurogen regulering af den lokale blodgennemstrømning af 5-HT findes fire. Det kan derfor ikke udelukkes, at lokale ændringer af BOLD signal kan tilskrive vaskulære forandringer på grund af frigivelse af 5-HT i nærheden af ​​skibe. Skønt disse virkninger ikke er forbundet til den lokale neuronal aktivering og kan således betragtes som falsk positive resultater, er det også et indeks for den samlede specifikke funktion af 5-HT-systemet (se også 3).

Kritiske trin i denne teknik er derfor at overvåge fysiologiske reaktioner omfattende og at sikre, at de fysiologiske betingelser i dyret er stabile før og under billedoptagelse. Også scanner betingelser bør være så stabilt som muligt, og nøjagtigt de samme for hvert dyr. Signal stabilitet din sekvens bør kontrolleres og bekræftes før start af dit eksperiment. Desuden, så sørg for altid at have stort nok statistisk styrke, selv med små forbehold Groups. For en flot anmeldelse af de eksperimentelle overvejelser af animalsk phMRI i almindelighed, se Steward 20 og for en yderligere eksempel på en forsøgsprotokol for farmakologisk fMRI hos rotter og mus, Ferrari 5 se.

Mulige modifikationer af teknikken beskrevet her, er talrige. Man kunne:

  1. ved hjælp af en anden lægemiddel til 5-HT udfordring, såsom en SSRI-eller 5-HT-receptor (ANT)-agonister 16,13,18,7 eller endog en dobbelt challenge for at afsløre underliggende mekanismer af lægemiddelvirkning 6,19;
  2. bruge en anden forsøgsopstilling, såsom en anden anæstesi regime, mekanisk ventilation, blod-pool kontrastmidler i stedet for BOLD 15, longitudinelle studier (dyret skal holdes i live, så ingen invasiv blodtryk / blod-gas måling og / eller mekanisk ventilation er mulige), eller endog kombinationer med andre (invasive) fremgangsmåder, såsom optagelse af neuronal aktivitet under anvendelse af MR-kompatibel elementctrodes 10 eller PET / SPECT undersøgelser 4;
  3. bruge forskellige MRI metoder til dataanalyse såsom "p-blok 'metode McKie 12 eller funktionel konnektivitet analyse 15.

Hvilke valg, du foretager i forsøgsopstillingen er meget afhængig af mulighederne for og / eller erfaring inden for dit laboratorium og type forskning spørgsmål, du gerne vil besvare.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er finansieret af den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO) (Veni no. 916.86.125), tildelt L. Reneman. Den Funder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Der er ingen interessekonflikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott Laboratories No B506 Mix with medical air
Medical air BOC Healthcare
Heating pad Harvard Apparatus 507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Silk ligature Harvard Apparatus 2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631
PE-50 Cannula Scientific Laboratory Supplies LTD Portex Tubing PE 0.58x0.96mm 0.58 ID 0.96 OD mm
Heparin sodium Leo Laboratories Heparin sodium 1000IU/ml 15 U/ml
Vetbond Tissue Adhesive 3M MVetbond Tissue Adhesive
Monitoring system SA Instruments http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system Monitors respiration and temperature
Pressure transducer Biopac Systems, Inc. BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW Monitors blood pressure
RapidLab blood gas analyzer Siemens AG RAPIDLab 248/348 Systems
4.7T animal scanner Agilent Technologies 4.7T frequency 199.845 MHz
MR compatible stereotactic bed m2m Imaging Corp Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Coil m2m Imaging Corp Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Fluoxetine Hydrochloride Sigma-Aldrich F-132 5mg/kg in saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  2. Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
  3. Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
  4. Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
  5. Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
  6. Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
  7. Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
  8. Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
  9. Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
  10. Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
  11. Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
  12. McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
  13. Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
  14. Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
  15. Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
  16. Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
  17. Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
  18. Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
  19. Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
  20. Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
  21. Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
  22. Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
  23. Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
  24. Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. OUP. (2001).
Anvendelse af farmakologiske-udfordring fMRI i præklinisk forskning: Ansøgning til 5-HT System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).More

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter