Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Bruk av Farmakologisk-utfordring fMRI i pre-klinisk forskning: Søknad til 5-HT-systemet

doi: 10.3791/3956 Published: April 25, 2012

Summary

Målet med denne teknikken er å vurdere serotonin (5-HT) nevrotransmitter funksjon i live og fri pust dyr med farmakologisk magnetic resonance imaging (phMRI) og en intravenøs utfordring med en selektiv serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoksetin.

Abstract

Farmakologisk MRI (phMRI) er en ny og lovende metode for å studere effekter av stoffene på hjernens funksjon som kan til slutt brukes til å avdekke underliggende nevrobiologiske mekanismene bak narkotika handling og nevrotransmitter-relaterte lidelser, som depresjon og ADHD. Som de fleste av imaging metoder (PET, SPECT, CT) representerer det en fremgang i etterforskningen av hjernen lidelser og relaterte funksjon av nevrotransmitter baner i en ikke-invasiv måte med hensyn til den samlede nevronale tilkobling. Videre det gir også et ideelt verktøy for oversettelse til kliniske undersøkelser. MR, mens fortsatt bak i molekylær imaging strategier i forhold til PET og SPECT, har den store fordel å ha en høy romlig oppløsning og ingen behov for injeksjon av en kontrast-agent eller radio-merket molekyler, og dermed unngå repeterende eksponering for ioniserende stråling . Funksjonell MRI (fMRI) brukes mye i forskning og klinisk setting, der det er generally kombinert med en psyko-motor oppgave. phMRI er en tilpasning av fMRI slik etterforskningen av en bestemt nevrotransmitter-system, slik som serotonin (5-HT), under fysiologiske eller patologiske tilstander etter aktivering via administrering av en bestemt utfordrende stoff.

Målet med metoden som beskrives her er å vurdere hjerne 5-HT funksjon i fri-puste dyr. Ved å utfordre 5-HT-systemet samtidig skaffe funksjonelle MR-bilder over tid, kan responsen i hjernen til denne utfordringen bli visualisert. Flere studier på dyr har allerede vist at legemiddelinduserte økning i ekstracellulære nivåer av f.eks 5-HT (slippmidler, selektive reopptak stopper, osv.) fremkalle region-spesifikke endringer i oksygentilførsel i blodet nivå avhengige (Fet) MR-signaler (signal på grunn til en endring av oksygenert / deoxygenated hemoglobinverdier som oppstår under hjerneaktivitet gjennom en økning av blodtilførselen til å forsyne oksygen og glucose til de krevende nevroner) som gir en indeks av nevrotransmitter funksjon. Det har også vist at disse effektene kan reverseres ved behandlinger som reduksjon 5-HT tilgjengelighet 16,13,18,7. I voksne rotter, har Fet signal endringer etter akutt SSRI administrasjon blitt omtalt i flere 5-HT relaterte områder av hjernen, dvs. kortikale områder, hippocampus, hypothalamus og thalamus 9,16,15. Stimulering av 5-HT-systemet og dets respons på denne utfordringen kan dermed brukes som et mål på dens funksjon i både dyr og mennesker 2,11.

Protocol

Forbereder dyr for in vivo MR imaging

1. Kirurgisk kanylering

  1. Anesthetize rotta (mannlig Wistar rotte, 200-300 g) med isofluran (5% induksjon og deretter redusert til 1,5-2% for vedlikehold av anestesi under dyr forberedelse og skanning) gitt i medisinsk luft (21% O 2, BOC Storbritannia) . Sørg for at dyret er godt bedøves og utstillinger ingen respons på en tå klype. Den femoral arterie og vene er cannulated for blod gass og blodtrykksmålinger og administrasjon av stoffet utfordringen henholdsvis. Under den kirurgiske prosedyren, er dyrets kroppstemperatur overvåkes og vedlikeholdes gjennom en rektal probe og en varmeteppe (Harvard apparater).
  2. Den bedøvd dyret er plassert på en oppvarming pad under et dissekere mikroskop i dorsal recumbency. Shave midten lår området og bomullspinne huden med alkohol. Lag en 2 cm hud snitt langs bretten dannet av magen og høyre lår.Blunt disseksjon av adductor musklene brukes til å visualisere lårarterie, vene og femoral nerve. Skill nøye skipene.
  3. Forsiktig knytte en silke ligatur helt rundt den distale enden av fartøyet og plassere en annen slips med halvparten av et kirurgisk knute løst i proksimale området. Påfør trekkraft til begge ligaturer, til occlude blodstrøm i den gjenværende midtre delen av skipet utsatt mellom ligaturer. Lag et lite snitt på om lag en tredjedel av fartøyet omkrets i denne delen av skipet for å tillate innføring av en PE-50 kanyle (0,54 mm innvendig diameter og 0.96mm for ekstern diameter i tilfelle av voksne hannrotter, ellers 0,40 mm ID og 0,80 mm ED) i fartøyet.
  4. Kanylen skal settes inn flere mm (minst 5) inn i fartøyet. Når inn i lumen skylles en liten mengde heparinisert saltvann (15 UI / ml) gjennom skipet for å unngå dannelse av blodpropp. Den proksimale silke sløyfe også ligated helt å fikse kanylen. REPEAT denne prosedyren for det andre fartøyet. Lim huden ved hjelp av en Vetbond Tissue Adhesive (3M Storbritannia plc, Bracknell, Storbritannia) når begge kanyler er på plass. Se figur 1 for eksakt plassering av kanyler.
  5. Plasser dyret i en MR kompatibel stereotactic seng (M2M Imaging Corp, USA) i en utsatt posisjon. Opprettholde hodet av dyret gjennom innsetting av øret barer og en tann bar. På dette punktet, kan dyret plasseres i MR skanner for bildebehandling. Dyret er fortsatt bedøvet og er fritt puste hele bildebehandling prosedyren.

2. Overvåking

Under hele bildebehandling prosedyren, bør flere fysiologiske responser være konstant overvåket og holdes så konstant som mulig. Dette er viktig, siden disse svarene kan variere sterkt over samme tidsvinduet som phMRI signalet og også påvirke signalet av interesse. Det er også viktig, gitt at dyret vil bli plassert i MAgnet og er derfor ute av syne og ikke mottakelig for standard sjekk av bedøvelse dybde (f.eks tå klype), for å sikre tilstrekkelig bedøvelse dybde. I tillegg, gitt at mange legemidler endre kardiovaskulære parametere som blodtrykk, er måling av disse avgjørende for å sikre hensyn kan tas av globale fysiologiske virkningene av stoffet handling i phMRI data. Se også avsnitt 4 for de opprinnelige verdiene og de forventede reaksjoner til infusjon av 5 mg / kg fluoksetin.

  1. Body temperaturen holdes på 37 ± 1,5 ° C ved en varm luft varmesystem (SA Instruments, New York, USA). Vær oppmerksom på at MR kan påvirke temperaturmålinger, sjekk dette med ditt eget system.
  2. Overvåke og registrere dyrets respirasjonsfrekvensen bruke en luftveiene mansjett koplet til trykksensor (SA Instruments, New York, USA).
  3. Ta opp invasiv arterielt blodtrykk ved hjelp av en trykkgiver (TSD104A, Biopac Systems Corp, USA) og jevne ut end analysere arteriell blodgass prøver (RapidLab, Siemens diagnostisk) via cannulated lårarterie under bildebehandling til å overvåke arteriell PCO 2 og partialtrykket av oksygen (PO 2).
  4. Bruk cannulated femoralvenepunksjon som den viktigste infusjonsslangen for farmakologisk utfordring (fluoksetin (Fluoxetin hydroklorid fra Sigma-Aldrich, Storbritannia) løsning, 5 mg / kg, oppløst i saltvann).

In vivo avbildning

En skjematisk fremstilling av fMRI eksperimentelle oppsettet er gitt i Figur 2.

3. Imaging Parametere

  1. Når dyret er plassert inne i skanneren og fortsetter å vise stabile fysiologiske responser, kan bildebehandling starte. I våre studier, brukte vi en 4,7 T lite dyr MR system (Agilent Technologies) med en sylindrisk kvadratur sende / motta RF spole med 72 mm indre diameter (M2M Imaging Corp, USA). Lag en tre fly speider bilde til riktig position hjernen i midten av MR synsfelt og bruke lokaliserte mellomlegg korreksjon (fastmap sekvens) for å forbedre det magnetiske feltet homogenitet i hjernen.
  2. For hvert dyr, først anskaffe en T2-vektet anatomisk bilde volum for registrering og segmentering formål. Vi brukte en turbo spinn ekko sekvens med ekko tog lengde = 8; matrise size = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm 2, med innfelt oppkjøp av 30 sammenhengende koronale skiver med 1 mm tykkelse, sentrert 8 mm kaudal til bakerste kant av luktelappen, gjennomsnitt = 4; TR / TE = 5112/60 ms.
  3. Pass på dyret sine fysiologiske responser er konstant før du starter phMRI skanningen. For tidsseriene oppkjøpet har vi brukt samme T2-vektede turbo spin ekko sekvens med ekko tog lengde = 16; matrise size = 128 x 128, med innfelt kjøpet av 20 sammenhengende skiver med 1 mm tykkelse sentrert ved samme posisjon; TR / TE = 4915/60 ms. Totalt kjøpte vi 32 tidspunkter med en encquisition tid av 158 sek per tidsserier volum og en total skanning tid på 84 min. Det første bindet er brukt som en "dummy scan" for å ta T1 metning effekter og ikke brukes i dataanalysen. Andre fMRI sekvenser som gradient ekko eller ekko planar imaging (EPI) sekvenser kan også brukes. Sørg for å vurdere signal stabiliteten av din sekvens av valget før starten av eksperimentet.
  4. Anskaffe et antall baseline volumer, før administrering av utfordringen medisinering. Vi foreslår minst 10 minutter av baseline erverv under stabile forhold. Start infusjon på nøyaktig samme tid for alle dyr. I protokollen vår startet vi administrasjonen ved starten av niende volum (etter ca 21 min baseline skanning). Etter infusjon, fortsatte bilde oppkjøpet ytterligere 60 minutter (32 bind i alt). Pass på at post-infusjonsperioden er lang nok til å visualisere endringer og til steady state eller utvinning av signalet, avhengig av forskning questipå og ditt valg av narkotika utfordring.
  5. Når bildet oppkjøpet er fullført, fjerner dyret fra skanneren. Utfør en avsluttende blod gassmåling å sikre stabilitet av blod gass parametere og å muliggjøre evaluering av virkninger av rusmidler på grunnleggende fysiologi.

Databehandling

4. Fysiologiske responser

Forventet fysiologiske responser til utfordringen er avhengig av valgt stoffet. Nedenfor er allment akseptert utgangsverdien (av voksne hannrotter) og de forventede reaksjoner til iv infusjon av 5 mg / kg fluoksetin gitt.

  1. Respirasjonsfrekvens må være stabilt ved 45-75 åndedrag per minutt. Den farmakologiske utfordringen fluoksetin induserer en kort økning (15-20%) i pusterytme.
  2. Blodtrykket bør være konstant og mellom 100-150 mmHg (Biopac Systems Corp, Goweta, USA). Den fluoksetin utfordringen induserer en kort, men bratt fall på ca 20% i arterielt blodtrykk.Dette bør komme i løpet av 5-10 minutter. Dette er vist i figur 3.
  3. Blodgassverdier bør være stabile (måle minst to ganger) og innenfor følgende områder før du begynner phMRI skanningen: PCO 2, 35-45 mmHg, Postboks 2, 80-130 mmHg, pH, 7,35 til 7,45. Sjekk alltid disse verdiene igjen etter skanning for å se om dyret var stabil og for å muliggjøre evaluering av virkninger av rusmidler på grunnleggende fysiologi. Høye PCO 2 verdier vil indusere vasodilatasjon og vil dermed unngå å se Fet signal endringer.
  4. Pass på at dyret er under en kontinuerlig og konstant nivå av anestesi (2 ± 0.25%, høyere nivåer kan føre til depresjon av cerebrovaskulær reaktivitet og lavere utilstrekkelig anestesi og dermed bevegelse), før du starter phMRI skanning og viktigere, unngå eventuelle justeringer i anestesi regimet (f.eks% isofluran og / eller gass flow) i løpet av funksjonell bildet oppkjøpet som dette kan også påvirke BOLD signal.

Her beskriver vi flere skritt i preprosessering av MR data for å optimalize data for statistisk analyse. Vi nevner de verktøyene som brukes i vår lab, men mange forskjellige verktøy er tilgjengelige.

5.1 Data-forberedelse

  1. Sett RAW-bilder i riktig filformat for MRI analyse programvare som du foretrekker å bruke (NIfTI1.1 eller Analyze7.5 format for FSL programmer). Flere gratis filkonverteringsprogram programmer er tilgjengelig online. Avhengig av brukte skanneren, kan det være nødvendig å først konstruere en 3D (anatomisk scan) eller 4D (phMRI scan) bilde av alle separate 2D skiver. Dette kan gjøres ved hjelp av et bildebehandlingsprogram, for eksempel ImageJ en.
  2. For å sikre kompatibilitet med algoritmer designet for bruk med humane data (f.eks FSL programmer), har voxel størrelse skal multipliseres med en faktor 10 (dette kan også gjøres ved hjelp av for eksempel ImageJ). I vår studie, resulterte dette i en voxel størrelse på 3,91 x 3,91 x 10 mm 3.
  3. Sjekk visuelt bildene for uregelmessigheter i orientering, gjenstander og bevegelse. Vær forsiktig med å bruke skanninger med tydelige artefakter eller mye bevegelse i dine analyser som de vil forvrenge deg resultater.
  4. Orientering av alle skanninger bør være lik mellom de anatomiske og funksjonelle bilder og i samsvar med det brukte referanse hjernen. I vår studie har vi brukt stereotactic rottehjernen mal beskrevet av Schwarz 14. Den FSL kommandoen fslswapdim kan brukes til snu.

5,2 Motion korreksjon

  1. For å korrigere for eventuelle bevegelse artefakter i 4D tidsserien har vi brukt motion korreksjon verktøyet McFlirt (Motion Korreksjon hjelp FMRIB lineære Bilde Registration Tool, en del av FMRIB Software Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT er en intra-modal bevegelse korreksjon verktøy designed for bruk på fMRI tidsserier og basert på optimalisering og registrering teknikker som brukes i flørt, et helautomatisk verktøy for lineær (affine) inter-modal hjerne image registrering. Sjekk alltid etterpå hvis resultatet er tilfredsstillende.

5,3 Brain segmentering

  1. Slett alle ikke-hjernevev fra et bilde av hele hodet for både 4D tidsseriene som 3D anatomiske bildet. For dette har vi brukt FSL verktøyet BET (Brain Extraction Tool 2,1 v., en del av FMRIB Software Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Standardinnstillingene er utviklet for bruk med menneskelige hjerne og er dermed ikke ideelt for rottehjernen. Vi brukte følgende parametere: fractional intensitet terskel, f = 1.0; vertikal gradient i fractional intensitet terskel, g = 0,1, og hode radius (i mm), r = 175 for de fleste dyr. Om nødvendig, kan du optimalisere disse verdiene per emne.

6. Data Analysis

Mål for statistisk analyse av MR data er å bestemme voxels som stiller ekstra varians skyldes stoffet utfordringen i en robust statistisk måte. Ulike metodiske tilnærminger er tilgjengelig for dette, selv om numerable programvarepakker. Valget du gjør er avhengig av tilgjengeligheten av programvare og kunnskap / erfaring på laboratoriet og dine spesifikke problemstillingen. Her gir vi en foreslått metode som brukes i vår lab.

6.1

  1. Før analysere MRI data, fastslår en generell lineær modell (GLM) som dataene vil bli montert. Dette kan være en enkel rute på-off modell (off for pre-drug og på for post-medikament infusjon) eller en bestemt modell basert på dataene. Vi har brukt programmet Stimulere 21 å fastsette et databasert GLM modell.
  2. Utfør en to-utvalg T-test (for eksempel i Stimulere) på alle baseline volumer vs alle post-utfordringen volumer. Alternativt, la oUT første bind (er) og volumet under der utfordringen er gitt, ettersom de ikke kan representere steady-state bildebehandling. Deretter diskriminere alle voxels med mer enn en viss% endring fra baseline. Vi brukte alle voxels med mer enn 1% endring.
  3. Neste, gjennomsnittlig tid kurset i alle disse voxels, som allerede gir deg et inntrykk av formen på modellen. På denne måten det kan avgjøres om utfordringen 1) har en umiddelbar eller forsinket effekt, 2) hvis og når virkningen når et platå og / eller peak, og 3) hvis eller når effekten avtar igjen i den tiden løpet av skanne. Eksempler er vist i figur 4A og 4B.

6.2

Det neste trinnet er da å statistisk teste den rå 4D tidsserien bilde av hvert dyr mot den tidligere etablerte GLM modell. For dette har vi brukt FSL programmet FEAT (fMRI Expert Analysis Tool, v5.98) 17,24. Men andre fMRI analyseverktøy er availaBle også. Innenfor analyseverktøyet, har et første nivå analyse for å settes opp. Dette krever følgende trinn:

  1. Sørg for å bruke de samme innstillingene for hvert dyr. Du kan velge å slette den første (to) volumer før analyse, siden steady-state avbildning ikke kan nås, men på det tidspunktet. Sett TR, dette er tiden (i sekunder) mellom starten av hver påfølgende volum. Siden du ser på effekter som kan vare hele skanning tiden, er det ikke nødvendig å sette en høy eller lav pass filter.
  2. Romlig glatte dataene for å redusere støy og bedre signal til støy (SNR) ratio. Vi valgte en FWHM kjerne på 8 mm.
  3. Nå kjører ønsket GLM-modellen på dine data. Dette er din viktigste forklaringsvariabel (EV), dvs. bølgeformen du teste dine data mot. Det GLM som var fastsatt basert på våre egne data kan sees i Figur 4C. Det er også mulighet for å legge ytterligere forvirre EV sin som bevegelse parametere,lavfrekvent støy (skanner drift) eller med fysiologiske parametre som blodtrykk for å fjerne generelle fysiologiske narkotika-effekter.
    Innenfor FEAT: Bruk FILM prewhitening. Legg timelige derivat. I Kontraster og F-tester i kategorien sette opp en kontrast. Å konvertere en enkelt EV inn en Z statistikk bilde, sette dens motsetning verdien til en. Dette gir deg alle voxels der sin tid selvfølgelig kan bli betydelig forklares med GLM. Sette verdien til -1 vil gi negative aktivering.
  4. Etter å ha gjennomført den innledende statistisk test, må det resulterende statistikken bildet som skal thresholded å vise hvilke voxels eller klynger av voxels er aktivert på et bestemt signifikansnivå. Multiple sammenligninger korreksjon er nødvendig på grunn av det store antallet hjernen voxels testet. Det FSL Programmet FEAT bruker en automatisert cluster-baserte multiple sammenligninger korreksjon basert på GRF (Gaussian Random Field) teori 25.
  5. Endelig bør dataene være romlig normalisert til en referanse bilde, for å utføre gruppe statistikk. Først registrerer de funksjonelle data til dyrene hjerne-ekstrahert anatomisk bilde, og deretter til referansebilde. Vi brukte stereotactic rottehjernen mal beskrevet av Schwarz 14 som referanse hjerne.
  6. Etter dette kan de første nivå analyser av alle dyr kombineres i høyere nivå (gruppe) statistiske analyser. Dette er svært avhengig av din egen studie design og problemstillinger.

6.3

Etter dette kan de første nivå analyser av alle dyr kombineres i høyere nivå (gruppe) statistiske analyser. Dette er svært avhengig av din egen studie design og problemstillinger.

6.4

Fysiologiske narkotika responser kan kobles eller korrelert til MR signalet, hvis ønskelig. Se også avsnitt 6.2.3 om å legge til skamme EV-tallet.

7. Representative Resultater

ove_content "> Når utfordrende stoffet (5 mg / kg iv fluoksetin) kommer inn i karsystemet, bør en klar fysiologisk respons være synlig i pusterytme (opp) og blodtrykk (ned). Disse svarene normalisere gjennomsnitt innenfor 5-10 min . I figur 3 denne blodtrykksfall er godt synlig.

Den gjennomsnittlige signal tidsforløpet bør vise en relativt stabil baseline og en klar effekt av utfordringen. Helst bør det ikke være noen utfordring uavhengig drift i signalet. Et representativt eksempel på en gjennomsnittlig signal tidsforløpet kan sees i figur 5A. Gjenstander, for eksempel åndedrett depresjon / svikt eller endringer i anestesi er ofte godt synlige i signalet. Respirasjonsdepresjon vil negativt påvirke signalet i hele hjernen. Dette kan sees i figur 5B.

Etter første nivå analysen, er aktivitetsmønsteret forventes i hovedsak å være positive og located i bestemte regioner bare (dvs. kortikale områder, hippocampus, hypothalamus og thalamus, se figur 6A). Hvis hele hjernen er deaktivert, er dette ofte en indikasjon på for dypt anestesi og / eller oksygenmangel under skanning. Et eksempel på dette kan sees i figur 6B.

Figur 1
Figur 1. Plassering av plassering av kanyler i femoral arterie og vene.

Figur 2
Figur 2 Skjematisk fremstilling av MR oppsett;. Alt utstyr må være ikke-ferromagnetisk og er koblet til en modul som lar gated erverv av bilder unngå interferens fra bevegelse på grunn av pust og / eller hjerteslag. Kroppstemperatur er også regulert gjennom en oppvarming modulen for å overvåke og kontrollere dyret temperatur under bildebehandling. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
Figur 3. Representativt eksempel på blodtrykket data. Det er en klar nedgang i blodtrykk synlig rett etter start av infusjonen (rød søyle). Normale verdier er nådd igjen innen 10 min. Etter utfordringen administrasjon.

Figur 4
Figur 4. A) Forventet aktivering mønster ved hjelp av MR analyseprogram Stimulere (rød er positiv aktivisering, er blå negativ aktivering). B) Gjennomsnittlig tid løpet av alle aktiverte voxels (≥ 1% endring fra baseline) i alle dyr. C) Eksempel på den resulterende GLM-modellen i FSL / FEAT. ClÆsj her for å se større figur.

Figur 5
Figur 5.

  1. Eksempel på positiv aktivisering. Tiden kurs i de aktiverte voxels (rød) følger omtrent form av GLM-modellen. Infusjon av stoffet startet rundt tidspunktet åtte.
  2. Eksempel på negativ aktivering i hele hjernen etter altfor dyp anestesi. Tiden kurs i de negativt aktiverte voxels (blå) viser en generell nedgang i signal og ingen effekt av utfordringen er synlig.

Klikk her for å se større figur .

Figur 6
Figur 6.

  1. Forventet aktivitetsmønsteret etter første nivå analyse. Aktivering av klynger av voxels (rødt til yellow), kun i bestemte hjerneområder.
  2. Eksempel på "dårlige" aktivering mønster. Hele hjernen negativ aktivering (blå) i samme dyr som i figur 5B.

Discussion

5-HT phMRI er en lovende verktøy for å vurdere signalfunksjon i dyr in vivo. Det visualiserer hjernen svar på en 5-HT utfordringen med funksjonell MR. MR har stor fordel å ha en høy romlig oppløsning og ikke trenger injeksjon av kontrast-agent eller radio-merkede molekyler og dermed unngår gjentagende eksponering for ioniserende stråling. Denne teknikken er aktuelt i både mennesker og dyr fag og derfor meget godt egnet for translasjonsforskning av nervesystemer og psykiske lidelser. Dens anvendelse er selvfølgelig ikke begrenset til 5-HT vei og har allerede vært brukt mye til å vurdere virkningene av dopaminerge medikamenter hos både dyr og mennesker 5,15 22.

Likevel er phMRI i små dyr utfordrende, som allerede påpekt i oversiktsartikler av Martin og Sibson 11 og Steward 20. En av disse utfordringene er det vedlikehold of stabile fysiologiske parametre under bildet oppkjøpet. De fleste anestesimidler kan endre kardiovaskulær funksjon og gitt at phMRI er kritisk avhengig av kardiovaskulære / hemodynamiske parametere det er viktig å sikre at eventuelle hemodynamiske endringer er utelukkende tilskrives den gitte stoffet utfordringen. Det er derfor viktig at PCO 2 nivåer forblir konstant under baseline oppkjøpet. Mekanisk ventilasjon kan for å sikre fysiologiske stabilitet, og brukes ofte i denne typen eksperimenter. Vi imidlertid valgt å bruke fri-puste dyr å la åpent muligheten til å utføre longitudinelle studier i fremtiden. I stedet har vi mye overvåket (og endret) pusterytme og blodgassverdier å sikre fysiologiske stabilitet innenfor normalområdet før start av funksjonell skanning og på denne måten å bevare stabil vaskulær reaktivitet og dermed T2 * / T2 signal. Litteratur om effekten av generelle anestetika på cerebrale hemodynamikken og metabolism er rikelig 20 og utover omfanget av dette manuskriptet. Vi valgte å bruke gass anestesi med ± 2% isofluran i denne spesifikke protokollen, fordi med inhalasjonsanestetika, kan anestesidybden være raskt og enkelt kontrolleres. Dette er viktig i oppsettet vårt for å sikre normalområdet stabile PCO 2 plan før start av bildet oppkjøpet. Isofluran er den mest brukte inhalant bedøvelse i dag og gir mulighet for rask induksjon og utvinning, noe som er viktig for longitudinelle studier. Den produserer også minimal kardiovaskulær og respiratorisk depresjon og induserer god avslapping av musklene.

For det andre er intravenøs administrering av den utfordrende stoffet mer komplisert i små dyr enn i mennesker. Operasjonen som er nødvendig for kanylering av femoral arterie og vene krever godt trente og erfarne medarbeidere. På grunn av disse invasive prosedyrer det er for øyeblikket hovedsakelig brukt i terminal prosedyrer. Imidlertid kan ikke-invasiv monitorering av blod homeostase og hale vene injeksjon brukes for longitudinelle studier 23.

I tillegg er det noen mer generelle begrensninger i teknikken, som ikke er spesifikke for dyr phMRI. I tillegg, som påpekt av Martin og Sibson 11, er en potensiell forvirre av alle fMRI studier at det antas at endringene i hjernens aktivitet evoked av utfordringen reflektere endringer i neuronal aktivitet snarere enn perifere systemiske effekter. Spesielt i dypere strukturer i hjernen, er fortsatt en relativt dårlig forståelse av nevrovaskulære kobling (forholdet mellom nerveaktiviten endringer og hemodynamiske endringer). Studier av slag utført av Logothetis 10 for å avgjøre nevrovaskulære kobling i hjernebarken ennå ikke er utført i andre deler av hjernen. Det er derfor ukjent hva en økning i BOLD signal på viktige strukturer slik striatum eller amygdala er telling oss om neuronal aktivitet. Det beste vi kan si på dette tidspunktet er at hjernen regionen reagerer på den gitte utfordringen og at avhengig av behandling og / eller forhold, kan vi overvåke de betydelige endringene i hjernen reaktivitet. Dette kan i stor grad kontrolleres ved å se på både MRI data og fysiologiske responser. Den generelle mønster av hjerneaktivitet bør være region spesifikk og begrenset til områder med, i dette tilfellet, en høy 5-HT innervasjon, og ikke så mye en generell vaskulær respons. Også er en annen timelig profil mellom vaskulære og hemodynamiske forandringer forventet. Mens blodtrykk forandringer tilbake til sine opprinnelige verdier i løpet av noen minutter, er effekten av stoffet på BOLD aktivering i tilfelle av fluoksetin synlig fram til slutten av bildet oppkjøpet og tilsvarer de kjenner farmakokinetiske egenskapene til dette stoffet. Til slutt bør de fysiologiske responser av alle dyr være lik for å få inter-fag sammenligninger. Nonetheless, er det kjent at en nevrogen regulering av lokal blodstrøm av 5-HT eksisterer fire. Derfor kan det ikke utelukkes at lokale endringer av dristige signal kan tilskrive vaskulære endringer som følge av frigjøring av 5-HT ved nærhet av skip. Selv om disse effektene ikke er knyttet til lokal neuronal aktivering og kan således betraktes som falske positive resultater, er det også en indeks av den samlede spesifikk funksjon av 5-HT-systemet (se også 3.).

Kritiske trinn av denne teknikken er derfor å overvåke fysiologiske responser mye og å sørge for at de fysiologiske forholdene i dyret er stabilt før og under bildet oppkjøpet. Også skanner forholdene skal være så stabil som mulig og nøyaktig den samme for hvert dyr. Signal stabilitet sekvensen din bør kontrolleres og bekreftes før starten av eksperimentet. Videre sørge for alltid å ha stor nok statistisk styrke, selv med liten gjenstand Groups. For en fin gjennomgang på de eksperimentelle hensynet til dyr phMRI generelt, se Steward 20 og for ytterligere eksempel på en eksperimentell protokoll for farmakologisk fMRI i rotter og mus, se Ferrari fem.

Mulige endringer av teknikken beskrevet her er mange. Man kunne:

  1. bruker et annet legemiddel for 5-HT utfordring, for eksempel en annen SSRI eller 5-HT reseptor (maur) agonister 16,13,18,7 eller til og med en dobbel utfordring i å avdekke underliggende mekanismene for narkotika handling 6,19;
  2. bruker en annen eksperimentell oppsett, for eksempel en annen bedøvelse regime, mekanisk ventilasjon, blod-pool kontrastmidler i stedet for Fet 15, longitudinelle studier (dyr må holdes i live, så ingen invasiv blodtrykk / blod gassmåling og / eller mekanisk ventilasjon er mulig), eller til og med kombinasjoner med andre (invasiv) metoder som innspillingen av neuronal aktivitet ved hjelp av MR-kompatible electrodes 10 eller PET / SPECT studier 4;
  3. bruke ulike MR dataanalyse metoder som "p-blokk 'metode for McKie 12 eller funksjonell tilkobling analyse 15.

Hvilke valg du gjør i det eksperimentelle oppsettet er svært avhengig av mulighetene for og / eller erfaring innenfor ditt laboratorium og den type problemstilling du ønsker å svare.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er finansiert av den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO) (Veni nei. 916.86.125), tildelt L. Reneman. Finansieringskilden hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Det er ingen interessekonflikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott Laboratories No B506 Mix with medical air
Medical air BOC Healthcare
Heating pad Harvard Apparatus 507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Silk ligature Harvard Apparatus 2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631
PE-50 Cannula Scientific Laboratory Supplies LTD Portex Tubing PE 0.58x0.96mm 0.58 ID 0.96 OD mm
Heparin sodium Leo Laboratories Heparin sodium 1000IU/ml 15 U/ml
Vetbond Tissue Adhesive 3M MVetbond Tissue Adhesive
Monitoring system SA Instruments http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system Monitors respiration and temperature
Pressure transducer Biopac Systems, Inc. BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW Monitors blood pressure
RapidLab blood gas analyzer Siemens AG RAPIDLab 248/348 Systems
4.7T animal scanner Agilent Technologies 4.7T frequency 199.845 MHz
MR compatible stereotactic bed m2m Imaging Corp Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Coil m2m Imaging Corp Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Fluoxetine Hydrochloride Sigma-Aldrich F-132 5mg/kg in saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  2. Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
  3. Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
  4. Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
  5. Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
  6. Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
  7. Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
  8. Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
  9. Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
  10. Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
  11. Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
  12. McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
  13. Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
  14. Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
  15. Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
  16. Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
  17. Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
  18. Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
  19. Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
  20. Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
  21. Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
  22. Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
  23. Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
  24. Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. OUP. (2001).
Bruk av Farmakologisk-utfordring fMRI i pre-klinisk forskning: Søknad til 5-HT-systemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).More

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter