Summary
이 기법의 목적은 pharmacological 자기 공명 영상 (phMRI) 및 선택적 세로토닌 reuptake 억제제 (SSRI), 플루옥세틴과 정맥 도전과 라이브 및 무료 숨쉬는 동물에서 세로토닌 (5-HT) 신경 전달 물질의 기능을 평가하는 것입니다.
Abstract
Pharmacological MRI (phMRI)는 궁극적으로 이러한 우울증과 ADHD와 같은 약물 작용과 신경 전달 물질 관련 장애 뒤에 기본적인 신경 생물학 메커니즘을 해명하는 데 사용할 수있는 뇌 기능에 대한 물질의 효과를 연구하기위한 새롭고 유망한 방법입니다. 이미징 방법 (PET, SPECT, CT)의 대부분과 마찬가지로 그것은 뇌 장애의 조사 및 전반의 연결 연결성와 관련하여 비침습 방법으로 신경 전달 물질 경로의 관련 함수에서 진보를 나타냅니다. 또한 그것은 또한 임상 조사에 대한 번역을 위해 이상적인 도구를 제공합니다. MRI, 아직도 뒤에 분자 이미징 전략의 PET 및 SPECT에 비해 꽤 큰 장점은이를 이온화 radiations에 대한 반복적인 노출을 피하고, 높은 공간적 해상도와 명암 에이전트 또는 라디오 라벨이 표시된 분자의 주사에 대한 필요성을 가지고있다 . 그것이 g 어디 기능성 MRI (fMRI)은 광범위한 연구와 임상 환경에서 사용되는enerally 싸이코 모터 작업과 함께. phMRI는 특정 도전 약의 행정을 통해 활성화에 따라 생리적 또는 병리 학적 조건 하에서 같은 세로토닌과 같은 특정 신경 전달 물질 시스템 (5-HT)의 조사를 가능하게 fMRI의 적응이다.
여기에서 설명한 방법의 목표는 자유 호흡 동물의 뇌에 5-HT 기능을 평가하는 것입니다. 동시에 시간이 지남에 따라 기능적 MR 영상을 인수하면서 5-HT 시스템을 도전으로이 과제에 대한 뇌의 반응은 시각이 될 수 있습니다. 동물의 몇몇 연구는 이미 예 : 5-HT (발표 대리인, 선택적 다시 이해의 차단제 등)의 세포 수준에서 마약 유도된 증가 (굵게)에 의존 MRI 신호가 (때문에 신호 혈액 산소 수준에서 특정 지역과 관련된 변화를 그대로 보여주고 있다고 증명 산소와 G를 공급하는 혈액 공급의 증가를 통해 두뇌 활성화하는 동안 발생하는 deoxygenated / 산소 헤모글로빈 수준의 변화신경 전달 물질 함수의 인덱스를 제공하는) 요구 뉴런에 lucose. 또한 이러한 효과는 트리 트먼트 그 감소 5-HT 가용성 16,13,18,7으로 되돌릴 수있는 것으로 나타났습니다. 성인 쥐에서 급성 SSRI 행정을 따라 굵은 신호 변경은 몇 가지 5-HT 관련 뇌 영역, 즉 대뇌 피질의 영역, 해마, 시상 하부와 시상 9,16,15에서 설명되었습니다. 5-HT 시스템의 자극이 도전의 응답 따라서 동물과 인간 2,11 모두에서 그 기능의 척도로 사용될 수 있습니다.
Protocol
생체내 MRI 이미징에 대해 동물 준비하기
1. 외과 Cannulation
- 의료 공중에 주어진 isoflurane (동물의 준비와 스캔하는 동안 마취의 유지를 위해 1.5-2 %로 축소 후 5 %의 유도와) (21 % O 2, BOC 영국)와 쥐 (수컷 Wistar 쥐, 200~300g)을 마취 . 동물이 잘 anesthetized이며 발가락 공략하기 위해 응답을 전시 없다는 것을 확인하십시오. 대퇴 동맥과 정맥은 혈액 가스와 혈압 측정과 각각 약물 도전의 관리를 위해 cannulated됩니다. 수술하는 동안 동물의 체온은 모니터링되고 직장 프로브 및 열 담요 (하버드 장치)를 통해 유지.
- anesthetized 동물은 지느러미 드러누움의 해부 현미경 온난 패드에 위치하고 있습니다. 중간 허벅지 공간 및 알코올 면봉으로 피부를 면도. 복부와 허벅지에 의해 형성된 주름을 잡다 따라 2cm의 피부 절개를합니다.내전근 근육의 무딘 절개가 대퇴 동맥, 정맥 및 대퇴 신경을 시각화하는 데 사용됩니다. 신중하게 혈관을 분리합니다.
- 부드럽게 그릇의 말초 끝에 주위를 완전히 실크 봉합사를 묶고, 근위 사이트의 느슨한 외과 매듭의 절반과 다른 넥타이를 놓으십시오. ligatures 사이에 노출된 용기의 남은 중간 부분에 혈액 흐름을 막다 위해 두 ligatures로 견인을 적용합니다. 수 있도록 선박의이 부분에 선박 둘레 약 휘두릅니다 작은 절개를 만들어 PE-50 정맥 (그렇지 않으면 성인 남자 쥐의 경우 외부 직경을위한 0.54 mm 내부 직경 0.96mm, 0.40 mm ID 및 삽입 그릇에 0.80 mm ED).
- 정맥은 혈관에 여러 음 (적어도 5) 삽입되어야합니다. 일단 루멘으로, 혈병의 형성을 피하기 위해 혈관을 통해 heparinized 식염수 소량 (15 UI / ML)를 플러시. 근위 실크 루프는 또한 정맥을 해결하기 위해 완전히 출혈도 잡았있다. R두 번째 선박에 대해이 절차를 epeat. 접착제 두 cannulas가 제자리에있을 때 Vetbond 조직 접착제를 (3M 영국 PLC, 블랙 넬, 영국)를 사용하여 피부를. cannulas의 정확한 배치를위한 그림 1을 참조하십시오.
- 발생하기 쉬운 위치에 MR 호환 stereotactic 침대 (m2m 이미징 주식 회사, 미국)에 동물을 배치합니다. 귀 바, 치아 표시줄의 삽입을 통해 동물의 머리를 유지합니다. 이때 동물 이미징을위한 MRI 스캐너에 배치될 수 있습니다. 동물 anesthetized 남아와 전체 이미징 절차 전반에 걸쳐 자유롭게 호흡이다.
2. 모니터링
전체 이미징 절차 동안 여러 가지 생리적 반응을 지속적으로 모니터링해야하며 가능한 한 상수로 유지됩니다. 이러한 응답 phMRI 신호와 같은 시간 창 걸쳐 매우 다양하며 관심 신호에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이것은 중요하다. 그것은 동물 mA에 배치됩니다 부여도 중요하다gnet하며 적절한 마취 심도를 확보를 위해, 마취 깊이의 표준 검사 (예 : 발가락 핀치)에 복종할 의무가있는 시야 그러므로 외출하고 없습니다. 또한, 많은 약물 등 혈압과 같은 심장 혈관 매개 변수를 변경할 점을 감안할 때, 이들의 측정 계정이 phMRI 데이터에서 약물의 행동 글로벌 생리적 효과 취할 수 있도록하는 것이 중요합니다. 또한,베이스 라인 값은 5 밀리그램 / kg 플루옥세틴 주입에 대한 예상 반응에 대한 섹션 4를 참조하십시오.
- 바디 온도가 37에서 관리하고 있습니다 ± 1.5 ° C 따뜻한 공기 난방 시스템 (SA 인 스트 루먼트, 뉴욕, 미국)에 의해. MR 영상은 온도 측정에 영향을 미칠 수있다는 인식, 자신의 시스템에 이것을 확인하십시오.
- 압력 센서 (SA 인 스트 루먼트, 뉴욕, 미국)에 결합하여 호흡 커프스를 사용하는 동물의 호흡 률을 모니터하고 기록합니다.
- 압력 변환기 (TSD104A, Biopac 시스템 주식 회사, 미국)를 사용하여 침입 동맥 혈압을 기록하고 정기적으로 인출동맥 PCO 2, 산소의 부분 압력 (PO 2)를 모니터링하는 이미징 동안 cannulated 대퇴 동맥을 통해 동맥혈 가스 샘플을 (RapidLab, 지멘스 진단) 분석 건대.
- pharmacological 도전 (식염수에 녹아있는 플루옥세틴 (시그마 - 올드 리치, 영국에서 플루옥세틴 하이드로 클로라이드) 솔루션, 5 밀리그램 / kg)에 대한 주요 주입 라인으로 cannulated 대퇴 정맥을 사용합니다.
생체내 이미징에
fMRI 실험 설정의 도식 표현은 그림 2에 있습니다.
3. 이미징 매개 변수
- 동물 스캐너 내부에 위치하고 안정적인 생리적 반응을 보여 계속되면 영상은 시작할 수 있습니다. 우리의 연구에서 우리는 원통형 직교 / 전송 72mm 내경 (m2m 이미징 주식 회사, 미국)와 RF 코일을받을 수있는 4.7 T는 작은 동물 MRI 시스템 (애질런트 기술)을 사용. 올바르게 p로 세 비행기 정찰 이미지 만들기보기의 MRI 분야의 중간에 두뇌 osition하고 뇌의 자기장의 균질성 향상을 위해 지역화된 심 보정 (fastmap 순서)을 사용합니다.
- 각 동물의 경우, 먼저 등록 및 분할 목적 T2-가중 해부학 이미지 볼륨을 취득. 우리는 에코 열 길이 = 8 터보 스핀 에코 시퀀스를 사용하여, 매트릭스의 크기 = 256은 x 256, FOV = 50 X 50mm 2, 1 밀리미터 두께 30 연속 코로나 조각의 인터리브 인수와 함께, 후부 가장자리에 꼬리 8mm를 중심으로 후각 망울의, 평균 = 4; TR / TE = 60분의 5,112 MS.
- 그 생리적 반응이 phMRI 검사를 시작하기 전에 일정한 위치 동물 있는지 확인합니다. 시계열 취득을 위해서는 에코 열 길이 = 16과 같은 T2-가중 터보 스핀 에코 시퀀스를 사용하여, 매트릭스의 크기 = 128 X 128, TR / TE, 같은 위치에서 중심으로 1mm 두께로 20 연속 조각의 인터리브 취득과 = 60분의 4,915 MS. 전체적으로, 우리는 32 시간 지점을 인수시계열 볼륨 당 158 초 및 84 분 총 스캔 시간 cquisition 시간. 첫 번째 볼륨은 T1 채도 효과를 해결하기 위해 '가짜 검사'로 사용하고 데이터 분석에 사용되지 않습니다. 이러한 기울기 에코 또는 에코 평면 영상 (에피) 시퀀스와 같은 다른 fMRI 시퀀스도 사용할 수 있습니다. 실험 시작 전 선택의 순서의 신호 안정성을 평가해야합니다.
- 도전 약물을 투여하기 전에 기본적인 볼륨의 번호를 습득. 우리는 안정적인 조건에서 기본적인 인수 중 적어도 10 분 좋습니다. 모든 동물들에게 정확히 동시에 주입을 시작합니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 9 볼륨의 시작 (약 21 분 기준 스캔 후)에 관리를 시작했다. 주입 후, 이미지 수집가 다른 60 분 (총 32 권)을 계속했다. 확인 후 주입 기간은 변화를 시각적으로 그리고 안정 상태 또는 신호의 복구에 도달하여 연구 questi에 따라 충분히있다에서와 약물 도전의 선택이다.
- 이미지 수집이 완료되면 스캐너에서 동물을 제거합니다. 혈액 가스 매개 변수의 안정성을 보장하는 기본적인 생리 기능에 약물 효과의 평가를 활성화하는 최종 혈액 가스 측정을 수행합니다.
데이터 처리
4. 생리적 응답
도전 예상 생리적 반응은 선택된 약물에 의존합니다. 다음은 일반적으로 허용 기준 값 (성인 남자 쥐의) 5 밀리그램 / kg 플루옥세틴 IV 주입에 대한 예상 답변은 주어집니다.
- 호흡 률은 45-75 심호흡 / 순간에 안정해야합니다. 플루옥세틴 pharmacological 과제는 호흡 속도의 짧은 상승 (15~20%)를 유도합니다.
- 혈압은 일정과 100-150 mmHg (Biopac 시스템 주식 회사, Goweta, 미국) 사이 여야합니다. 플루옥세틴 과제는 동맥 혈압의 약 20 %의 짧지만 가파른 드롭을 유도합니다.이것은 5-10 분 이내에 회복됩니다. 이것은 그림 3에 표시됩니다.
- 혈액 가스 값이 안정되고 (적어도 두 번 측정)와 phMRI 스캔 시작하기 전에 다음과 같은 범위 내에서한다 : PCO 2, 35-45 mmHg, PO 2, 80-130 mmHg, 산도, 7.35-7.45합니다. 항상 동물이 안정적으로 남아 있는지 확인하기 위해 기본적인 생리 기능에 약물 효과의 평가를 활성화 스캔 후 다시 이러한 값을 확인합니다. 하이 PCO이 값은 vasodilatation을 유발하며 따라서 굵은 신호 변화를 보는 것을 막을 수있을 겁니다.
- 동물 마취의 지속적이고 일정한 수준 아래에 있는지 확인합니다 (2 ± 0.25 %, 높은 수준은 뇌혈관 반응의 우울증과 낮은 불충 분한 마취하기 때문에 운동을 일으킬 수있다) 중요한 phMRI 검사를 시작하기 전에, 어떤 조정을 피하 이 같은 기능적인 이미지를 수집하는 동안 마취 정권 (예 : % isoflurane 및 / 또는 가스 유량)도 굵게 신호에 영향을 미칠 수 있습니다.
여기 통계적 분석을위한 데이터를 optimalize하기 위해 MR 데이터의 전처리 여러 단계를 설명합니다. 우리는 그러나 많은 다른 도구를 사용할 수있는, 우리가 실험실에서 사용되는 도구를 언급.
5.1 데이터 준비
- 당신이 (FSL 프로그램에 대한 NIfTI1.1 또는 Analyze7.5 형식)를 사용하는 것을 선호하는 MRI 분석 소프트웨어에 맞는 올바른 파일 형식의 RAW 이미지를 넣어. 몇 가지 무료 파일 변환 프로그램을 온라인으로 사용할 수 있습니다. 사용하는 스캐너에 따라서는 먼저 별도의 2D 조각의 3D (해부 학적 검사) 또는 4D (phMRI 스캔) 이미지를 구축하는 데 필요할 수 있습니다. 이것은 같은 ImageJ 1과 같은 이미지 처리 프로그램을 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 인간의 데이터와 함께 사용하기 (예 : FSL 프로그램)을위한 분석 알고리즘과의 호환성을 보장하기 위해서, voxel 크기는 요소 10 (이것도 ImageJ 예를 들어 사용하여 수행할 수 있습니다) 곱한되어야한다. 우리의 연구에서는, 이것은 3.91 X 3.91 X 10mm 3 voxel 크기 결과.
- 시각 오리 엔테이션에서 부정, 유물, 그리고 운동을 위해 이미지를 확인합니다. 그들이 당신에게 결과를 왜곡하므로 분석의 명확 유물이나 과도한 운동으로 스캔을 사용하지 않도록주의하십시오.
- 모든 검사의 오리 엔테이션은 해부 학적 및 기능적 이미지 사이 사용된 참조 두뇌와 일치 유사한 있어야합니다. 우리의 연구에서 우리는 Schwarz 14에 기술된 stereotactic 쥐의 뇌 템플릿을 사용. FSL 명령 fslswapdim는 reorienting 사용할 수 있습니다.
5.2 모션 보정
- 4D 시간 시리즈에 출연했던 유물에 대한 해결하려면, 우리는 모션 보정 도구 McFlirt을 (FMRIB의 선형 이미지 등록 도구를 사용하여 모션 보정, FMRIB의 소프트웨어 라이브러리의 일부 사용 www.fmrib.ox.ac.uk / fsl ). MCFLIRT는 내부 모달 모션 보정 도구 DES입니다fMRI 시계열에 사용하기 위해 igned 및 최적화와 바람둥이에 사용된 등록 기법, 선형 (affine) 인터 모달 두뇌 이미지를 등록하는 완전 자동화된 도구를 기반으로. 결과가 만족스러운 경우는 항상 나중에 확인합니다.
5.3 브레인 세분화
- 3D 해부 이미지로 4D 시간 시리즈 모두에 대한 전체 머리의 이미지에서 모든 비 뇌 조직을 삭제합니다. 이를 위해 우리는 FSL 도구 BET (브레인 추출 도구 V. 2.1, FMRIB의 소프트웨어 라이브러리의 일부 사용 www.fmrib.ox.ac.uk / fsl을 ). 기본 설정은 인간의 두뇌와 함께 사용하도록 개발하고 쥐의 두뇌에 적합하므로 불가능합니다. 그리고 머리 반지름 (㎜)을, 대부분의 동물 R = 175; 분수 세기 임계값, G = 0.1의 수직 기울기 분수 세기 임계값, F = 1.0 : 우리는 다음 매개 변수를 사용했습니다. 필요하다면, 당신은 주제에 따라 이러한 값을 최적화할 수 있습니다.
6. 데이터 Analysi의
MR 데이터의 통계 분석의 목표는 통계적으로 강력한 방법으로 약물 도전의 귀책 추가 분산을 전시 voxels을 결정하는 것입니다. 다양한 방법 론적 접근 방식도 셀 수있는 소프트웨어 패키지로서이 가능합니다. 당신이 할 선택은 여러분의 실험실에서 소프트웨어 및 지식 / 경험의 유무와 구체적인 연구 질문에 따라 다릅니다. 여기에서 우리는 우리의 실험실에서 사용되는 제안된 방법을 제공합니다.
6.1
- MRI 데이터를 분석하기 전에 데이터를 장착할 예정으로 일반 선형 모델 (GLM)을 결정한다. 이것은 온 - 오프 모델 (해제를위한 사전 약물 및 사후 약물 주입에 대한)에 간단한 사각형이나 데이터를 근거로 특정 모델이 될 수 있습니다. 우리는 프로그램이 데이터를 기반 GLM 모델을 결정하기 위해 21 자극 사용해 왔습니다.
- 모든 사후 도전 볼륨 대 모든 기준 볼륨의 두 샘플 T-테스트 (자극의 예) 수행합니다. 선택적으로 O를 떠나UT는 첫 번째 볼륨 (들)과 이들이 정상 상태 이미지를 대표하지 않을 수 있기 때문에 과제가 주어되는 동안 볼륨. 그 후,베이스 라인에서 특정 %의 변화 이상으로 모든 voxels을 차별. 우리는 더 이상 1 %의 변화로 모든 voxels를 사용했습니다.
- 벌써 모델의 형상의 인상을주는이 모든 voxels에서 다음, 평균 시간 코스. 과제 1) 효과가 효과의 시간 과정 중에 다시 거부하는 경우 또는 대지 및 / 또는 피크와, 3)에 도달했을 때 경우에 즉시 또는 지연 효과, 2)를 보유하고있는 경우이 방법으로 그것을 확인할 수 있습니다 스캔. 예제는 그림 4A 및 4B에 표시됩니다.
6.2
다음 단계는 통계적으로 이전 설립 GLM 모델에 대해 각 동물의 원시 4D 시간 시리즈 이미지를 테스트하려면 다음입니다. 이를 위해, 우리는 FSL 프로그램 위업 (FMRI 고급 분석 도구, v5.98) 17,24를 사용했습니다. 그러나 다른 fMRI 분석 도구 availa 있습니다뿐만 아니라 경. 분석 도구 내에서 첫 번째 수준 분석은 설정되어야한다. 이것은 다음과 같은 단계가 필요합니다 :
- 각 동물에 대해 동일한 설정을 사용해야합니다. 정상 상태 이미징은 그 시점에 아직 도달되지 않을 수 있기 때문에 당신은, 분석하기 전에 첫 번째 (두) 볼륨을 삭제하기로 수 있습니다. TR을 설정, 이것은 각각의 연속된 볼륨의 시작 사이의 시간 (초)입니다. 당신은 전체 스캔 시간을 버틸 수있는 효과를보고 있으므로, 높거나 낮은 패스 필터를 설정할 필요가 없습니다.
- Spatially 노이즈를 줄이고 잡음 (SNR)의 비율로 신호를 향상시키기 위해 데이터를 펴다. 우리는 8 mm의 FWHM 커널을 선택했습니다.
- 이제 귀하의 데이터에 원하는 GLM 모델을 실행합니다. 이것은 기본 설명 변수 (EV)은 너의 데이터에 대해 테스트하고 파형을 즉. 우리 자신의 데이터를 근거로 결정했습니다 GLM은 그림 4C에서 볼 수 있습니다. 같은 동작 매개 변수로 추가 혼동 EV의 추가 가능성도있다저주파 소음 (스캐너 드리프트)이나 일반적인 생리적 약물 효과를 제거하는 혈압도 생리 매개 변수입니다.
인간의 한계를 넘는 내에서 사용 필름 prewhitening. 현세의 유도체를 추가합니다. 대조 및 F-테스트 탭에서 명암을 설정합니다. Z 통계 이미지로 한 EV를 변환하려면 1로 자사의 명암 값을 설정합니다. 이렇게하면 해당 시간 코스는 크게 GLM에 의해 설명될 수있는 모든 voxels을 제공합니다. -1로 값을 설정하면 부정적인 인증을 제공합니다. - 초기 통계적 테스트를 수행하면 결과 통계 이미지 voxels 또는 voxels의 클러스터가 특정 의미 수준에서 활성화되는 표시하도록 thresholded해야합니다. 다중 비교를 정정는 테스트 뇌 voxels의 다수로 인해 필요합니다. FSL 프로그램 위업은 GRF (가우시안 랜덤 필드) 이론 25을 기반으로 자동화된 클러스터 기반 다중 비교 보정을 사용합니다.
- 마지막으로, 데이터 spatially되어야 그룹 통계를 수행하기 위해 참조 이미지를 정상화. 먼저 동물 두뇌 추출 해부 이미지로 다음 참조 이미지 기능적 데이터를 등록합니다. 우리는 참고 두뇌로 Schwarz 14에 기술된 stereotactic 쥐의 뇌 템플릿을 사용.
- 이렇게하면 모든 동물의 첫번째 수준 분석은 높은 레벨 (그룹) 통계 분석에서 결합 수 있습니다. 이것은 자신의 학습 설계 및 연구 질문에 크게 의존.
6.3
이렇게하면 모든 동물의 첫번째 수준 분석은 높은 레벨 (그룹) 통계 분석에서 결합 수 있습니다. 이것은 자신의 학습 설계 및 연구 질문에 크게 의존.
6.4
생리 약물 반응은 결합하거나 원하는 경우, MR 신호를 상호하실 수 있습니다. 혼동 EV의 추가에 관한 섹션 6.2.3을 참조하십시오.
7. 대표 결과
ove_content "> 도전 약물 (5 밀리그램 / kg IV 플루옥세틴)이 혈관 시스템을 입력하면 명확한 생리적 반응은 호흡 속도 (최대)과 혈압 (아래)에서 볼 수 있어야합니다. 이러한 반응 5-10 분 이내에 평균 정상화 . 그림 3에서 혈압이 강하 명확하게 볼 수 있습니다.평균 신호 시간 코스는 상대적으로 안정적인 기준과 도전의 명확한 효과를 표시합니다. 가급적, 신호에는 도전 독립적인 드리프트가 없어야합니다. 평균 신호 시간 코스의 대표적인 예제는 그림 5A에서 볼 수 있습니다. 마취 이러한 호흡의 우울증 / 장애 또는 변경 등의 유물이 신호에 종종 명확하게 볼 수 있습니다. 호흡기 우울증은 부정적인 전체 두뇌의 신호에 영향을 미칠 것입니다. 이것은 그림 5B에서 볼 수 있습니다.
첫 번째 수준 분석 후 활성 패턴은 주로 긍정적이고 로카가 될 것으로 예상된다특정 지역의 테드 (즉 피질 영역, 해마, 시상 하부와 시상, 그림 6A 참조). 전체 두뇌가 비활성화된 경우이 자주 검색하는 동안 너무 깊은 마취 및 / 또는 산소 부족의 표시이다. 이것의 예제는 그림 6B에서 볼 수 있습니다.
그림 1. 대퇴 동맥과 정맥의 cannulas의 배치의 위치.
그림 2 MRI 설정의 도식 표현,. 모든 장비는 비 강자성 있어야하고 있습니다 인해 호흡 및 / 또는 심장 박동에 움직임에서 interferences을 피하고 이미지의 문이 수집 모듈 시스템으로 연결됩니다.에게 체온도 이미징 동안 동물의 온도를 모니터링하고 제어하는 가열 모듈을 통해 규제하고 있습니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 혈압 데이터의 대표 예. 직접 주입 (빨간색 막대)의 시작 후 보이는 혈압의 맑은 방울이있다. 정상 값은 10 분 이내에 다시 도달하고 있습니다. 과제 관리 후.
그림 4., 파랑)은 부정적인 활성화 MRI 분석 프로그램 (빨간색은 긍정적인 활성화는 자극을 사용하여) 예상 활성화 패턴입니다. 모든 동물의 모든 활성 voxels (기준선에서 ≥ 1 % 변경)의 B) 평균 시간 코스입니다. C) FSL / 위업의 결과 GLM 모델의 예. 망할 CIA큰 그림을 보려면 여기를 ick.
그림 5.
- 긍정적인 활성화의 예. 활성의 voxels (적색)의 시간 코스 GLM 모델의 대략 형태를 따르고 있습니다. 약물의 주입은 시점 팔 주위를 시작했다.
- 너무 깊은 마취 후 전체 뇌 속의 부정적인 활성화의 예. 부정적인 활성화 voxels의 시간 코스 (파란색) 일반적으로 신호의 감소와 도전에 대한 효과가 표시되지 않습니다을 보여줍니다.
6 그림.
- 첫 번째 수준 분석 후 활성 패턴을 예상. voxels의 클러스터 활성화 (Y로 붉은ellow), 특정 뇌 영역 인치
- '나쁜'활성 패턴의 예. 그림 5B에서와 같은 동물의 전체 두뇌 부정적인 활성화 (파란색).
Discussion
5-HT phMRI은 생체내 동물에서 신경 전달 물질의 기능을 평가하기위한 유망한 도구입니다. 그것은 기능적 MR 영상과 5-HT의 도전에 대한 뇌의 반응을 시각화. MRI는 높은 공간 해상도를 가지고하고 대비 에이전트 또는 따라서 이온화 radiations에 대한 반복적인 노출을 피하고 라디오 표시된 분자의 주사가 필요하지 않는 큰 장점이 있습니다. 이 기술은 인간과 동물 모두 과목에 해당하므로 신경 전달 물질 시스템 및 정신과 질환의 translational 연구에 매우 적합합니다. 그 응용 프로그램은 5-HT 통로로 제한하고 이미 모두 5,15 동물과 인간 22 dopaminergic 약물의 효과를 평가하기 위해 광범위하게 사용되고 안 물론이다.
그럼에도 불구하고, 작은 동물의 phMRI가 도전 남아로서 이미 마틴과 Sibson 11, 스튜 워드 20의 검토 문서에서 지적했다. 이러한 도전 과제 중 하나는 유지 보수 O입니다이미지 수집 중에 F 안정적인 생리적 매개 변수입니다. 대부분의 anesthetics는 심장 혈관 기능을 변경하고 phMRI 그것이 어떤 hemodynamic 변화가 주어진 약물 도전에 전적으로 기인 것을 보장하기 위해 필수적인 심혈관 / hemodynamic 파라미터에 매우 의존한다는 주어하실 수 있습니다. 그것은 PCO 2 레벨 기준 취득하는 동안 지속적인 유지 것을 따라서 극히 중요하다. 기계 환기는 생리 안정성을 보장하기 위해 수 있으며, 종종 실험의이 유형에서 사용됩니다. 우리는 그러나 향후 종단 연구를 수행할 수있는 가능성을 열어두고 자유롭게 호흡 동물을 사용하기로 결정했습니다. 대신, 우리는 광범위하게 기능적인 스캔 시작하고 이런 방식으로 안정적인 혈관 반응을 유지하기 때문에 T2 * / T2 신호 전에 정상적인 범위 내에서 생리 안정성을 보장하기 위해 (그리고 변경된) 호흡 속도와 혈액 가스 값을 모니터링. 대뇌 혈류 역학 및 metabolis에 대한 일반적인 anesthetics의 효과에 관한 문학m 20 풍부하고 원고의 범위를 벗어납니다. 흡입 anesthetics으로 마취의 깊이가 급속하게 쉽게 제어할 수 있기 때문에 우리는 이러한 특정 프로토콜의 isoflurane ± 2 %로 가스 마취를 사용하기로 결정했습니다. 이것은 이미지 수집의 시작 전 정상 범위의 안정적인 PCO 2 수준을 보장하기 위해 설정에 중요합니다. Isoflurane 오늘 가장 일반적으로 사용되는 흡입 마취제이며 세로 공부에 대한 중요 신속한 유도 및 복구를 위해 수 있습니다. 또한 최소한의 심혈관 및 호흡기 우울증을 생산하고 골격 근육을 잘 이완을 유도합니다.
둘째, 도전적인 약물의 정맥 행정은 인간보다 작은 동물에서 더 복잡합니다. 대퇴 동맥과 정맥의 cannulation 필요합니다 수술은 잘 훈련된 경험이 풍부한 직원이 필요합니다. 이러한 침략적 절차 때문에 그것은 주로 터미널 절차에 사용되는 순간입니다. 그러나 혈액 항상성 및 꼬리 정맥 주입의 비침습 모니터링 종방향 연구 23 사용될 수 있습니다.
또한, 동물 phMRI 특정하지 않습니다 기법에 대한 좀 더 일반적인 제한 사항이 있습니다. 또한, 같은 마틴과 Sibson 11 시까지 지적한 모든 fMRI 연구의 잠재적인 혼란 그것이 도전에 의해 evoked 뇌 활동의 변화가 오히려 말초 조직의 효과보다의 연결 활동의 변화를 반영하는 것으로 간주된다는 점입니다. 특히 깊은 뇌 구조에서 neurovascular 커플링의 상대적으로 가난한 이해 (의 연결 활동 변경 및 hemodynamic 변화 간의 관계)이 남아 있습니다. 피질에서 neurovascular 커플링을 결정하는 Logothetis 10 수행한 가지 연구는 아직 두뇌의 다른 부분에서 수행되지 않았습니다. 중요 구조물에 굵은 신호의 증가 등 striatum이나 편도가 이야기 해 뭔지 있으므로 알의 연결 활동에 대한 g 우리. 우리는 지금 말할 수있는 최상의 뇌 영역이 주어진 도전에 반응하고 치료 및 / 또는 조건에 따라, 우리는 뇌 반응의 중요한 변화를 모니터링할 수있다는 것입니다. 이것은 주로 MRI 데이터 및 생리적 반응을 모두 보면 확인할 수 있습니다. 뇌 활성화의 일반적인 패턴이 경우, 높은 5-HT의 innervation, 그리고 많은 일반적인 혈관 반응에있는 지역으로 지역 구체적이고 제한된 있어야합니다. 또한, 혈관 및 hemodynamic 변화 사이의 서로 다른 시간적 프로파일이 예상된다. 혈압 변화가 몇 분 내에 자신의 기준 값으로 반환 반면, 굵게 활성화에 대한 약물의 영향은 이미지 수집이 끝날 때까지 볼 수 플루옥세틴의 경우에이 약의 알고 pharmacokinetic 속성과 일치합니다. 마지막으로, 모든 동물의 생리적 반응은 상호 과목 비교를하기 위해 유사해야합니다. NonetheleSS, 그것은 5-HT에 의한 지역 혈류 neurogenic 규정 4 존재한다는 알려져 있습니다. 따라서 그것은 굵은 신호의 로컬 변경 사항은 선박의 근접에서 5-HT의 방출에 의한 혈관 변화에 속성 수 제외 수 없습니다. 이러한 효과는 지역의 연결을 활성화로 연결되지 않은 그래서 거짓 긍정적인 결과로 생각할 수 있지만, 그것은 또한 5-HT 시스템의 전반적인 특정 기능 (도 3 참조)의 인덱스입니다.
이 기법의 중요한 단계를 광범위하게 생리적 반응을 모니터링하고 동물의 생리적 조건 이미지 획득 이전 기간 동안 안정 있는지 확인하는 것이 있습니다. 또한 스캐너 조건은 가능한 한 안정하고 각 동물에 대해 정확히 동일해야합니다. 당신의 순서의 신호 안정성 확인하고 실험 시작 전에 확인되어야한다. 또한, 심지어 작은 제목 grou으로, 항상 대형 충분한 통계적 능력을 가지고 확실하게PS. 일반적으로 동물 phMRI의 실험적인 고려 사항에 대한 좋은 리뷰 들어, 스튜 워드 20보고 쥐 및 생쥐의 pharmacological fMRI를위한 실험적인 프로토콜의 추가 예를 들어, 페라리 5 참조하십시오.
여기에서 설명한 기법 가능한 개조 다수 있습니다. 한 수 :
- 같은 다른 SSRIs 또는 5-HT 수용체 (개미) agonists 16,13,18,7 또는 더블 도전 약물 행동 6,19의 근본적인 메커니즘을 밝혀하기 위해서에서와 같이 5-HT의 도전을 위해 다른 약물을 사용;
- 이러한 서로 다른 마취 정권, 기계적 환기, 혈액 풀 대비 요원 대신 굵은 글씨로 15 세로 연구 (동물이 살아 보관해야 아니라 다른 실험 설정을 사용하므로 어떠한 침입 혈압 / 혈액 가스 측정도 및 / 또는 기계적 환기 ) 가능하거나, MR-호환 ele을 사용하는 등의 연결 활동의 기록과 같은 다른 (침략) 메소드가있는 심지어 조합ctrodes 10 또는 PET / SPECT 연구 4;
- 같은 McKie 12 기능적 연결 분석 15 'P-블록'방법 등 다양한 MRI 데이터 분석 방법을 사용합니다.
당신이 실험 설정에서 만들어 선택의 가능성 및 / 또는 실험실과 당신들에게 묻고 싶습니다 연구 질문의 유형 내에서 경험에 크게 의존 있습니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 L. Reneman에게 수여 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO) (Veni 번호. 916.86.125)에 의해 자금 지원을하고 있습니다. funder은 연구 설계의 역할, 데이터 수집과 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비 없었다. 관심 아무런 충돌이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane |  Abbott Laboratories |
No B506 | Mix with medical air |
| Medical air | BOC Healthcare |
||
| Heating pad | Harvard Apparatus |
507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz | |
| Silk ligature | Harvard Apparatus |
2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631 | |
| PE-50 Cannula | Scientific Laboratory Supplies LTD |
Portex Tubing PE 0.58x0.96mm | 0.58 ID 0.96 OD mm |
| Heparin sodium | Leo Laboratories |
Heparin sodium 1000IU/ml | 15 U/ml |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M |
MVetbond Tissue Adhesive | |
| Monitoring system | SA Instruments |
http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system | Monitors respiration and temperature |
| Pressure transducer | Biopac Systems, Inc. |
BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW | Monitors blood pressure |
| RapidLab blood gas analyzer | Siemens AG |
RAPIDLab 248/348 Systems | |
| 4.7T animal scanner | Agilent Technologies | 4.7T frequency 199.845 MHz | |
| MR compatible stereotactic bed | m2m Imaging Corp |
Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100 | |
| Coil | m2m Imaging Corp |
Volume TH/Rx RQD1 72/112 200 | |
| Fluoxetine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | F-132 | 5mg/kg in saline |
References
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
- Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
- Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
- Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
- Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
- Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
- Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
- Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
- Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
- Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
- McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
- Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
- Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
- Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
- Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
- Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
- Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
- Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
- Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
- Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
- Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
- Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
- Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. , OUP. (2001).
