Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

השימוש fMRI אתגר תרופתי, מחקר קדם קליניים: בקשה מערכת 5-HT

doi: 10.3791/3956 Published: April 25, 2012

Summary

מטרת טכניקה זו היא להעריך (5-HT) סרוטונין תפקוד עצבי של בעל החיים חי ונושם חופשי עם הדמיה תרופתי באמצעות תהודה מגנטית (phMRI) ואת האתגר תוך ורידי עם סרוטונין סלקטיביים מעכבי ספיגה חוזרת (SSRI), פלואוקסטין.

Abstract

תרופתי MRI (phMRI) היא שיטה חדשה מבטיחה לחקור את ההשפעות של חומרים על תפקוד המוח, כי בסופו של דבר יכול להשתמש בהם כדי לפענח מנגנונים הנוירוביולוגי הבסיסיים העומדים מאחורי הפעולה סמים הנוירוטרנסמיטר הקשורות הפרעות, כגון דיכאון, הפרעות קשב וריכוז. כמו רוב שיטות ההדמיה (PET, SPECT, CT) הוא מייצג התקדמות בחקירה של הפרעות במוח והפונקציה בנושא של הנוירוטרנסמיטר המסלולים בצורה לא פולשנית ביחס של קישוריות עצבית הכוללת. יתר על כן הוא גם מספק כלי אידיאלי עבור תרגום חקירות קליניים. MRI, תוך מאחור אסטרטגיות הדמיה מולקולרית לעומת PET ו SPECT, יש יתרון גדול יש רזולוציה מרחבית גבוהה צורך בהזרקה של חומר ניגוד או מולקולות רדיו שכותרתו, ובכך למנוע חשיפה חוזרת ונשנית לקרינה מייננת . MRI תפקודי (fMRI) נעשה שימוש נרחב במסגרת מחקר קליני, שם הוא גרבשילוב עם המשימה enerally פסיכו מוטורית. phMRI הוא עיבוד של fMRI המאפשר חקירה של מערכת מוליך עצבי ספציפי, כגון סרוטונין (5-HT), בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים לאחר ההפעלה באמצעות מתן התרופה אתגר ספציפי.

מטרת השיטה המתוארת כאן היא להעריך 5-HT תפקוד המוח על נשימה חופשית לבעלי חיים. על ידי תיגר על מערכת 5-HT ובמקביל רכישת תפקודית תמונות MR לאורך זמן, התגובה של המוח לאתגר זה ניתן דמיינו. מספר מחקרים בבעלי חיים כבר הוכיחו כי סמים עלייה ברמות של תאיים כגון 5-HT (סוכני שחרור, סלקטיביים חוסמי ספיגה חוזרת, וכו ') לעורר באזור ספציפיים לשינויים ברמת החמצן בדם אותות ה-MRI התלויים (BOLD) (האות בשל שינוי של רמות המוגלובין מחומצן / deoxygenated המתרחשים במהלך הפעלת המוח באמצעות עלייה של אספקת הדם לספק חמצן גרםlucose לתאי העצב בדרישה) מתן מדד תפקוד עצבי. כמו כן הוכח כי אלה תופעות יכול להיות הפוך על ידי טיפולים 5-HT ירידה זמינות 16,13,18,7. אצל חולדות בוגרות, שינויים אותות מודגש הבאים חריפה הממשל SSRI תוארו במספר אזורים 5-HT במוח קשורים, כלומר אזורים בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, בהיפותלמוס ו התלמוס 9,16,15. גירוי של מערכת 5-HT ותגובה שלה לאתגר זה יכול לשמש כמדד ובכך תפקידו הן חיות ובני אדם 2,11.

Protocol

הכנת החיה in vivo MRI דימות

1. כירורגי Cannulation

  1. להרדים חולדה (זכר חולדה Wistar, 200-300 גר ') עם (אינדוקציה 5% ולאחר מכן לכדי 1.5-2% לצורך תחזוקה של הרדמה במהלך הכנת בעלי חיים סריקה) isoflurane נתון רפואי האוויר (21% מ 2, BOC בבריטניה) . להבטיח כי בעל החיים הוא מורדם היטב מפגין חוסר תגובה קמצוץ הבוהן. עורק וריד הירך והם cannulated לגז דם מדידות לחץ דם והמינהל של אתגר התרופה בהתאמה. במהלך ההליך הכירורגי, טמפרטורת הגוף של בעל החיים מנוטר ומתוחזק על ידי בדיקה רקטלית וכן שמיכה תרמית (הרווארד המנגנון).
  2. בעלי חיים הרדים ממוקמת על משטח חימום תחת מיקרוסקופ לנתח שכיבה על הגב. לגלח את האזור באמצע הירך ואת משטח העור עם אלכוהול. להפוך את העור 2 ס"מ חתך לאורך הקפל שנוצר בבטן ובירך ימין.דיסקציה בוטה של ​​שרירי adductor משמש לדמיין את עורק הירך, וריד העצבים הירך. להפריד בזהירות כלי.
  3. בעדינות לקשור ליגטורה משי לחלוטין בסביבות סוף דיסטלי של כלי ומקום אחר הקשר עם חצי קשר רופף כירורגית באתר הפרוקסימלי. החל המתיחה הן ליגטורות, כדי לחסום את זרימת הדם בחלק האמצעי הנותר של כלי חשוף בין ליגטורות את. לעשות חתך קטן של כשליש היקף כלי בחלק זה של הספינה כדי לאפשר החדרת צינורית PE-50 (0.54 מ"מ קוטר פנימי 0.96mm ועל בקוטר חיצוני במקרה של חולדות זכרים בוגרים, אחרת .40 מזהה מ"מ 0.80 מ"מ ED) לתוך כלי.
  4. הצינורית צריך להיות מוכנס כמה מ"מ (לפחות 5) לתוך כלי. פעם אחת לתוך לומן, שטוף את כמות קטנה של מלח heparinized (15 UI / ml) באמצעות כלי כדי למנוע היווצרות של קריש דם. לולאה משי הפרוקסימלי הוא גם ligated לחלוטין לתקן את צינורית. REPEAT על הליך זה עבור כלי 2. הדבק את העור באמצעות דבק רקמות Vetbond (3M בבריטניה PLC, ברקנל, בריטניה), כאשר שני cannulas נמצאים במקום. ראה איור 1 עבור מיקום מדויק של cannulas את.
  5. מניחים את החיה במיטה MR תואם stereotactic (M2M הדמיה קורפ, ארה"ב) במצב מועדים. לשמור על הראש של החיה דרך הכניסה של ברים אוזניים, בר השן. בשלב זה, חיה יכול להיות ממוקם בתוך סורק MRI הדמיה. חיים נשאר בהרדמה והוא נשימה חופשית לאורך כל ההליך הדמיה כולו.

2. ניטור

במהלך ההליך כולו הדמיה, התגובות הפיזיולוגיות כמה יש לעקוב כל הזמן להיות כל הזמן כמו קבוע ככל האפשר. זה חיוני, כי תגובות אלו יכולות להשתנות במידה רבה על חלון הזמן כמו האות phMRI וגם להשפיע על האות של עניין. כמו כן, חשוב, בהתחשב בכך את בעל החיים ימוקמו תואר שניgnet ולכן הוא מחוץ לטווח הראייה ולא מקובל בדיקות סטנדרטיות של עומק ההרדמה (למשל קמצוץ הבוהן), כדי להבטיח מספיק עומק ההרדמה. בנוסף, בהתחשב בכך תרופות רבות לשנות פרמטרים לב וכלי דם כגון לחץ דם, מדידות אלה היא קריטית כדי להבטיח ניתן לקחת בחשבון את השפעות פיזיולוגיות העולמי הפעולה של התרופה בנתוני phMRI. ראה גם סעיף 4 על ערכי הבסיס ואת התגובות הצפויות עירוי של פלואוקסטין מ"ג / ק"ג 5.

  1. טמפרטורת הגוף נשמרת על 37 ± 1.5 מעלות צלזיוס על ידי מערכת חימום באוויר חם (SA מכשירים, ניו יורק, ארה"ב). שימו לב כי מר הדמיה יכולה להשפיע על מדידת טמפרטורה, לבדוק את זה עם המערכת שלך.
  2. לנטר ולהקליט קצב הנשימה של בעל החיים באמצעות השרוול הנשימה מצמידים את חיישן הלחץ (SA מכשירים, ניו יורק, ארה"ב).
  3. הקלט דם פולשנית לחץ הדם באמצעות מתמר הלחץ (TSD104A, Biopac מערכות קורפ, ארה"ב) ומדי פעם לסגתד לנתח דגימות דם עורקיים גז (RapidLab, סימנס אבחון) דרך עורק הירך cannulated במהלך ההדמיה לנטר PCO עורקים 2 ו הלחץ החלקי של החמצן (PO 2).
  4. השתמש וריד הירך cannulated כקו עירוי העיקרית אתגר תרופתי (פלואוקסטין (fluoxetine hydrochloride של Sigma-Aldrich, בריטניה) פתרון, 5 מ"ג / ק"ג, מומס מלוחים).

In vivo הדמיה

ייצוג תרשים סכמטי של הניסוי fMRI ניתנת באיור 2.

3. הדמיה פרמטרים

  1. פעם חיה ממוקם בתוך סורק וממשיך להראות התגובות הפיזיולוגיות יציבים, הדמיה יכול להתחיל. במחקרים שלנו, השתמשנו 4.7 T קטנה החיה MRI המערכת (Agilent Technologies) עם נצב גלילי שידור / קליטה RF סליל בקוטר 72 מ"מ פנימית (M2M הדמיה קורפ, ארה"ב). הפוך את מטוס 3 הצופים תמונה נכונה משתיןosition המוח במרכז השדה MRI מבט ולהשתמש תיקון שים מקומי (רצף fastmap) כדי לשפר את ההומוגניות שדה מגנטי במוח.
  2. עבור כל בעל חיים, 1 לרכוש נפח T2 משוקלל תמונה אנטומית למטרות רישום ופילוח. היינו ברצף טורבו הד ספין עם אורך הרכבת הד = 8; גודל מטריצה ​​= 256 x 256, FOV = 50 x 50 מ"מ 2, עם רכישת משולבים של 30 פרוסות העטרה רציף עם עובי 1 מ"מ, 8 מ"מ במרכז הזנב לקצה האחורי הנורה של חוש הריח, ממוצעים = 4; TR / TE = 5112/60 MS.
  3. ודא חיה התגובות הפיזיולוגיות שלו הם קבועים לפני תחילת הסריקה phMRI. לרכישת סדרת הזמן, השתמשנו באותו T2 משוקלל רצף טורבו הד ספין עם אורך הרכבת הד = 16; מטריקס גודל = 128 x 128, עם רכישת משולבים של 20 פרוסות רציף עם עובי 1 מ"מ במרכז במיקום זהה, TR / TE = 4915/60 MS. בסך הכל, רכשנו 32 נקודות זמן עםcquisition זמן של 158 שניות לעמוד בנפח סדרת זמן זמן הסריקה הכולל של 84 דקות. הכרך הראשון משמש כ 'סריקה דמה "כדי לטפל תופעות הרוויה T1 ו לא נעשה שימוש בניתוח נתונים. רצפים-fMRI אחרים, כגון צבע או הד הד מישורי הדמיה (EPI) רצפים יכול לשמש גם. ודא להעריך את יציבות האות של רצף של בחירה לפני תחילת הניסוי.
  4. לרכוש מספר אמצעי האחסון הבסיסית, לפני מתן תרופות אתגר. אנו ממליצים על לפחות 10 דקות של רכישת הבסיס בתנאים יציבים. להתחיל עירוי בזמן בדיוק אותו הדבר עבור כל בעלי החיים. בפרוטוקול שלנו, התחלנו הממשל בתחילת בנפח 9 (לאחר סריקה של כ 21 דק 'קו הבסיס). לאחר עירוי, רכישת התמונה נמשך עוד 60 דקות (32 כרכים בסך הכל). ודא כי בתקופה שלאחר עירוי מספיק זמן כדי לחזות את השינויים כדי להגיע למצב יציב או שחזור של האות, בהתאם למחקר questi שלךעל הבחירה שלך של אתגר התרופה.
  5. לאחר רכישת התמונה הסתיימה, להסיר את החיה מהסורק. בצע הדם האחרונה גז המדידה כדי להבטיח יציבות של פרמטרים גז דם כדי לאפשר הערכה של השפעות התרופה על הפיזיולוגיה הבסיסית.

עיבוד נתונים

4. תגובות פיזיולוגיות

התגובות הפיזיולוגיות צפויים לאתגר תלויים סמים הנבחר. להלן, ערכי בסיס מקובלים (של חולדות זכרים בוגרים) ואת התגובות הצפויות עירוי IV של פלואוקסטין מ"ג / ק"ג 5 מקבלים.

  1. קצב הנשימה צריך להיות יציב 45-75 נשימות בדקה. האתגר תרופתי של פלואוקסטין גורם עלייה קצרה (15-20%) קצב הנשימה.
  2. לחץ הדם צריך להיות קבוע בין 100-150 מ"מ כספית (Biopac מערכות קורפ, Goweta, ארה"ב). האתגר fluoxetine גורם ירידה קצרה אך תלולה של 20% בלחץ הדם העורקי. זה אמור להתאושש בתוך 5-10 דקות. זו מוצגת באיור 3.
  3. גז ערכי הדם צריך להיות יציב (למדוד לפחות פעמיים) ובתוך טווחי הבאות לפני תחילת הסריקה phMRI: PCO 2, 35-45 מ"מ כספית, ת.ד. 2, 80-130 מ"מ כספית, pH, 7.35-7.45. יש לבדוק תמיד את הערכים הללו שוב לאחר סריקה כדי לראות אם בעל החיים שמר על יציבות ולאפשר הערכת ההשפעות סמים על הפיזיולוגיה הבסיסית. ערכים גבוהים 2 PCO יניעו vasodilatation ויהיה ובכך למנוע הצגת השינויים אותות מודגש.
  4. לוודא כי בעל החיים הוא מתחת לרמה מתמשך וקבוע של הרדמה (2 ± 0.25%, רמות גבוהות יותר עלולות לגרום לדיכאון של תגובתיות כלי דם במוח ואת הרדמה מספיק נמוכה, ולכן התנועה), לפני תחילת הסריקה phMRI וגם חשוב, למנוע את ההתאמות ב המשטר הרדמה (למשל isoflurane% ו / או זרימת הגז) בזמן רכישת התמונה מתפקדת כמו זה יכול להשפיע גם את האות BOLD.

ילדה = "jove_title"> 5. Preprocessing נתוני ה-MRI

כאן אנו מתארים מספר שלבים של העיבוד המקדים של הנתונים מר כדי optimalize את הנתונים עבור ניתוח סטטיסטי. אנו מזכירים את הכלים בהם נעשה שימוש במעבדה שלנו, לעומת זאת כלים שונים זמינים.

5.1 נתונים הכנה

  1. שים את התמונות גלם בפורמט הקובץ הנכון עבור תוכנת ניתוח MRI כי אתה מעדיף להשתמש (או NIfTI1.1 Analyze7.5 פורמט תוכניות FSL). מספר חינם ממיר תוכניות קבצים זמינים באינטרנט. בהתאם הסורק בשימוש, ייתכן שיהיה צורך לבנות 1 3D (סריקה אנטומית) או 4D (phMRI סריקה) תמונה של כל פרוסות 2 ד נפרדים. ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנית עיבוד תמונה, כגון ImageJ 1.
  2. על מנת להבטיח תאימות עם ניתוח אלגוריתמים שנועדו לשימוש עם נתונים האדם (כגון תוכניות FSL), גודל voxel צריך להיות מוכפל פי 10 (זה יכול להיעשות גם באמצעות לדוגמה ImageJ). במחקר שלנו, זה הביא גודל voxel של 3.91 x 3.91 x 10 מ"מ 3.
  3. ראייה לבדוק את התמונות על אי סדרים, כיוון וכלים, והתנועה. היזהר שלא להשתמש סריקות עם חפצים ברורים או תנועה מוגזמת ניתוחים שלך כפי שהם לעוות את התוצאות.
  4. הכיוון של סריקות כל צריך להיות דומה בין תמונות אנטומיים ותפקודיים והן התאמה עם המוח התייחסות בשימוש. במחקר זה, השתמשנו עכברוש stereotactic המוח תבנית שתואר על ידי שוורץ 14. הפקודה FSL fslswapdim יכול לשמש reorienting.

5.2 Motion תיקון

  1. כדי לתקן את כל חפצי אמנות תנועה בסדרה הזמן 4D, השתמשנו תיקון כלי McFlirt תנועה (Motion תיקון באמצעות רישום כלי שכבות של FMRIB תמונה, חלק ספריית התוכנה של FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT היא מודאלית תוך תיקון תנועת כלי designed לשימוש בסדרה fMRI, המבוסס על אופטימיזציה של טכניקות רישום המשמשים לפלרטט, כלי אוטומטי לחלוטין לרישום ליניארי (affine) בין מודאלית התמונה במוח. לאחר מכן יש לבדוק תמיד אם התוצאה משביעת רצון.

5.3 המוח פילוח

  1. מחק את כל רקמת המוח הלא מתמונת הראש כולו לסדרת הן זמן 4D כתמונת אנטומי 3D. לשם כך השתמשנו בית כלי FSL (הפקת המוח כלי נ '2.1, חלק ספריית התוכנה של FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). הגדרות ברירת המחדל מפותחים לשימוש עם המוח האנושי והם ולכן לא אידיאלי במוח חולדה. השתמשנו הפרמטרים הבאים: עוצמת השבר הסף, f = 1.0; שיפוע אנכי סף עוצמת השבר, G = 0.1; וראש הרדיוס (מ"מ), R = 175 עבור רוב בעלי החיים. במידת הצורך, תוכל לייעל את הערכים האלה לכל נושא.

6. נתונים Analysiשל

מטרת הניתוח הסטטיסטי של הנתונים MR היא לקבוע את ווקסלים אשר התערוכה השונות נוסף המיוחס לאתגר את התרופה באופן חזק מבחינה סטטיסטית. גישות מתודולוגיות שונות זמינות עבור זה, גם חבילות תוכנה numerable. הבחירה שאתה עושה תלוי בזמינות של התוכנה והידע / ניסיון במעבדה שלך שאלת המחקר הספציפי שלך. כאן אנחנו נותנים השיטה כפי שהוצע משמש במעבדה שלנו.

6.1

  1. לפני ניתוח נתוני ה-MRI, לקבוע מודל ליניארי כללי (GLM) אליהם את הנתונים יהיה מצויד. זה יכול להיות מרובע פשוט ב-off המודל (כבוי מראש על סמים במשך עירוי לאחר התרופה) או הדגם הספציפי מבוססת על הנתונים. השתמשנו תוכנית לעידוד 21 כדי לקבוע מודל נתונים המבוסס GLM.
  2. לבצע שתי מדגם T-test (למשל לעורר) על כל אמצעי האחסון הבסיסית מול כל אתגר שלאחר כרכים. לחלופין, לעזוב OUT הכרך הראשון (ים) ו נפח שבמהלכה האתגר הוא נתון, שכן אלה לא יכול לייצג היציב הדמיה. לאחר מכן, להפלות את כל ווקסלים עם יותר מ שינוי% מסוים מנקודת ההתחלה. היינו כל ווקסלים עם שינוי יותר מאשר 1%.
  3. לאחר מכן, במהלך הזמן הממוצע בכל ווקסלים אלה, אשר כבר נותן לך רושם של הצורה של המודל. בדרך זו ניתן לקבוע אם אתגר 1) יש השפעה מיידית או מאוחרת, 2) אם וכאשר ההשפעה מגיעה הרמה ו / או שיא, 3) אם או כאשר ההשפעה יורדת שוב במהלך תקופה של לסרוק. דוגמאות מוצגות באיור 4 א ו -4 ב.

6.2

השלב הבא הוא לבדוק סטטיסטית אז הסדרה גלם 4D זמן תמונה של כל חיה על מודל GLM הקודמת הוקמה. לשם כך, השתמשנו תוכנית FSL FEAT (FMRI מומחה כלי ניתוח, v5.98) 17,24. עם זאת, שאר כלי הניתוח-fMRI הם available גם כן. בתוך כלי ניתוח, ניתוח הרמה הראשונה צריך להגדיר. זה דורש את השלבים הבאים:

  1. הקפד להשתמש באותן הגדרות עבור כל חיה. אתה יכול לבחור למחוק את הראשון (2) כרכים לפני ניתוח, שכן המצב היציב הדמיה לא ניתן להגיע אליו עדיין בשלב זה. הגדר את TR, זה הזמן (בשניות) בין תחילת כל כרך ברציפות. מאז אתה מסתכל על השפעות שעלולות להימשך זמן הסריקה כולו, אין צורך להגדיר לעבור סינון גבוה או נמוך.
  2. מרחבית להחליק את הנתונים על מנת להפחית את הרעש ולשפר את יחס האות לרעש (SNR). בחרנו FWHM ליבה של 8 מ"מ.
  3. עכשיו להפעיל את מודל GLM הרצוי על הנתונים. זה משתנה מסביר הראשי (EV), כלומר את צורת גל שאתה בודק את הנתונים על. GLM שנקבע בהתבסס על הנתונים שלנו ניתן לראות תרשים 4C. יש גם את האפשרות של הוספת נוספים לבלבל EV של פרמטרים כגון תנועה,תדירות רעש נמוך (להיסחף סורק) או אפילו פרמטרים פיזיולוגיים כמו לחץ דם להסיר כלליים פיזיולוגיים תופעות סמים.
    בתוך FEAT: הסרט שימוש prewhitening. הוסף נגזרת הזמני. בכרטיסייה ניגודים & F מבחני, להקים ניגוד. כדי להמיר EV אחת לתמונה נתון Z, הגדר ערך בניגוד שלה 1. זה נותן לך את כל ווקסלים בו כמובן את הזמן יכול להיות מוסבר באופן משמעותי על ידי GLM. הגדרת הערך ל -1 ייתן ההפעלה שלילית.
  4. לאחר ביצוע הבדיקה הסטטיסטית הראשונית, תמונה נתון וכתוצאה מכך יש thresholded להראות אשר ווקסלים או אוסף של ווקסלים מופעלים ברמת מובהקות בפרט. תיקון מספר השוואות נדרש בשל מספר רב של ווקסלים המוח שנבדקו. FEAT תוכנית FSL משתמש אוטומטיות אשכול מבוססי תיקון השוואות מרובות מבוססות על התיאוריה פוי (שדה גאוס אקראי) 25.
  5. לבסוף, הנתונים צריכים להיות מרחבית מנורמל לתמונה התייחסות, על מנת לבצע סטטיסטיקות הקבוצה. הראשון לרשום את הנתונים פונקציונלי בעלי החיים המוח להפיק תמונה אנטומית ואז התמונה התייחסות. השתמשנו עכברוש stereotactic המוח תבנית שתואר על ידי שוורץ 14 כמו המוח התייחסות.
  6. אחרי זה, 1 ברמת הניתוחים של כל בעלי החיים ניתן לשלב גבוה יותר (קבוצה) ניתוח ברמה סטטיסטית. זה תלוי במידה רבה מערך המחקר שלך ואת שאלות המחקר.

6.3

אחרי זה, 1 ברמת הניתוחים של כל בעלי החיים ניתן לשלב גבוה יותר (קבוצה) ניתוח ברמה סטטיסטית. זה תלוי במידה רבה מערך המחקר שלך ואת שאלות המחקר.

6.4

תגובות פיזיולוגיות סמים ניתן יחד או בקורלציה לאות MR, אם תרצה בכך. ראה גם סעיף 6.2.3 על הוספת לבלבל של EV.

7. נציג תוצאות

ove_content "> כאשר התרופה מאתגר (5 מ"ג / ק"ג IV פלואוקסטין) מזין את מערכת כלי הדם, תגובה פיזיולוגית ברורה צריך להיות גלוי קצב הנשימה (למעלה) ולחץ דם (למטה). תגובות אלו לנרמל בממוצע בתוך 5-10 דקות . באיור 3 זה ירידה בלחץ הדם נראה בבירור.

במהלך הזמן הממוצע האות צריך להראות בסיס יציב יחסית, השפעה ברורה של האתגר. רצוי, לא אמורה להיות אתגר להיסחף עצמאית האות. למשל נציג כמובן אותות הזמן הממוצע שניתן לראות באיור 5 א. חפצים, כגון דיכאון הנשימה / כישלון או שינויים הרדמה לעיתים נראית בבירור האות. דיכוי נשימתי יהיה להשפיע לרעה על האות במוח כולו. ניתן לראות זאת ב 5 ב איור.

לאחר ניתוח הרמה הראשונה, דפוס ההפעלה צפויה להיות חיובית בעיקר locaטד באזורים מסוימים בלבד (כלומר אזורים בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, בהיפותלמוס ו התלמוס; ראה איור 6 א). אם המוח כולו מבוטלת, זה בדרך כלל סימן של הרדמה עמוקה מדי ו / או מחסור בחמצן במהלך הסריקה. דוגמה לכך ניתן לראות באיור 6 ב.

איור 1
באיור 1. מיקום מיקום של cannulas בעורק וריד הירך ו.

איור 2
איור 2 ייצוג תרשים סכמטי של ה-MRI,. כל הציוד צריך להיות לא פרומגנטי והוא מחובר למערכת מודול המאפשר רכישת מגודרת של תמונות של הימנעות הפרעות בתנועה עקב ונשימה / או פעימות לב. טמפרטורת הגוף מווסתת גם באמצעות מודול חימום לפקח ולשלוט על הטמפרטורה חיה במהלך ההדמיה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר .

איור 3
איור 3. דוגמה מייצגת של נתונים ללחץ דם. יש מגמה ברורה של ירידה בלחץ הדם לעין מיד לאחר תחילת עירוי (פס אדום). ערכים נורמליים הם הגיעו שוב בתוך 10 דקות. לאחר מתן אתגר.

איור 4
איור 4. דפוס) ההפעלה הצפוי באמצעות תוכנת ניתוח MRI לעידוד (אדום הוא הפעלת חיובית, כחול הוא הפעלת שלילי). ב) זמן כמובן ממוצע של כל ווקסלים הפעיל (≥ 1% שינוי מתחילת המחקר) של כל בעלי החיים. ג) דוגמה של מודל GLM וכתוצאה מכך FSL / Feat. Clאיכס כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 5
איור 5.

  1. דוגמה של הפעלת חיובית. במהלך הזמן את ווקסלים הפעיל (אדום) עוקב פחות או יותר את הצורה של מודל GLM. עירוי של התרופה החל סביב נקודת זמן 8.
  2. דוגמה שלילית ההפעלה במוח כולו לאחר הרדמה עמוקה מדי. במהלך הזמן את ווקסלים המופעלים באופן שלילי (כחול) מצביעים על ירידה כללית אותות כל השפעה של אתגר גלוי.

לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 6
איור 6.

  1. מצפים תבנית ההפעלה לאחר ניתוח הרמה הראשונה. הפעלת אשכולות של ווקסלים (אדום yellow), רק באזורים ספציפיים במוח.
  2. דוגמה של דפוס 'רע' ההפעלה. המוח ההפעלה כולה שלילית (כחול) בעלי חיים זהה איור 5 ב.

Discussion

5-HT phMRI הוא כלי מבטיח להערכת תפקוד עצבי בבעלי חיים in vivo. הוא מדמיין את תגובת המוח לאתגר 5-HT עם MR הדמיה תפקודית. MRI יש יתרון גדול יש רזולוציה מרחבית גבוהה ולא צריך הזרקת חומר ניגוד או מולקולות רדיו שכותרתו וכך למנוע חשיפה חוזרת לקרינה מייננת. טכניקה זו ישימה במקצועות הן בני אדם ובעלי חיים, ולכן מתאים מאוד מחקר translational של מערכות נוירוטרנסמיטרים והפרעות פסיכיאטריות. היישום שלה הוא כמובן לא רק מסלול 5-HT וכבר נעשה שימוש נרחב על מנת להעריך השפעות הסמים דופאמין הן חיות ובני אדם 5,15 22.

עם זאת, phMRI בבעלי חיים קטנים עדיין מאתגרת, כפי שכבר הצביע החוצה מאמרי ביקורת על ידי מרטין Sibson 11 ואב הבית 20. אחד האתגרים הללו היא תחזוקה oפריץ פרמטרים פיזיולוגיים יציב במהלך רכישת התמונה. רוב הרדמה יכול לשנות את תפקוד הלב וכלי הדם וכן בהתחשב בכך phMRI תלויה באופן קריטי על פרמטרים לב וכלי דם / hemodynamic זה חיוני כדי להבטיח כי כל שינוי המודינמים הם לייחס אך ורק לאתגר את התרופה שניתנה. לכן חשוב ביותר כי 2 רמות PCO נשארים קבועים במהלך הרכישה הבסיסי. להנשמה מלאכותית יכול לעזור להבטיח יציבות פיזיולוגית, ומשמש בדרך כלל בסוג כזה של ניסויים. אנחנו לעומת זאת בחרה להשתמש נשימה חופשית חיות לעזוב פתוחה את האפשרות לבצע מחקרים ארוכי טווח בעתיד. במקום זאת, אנו פיקוח נרחב (ושינה) קצב הנשימה גז ערכים דם כדי להבטיח יציבות פיזיולוגית בתוך טווחי רגילות לפני תחילת הסריקה תפקודית ובדרך זו לשמור על תגובתיות כלי דם יציבה ולכן T2 * / T2 האות. הספרות על השפעות בהרדמה כללית על ופרמטרים המודינמיים ו metabolis המוחמ 'הוא שופע 20 ומעבר להיקף של כתב היד הזה. בחרנו להשתמש בהרדמה עם גז% ± 2 isoflurane בפרוטוקול ספציפי זה, כי עם הרדמה משאיפת, את עומק ההרדמה ניתן לשלוט בקלות במהירות. זה חשוב ההגדרה שלנו על מנת להבטיח יציבות לטווח נורמלי PCO 2 רמות לפני תחילת רכישת התמונה. Isoflurane היא נשימתית הרדמה הנפוץ ביותר כיום ומאפשר לזירוז החלמה מהירה, וזה חשוב עבור מחקרים ארוכי טווח. זה גם מייצר דיכאון הלב וכלי הדם ומערכת הנשימה מינימלי גורם להרפיה טובה של שרירי השלד.

שנית, עירוי לוריד של התרופה אתגר מסובך יותר אצל בעלי חיים קטנים יותר מאשר אצל בני אדם. הניתוח הדרוש cannulation של העורק עורק הירך ודורש צוות מיומן ומנוסה. בשל אלה הליכים פולשניים זה כרגע משמש בעיקר בהליכי מסוף. עם זאת, לא פולשנית לניטור של הומאוסטזיס דם בווריד הזרקת הזנב יכול לשמש מחקרים ארוכי טווח 23.

בנוסף, ישנן מספר מגבלות כלליות יותר לטכניקה, אשר אינן ספציפיות עבור בעלי חיים phMRI. בנוסף, כפי שציין מרטין Sibson 11, לבלבל את הפוטנציאל של כל המחקרים-fMRI היא כי ההנחה היא כי שינויים בפעילות המוח שעוררו אתגר משקפים שינויים בפעילות העצבית ולא תופעות מערכתיות הפריפריה. בעיקר מבנים מוחיים עמוקים יותר, ההבנה הדלה יחסית של צימוד neurovascular (הקשר בין הפעילות העצבית שינויים ושינויים המודינמים) נשאר. מחקרים מהסוג שביצע Logothetis 10 כדי לקבוע צימוד neurovascular בקליפת טרם בוצעו בחלקים אחרים של המוח. לא ידוע אם כן מה עליה אות BOLD מבנים חשובים כגון הסטריאטום או האמיגדלה היא אפשר לדעתגרם לנו על הפעילות העצבית. הכי טוב אפשר לומר שברגע זה הוא אזור במוח מגיב על האתגר נתון זה תלוי בטיפול ו / או התנאים, אנו יכולים לעקוב אחר שינויים משמעותיים של תגובתיות המוח. במידה רבה זה יכול להיות מאומת על ידי הסתכלות על שני נתוני ה-MRI ותגובות פיזיולוגיות. תבנית כללית של פעילות המוח צריך להיות באזור מסוים מוגבלת לאזורים עם, במקרה זה, עצבוב גבוה 5-HT, ולא עד כמה התגובה של כלי הדם באופן כללי. כמו כן, הפרופיל הזמני שונה בין שינויים בכלי הדם ואת hemodynamic צפוי. ואילו שינויים בלחץ הדם לחזור ערכי הבסיס שלהם בתוך מספר דקות, את ההשפעה של התרופה על הפעלת מודגש במקרה של פלואוקסטין הנראה עד סוף רכישת התמונה מתאימות יודעים המאפיינים פרמוקוקינטיים של תרופה זו. לבסוף, את התגובות הפיזיולוגיות של כל בעלי החיים צריך להיות דומה כדי לעשות השוואות בין הנושא. Nonetheless, ידוע כי תקנה neurogenic של זרימת הדם המקומית על ידי 5-HT קיימים 4. לכן לא ניתן לשלול כי שינויים מקומיים של האות BOLD יכול לייחס לשינויים בכלי הדם בשל שחרור של 5-HT על הקרבה של כלי. למרות השפעות אלו אינם קשורים להפעלה עצבית מקומית ולכן יכול להיחשב תוצאות חיוביות שגויות, הוא גם אינדקס של פונקציה ספציפית הכוללת של המערכת 5-HT (ראו גם 3).

השלבים הקריטיים של הטכניקה הזו ולכן הם לעקוב אחר התגובות הפיזיולוגיות בהרחבה על מנת לוודא כי התנאים הפיזיולוגיים של בעל החיים הם יציבים לפני ובמהלך רכישת התמונה. גם התנאים סורק צריכה להיות יציבה ככל האפשר בדיוק את אותו הדבר עבור כל חיה. יציבות האות של רצף יש לבדוק ואישר לפני תחילת הניסוי. יתר על כן, הקפד תמיד יש כוח סטטיסטי מספיק גדול, אפילו עם Grou נושא קטןPS. לסקירה נחמדה על השיקולים ניסיוניים של בעלי חיים phMRI באופן כללי, ראה המשרתים 20 ו לדוגמה נוספת של פרוטוקול הניסוי עבור fMRI תרופתי אצל חולדות ועכברים, ראה פרארי 5.

שינויים אפשריים של הטכניקה המתוארות כאן הן רבות. אחד יכול:

  1. באמצעות תרופה שונה לכל אתגר 5-HT, כמו ה SSRI אחרת או הקולטן 5-HT (נמלים) אגוניסטים 16,13,18,7 או אפילו אתגר כפול במטרה לחשוף את המנגנון הבסיסי של פעולת התרופה 6,19;
  2. להשתמש ההתקנה ניסויים שונים, כגון משטר הרדמה שונים, הנשמה מלאכותית, דם בריכת סוכנים בניגוד מודגש במקום 15, מחקרים ארוכי טווח (בעל חיים צריך להיות כל הזמן בחיים, כך שאין לחץ דם פולשנית / דם גז מדידה ו / או אוורור מכני אפשריים), או אפילו שילוב עם (פולשנית) שיטות אחרות, כגון הקלטה של ​​הפעילות העצבית באמצעות MR תואם electrodes 10 או PET / SPECT מחקרים 4;
  3. משתמשים שונים ה-MRI ניתוח נתונים בשיטות כגון שיטת "P-בלוק" של McKie 12 או ניתוח קישוריות תפקודית 15.

אילו הבחירות שתבצע בהגדרת הניסוי תלויה מאוד את האפשרויות ו / או ניסיון בתחום המעבדה שלך ואת סוג של שאלת המחקר היית רוצה לענות.

Disclosures

אין לנו מה למסור.

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) (ללא Veni. 916.86.125), הוענק ל Reneman. למממן לו שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד. אין ניגוד עניינים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott Laboratories No B506 Mix with medical air
Medical air BOC Healthcare
Heating pad Harvard Apparatus 507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Silk ligature Harvard Apparatus 2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631
PE-50 Cannula Scientific Laboratory Supplies LTD Portex Tubing PE 0.58x0.96mm 0.58 ID 0.96 OD mm
Heparin sodium Leo Laboratories Heparin sodium 1000IU/ml 15 U/ml
Vetbond Tissue Adhesive 3M MVetbond Tissue Adhesive
Monitoring system SA Instruments http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system Monitors respiration and temperature
Pressure transducer Biopac Systems, Inc. BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW Monitors blood pressure
RapidLab blood gas analyzer Siemens AG RAPIDLab 248/348 Systems
4.7T animal scanner Agilent Technologies 4.7T frequency 199.845 MHz
MR compatible stereotactic bed m2m Imaging Corp Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Coil m2m Imaging Corp Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Fluoxetine Hydrochloride Sigma-Aldrich F-132 5mg/kg in saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  2. Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
  3. Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
  4. Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
  5. Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
  6. Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
  7. Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
  8. Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
  9. Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
  10. Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
  11. Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
  12. McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
  13. Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
  14. Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
  15. Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
  16. Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
  17. Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
  18. Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
  19. Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
  20. Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
  21. Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
  22. Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
  23. Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
  24. Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. OUP. (2001).
השימוש fMRI אתגר תרופתי, מחקר קדם קליניים: בקשה מערכת 5-HT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).More

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter