Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Användning av farmakologisk-utmaning fMRI i Pre-klinisk forskning: Ansökan till 5-HT-systemet

doi: 10.3791/3956 Published: April 25, 2012

Summary

Målet med denna teknik är att utvärdera serotonin (5-HT) neurotransmittorfunktion i levande och fri-andning djur med farmakologisk magnetisk resonanstomografi (phMRI) och en intravenös utmaning med en selektiv serotoninåterupptagshämmare (SSRI), fluoxetin.

Abstract

Farmakologisk MRI (phMRI) är en ny och lovande metod för att studera effekterna av ämnena på hjärnans funktion som i slutändan kan användas för att reda ut bakomliggande neurobiologiska mekanismer bakom narkotika åtgärder och neurotransmittor-relaterade störningar, såsom depression och ADHD. Liksom de flesta av de avbildningsmetoder (PET, SPECT, CT) den representerar ett framsteg i utredningen av sjukdomar i hjärnan och den därmed sammanhängande funktion neurotransmittor vägar på ett icke-invasivt sätt med avseende på den totala nervkopplingar. Dessutom är det ger också det perfekta verktyget för översättning till kliniska undersökningar. MRI, medan den fortfarande kvar i molekylära diagnostisk radiologi för jämfört med PET och SPECT, har den stora fördelen att ha en hög spatial upplösning och inget behov för insprutning av en kontrast-medel eller radio-märkta molekyler, och därigenom förhindra att upprepad exponering för joniserande strålning . Funktionell MRI (fMRI) används i stor utsträckning i forskning och klinisk miljö, där det är generally kombinerat med en psyko-motor uppgift. phMRI är en anpassning av fMRI möjliggöra granskning av ett enskilt signalsubstans, såsom serotonin (5-HT), under fysiologiska eller patologiska tillstånd efter aktivering via administrering av en specifik utmanande läkemedel.

Syftet med den här beskrivna metoden är att utvärdera hjärnan 5-HT-funktionen, i fri-andning djur. Genom att utmana det 5-HT-systemet samtidigt förvärva funktionell MR bilder över tiden, kan svaret i hjärnan på denna utmaning visualiseras. Flera studier på djur har redan visat att läkemedelsinducerade ökningar i extracellulära nivåer av t ex 5-HT (släppmedel, selektiva SSRI-blockerare, etc.) frammanar region-specifika förändringar i blodets syresättning nivåberoende (BOLD) MRI signaler (signal på grund av till en förändring av de oxygenerade / syrefattigt hemoglobin som inträffar under hjärnan aktivering genom en ökning av blodtillförseln att tillföra syre och glucose de krävande neuroner) tillhandahålla ett index av neurotransmittorfunktion. Det har också visat sig att dessa effekter kan reverseras genom behandlingar som minskar 5-HT tillgänglighet 16,13,18,7. Hos vuxna råttor, har FET signalförändringar efter akut administrering SSRI har beskrivits i flera 5-HT-relaterade hjärnregioner, dvs kortikala områden, hippocampus, hypotalamus och thalamus 9,16,15. Stimulering av 5-HT och dess svar på denna utmaning kan därmed användas som ett mått på dess funktion i både djur och människor 2,11.

Protocol

Förberedelser djur för in vivo MRI

1. Kirurgisk Kanylering

  1. Bedöva råtta (Wistar råtta, 200-300 g) med isofluran (5% induktion och därefter reduceras till 1,5-2% för underhåll av anestesi under djurets beredning och scanning) som ges i medicinsk luft (21% O 2, BOC Storbritannien) . Se till att djuret är väl bedövas och uppvisar något svar på en tå nypa. Femoral artär och ven kanyleras för blod gas och blodtrycksmätningar och administration av läkemedlet utmaningen respektive. Under det kirurgiska förfarandet är djurets kroppstemperatur övervakas och upprätthållas genom en rektal sond och en värmefilt (Harvard Apparatus).
  2. Den bedövade djuret är placerad på en värmedyna under ett dissektionsmikroskop i dorsala VILA. Raka mitten låret och torka av huden med alkohol. Gör en 2 snitt cm huden längs vecket som bildas av buken och höger lår.Trubbig dissektion av de adduktorer används för att visualisera den femorala artären, venen och den femorala nerven. Separera försiktigt fartygen.
  3. Försiktigt knyta en silkesligatur helt runt den distala änden av kärlet och placera en slips med hälften av en kirurgisk knut löst i den proximala platsen. Tillämpas dragkraft på båda ligaturer, att täppa till blodflödet i den återstående mittpartiet av kärlet frilagd mellan ligaturer. Göra en liten incision av omkring en tredjedel av kärlets omkrets i denna del av kärlet för att medge införing av en PE-50 kanyl (0,54 mm inre diameter och 0.96mm för ytterdiameter i fallet med vuxna hanråttor, annars 0,40 mm ID och 0,80 mm DE) till kärlet.
  4. Kanylen skall införas flera mm (åtminstone 5) in i kärlet. När väl in i lumen, spola en liten mängd av hepariniserad saltlösning (15 Ul / ml) genom kärlet för att undvika bildning av blodpropp. Den proximala siden slingan är också ligeras helt för att fixera kanylen. REPEAT proceduren för det andra kärlet. Limma huden med en Vetbond vävnadsadhesiv (3M Storbritannien plc, Bracknell, Storbritannien) när båda kanyler är på plats. Se figur 1 för exakt placering av kanylerna.
  5. Placera djuret i en MR-kompatibel stereotaktisk bädd (M2M Imaging Corp, USA) i en liggande ställning. Behåll huvudet på djuret genom införandet av örat barer och en tand bar. Vid denna punkt, kan djuret placeras i MRI-scanner för avbildning. Djuret är fortfarande bedövade och är fri andning under hela avbildning förfarandet.

2. Övervakning

Under hela avbildning förfarandet bör flera fysiologiska reaktioner ständigt övervakas och hållas så konstant som möjligt. Detta är väsentligt, eftersom dessa responser kan variera kraftigt över samma tidsfönster som phMRI signalen och även påverka signalen av intresse. Det är också viktigt, eftersom djuret kommer att placeras i magnet och är därför ur synhåll och inte mottaglig för vanliga kontroller av bedövning djup (t.ex. tå nypa), för att säkerställa tillräcklig bedövning djup. Dessutom med tanke på att många läkemedel förändrar kardiovaskulära parametrar såsom blodtryck, är mätningar av dessa avgörande för att säkerställa hänsyn kan tas till globala fysiologiska effekter av läkemedlet agerande i phMRI data. Se även avsnitt 4 för de grundläggande värderingar och de förväntade svaren infusion på 5 mg / kg fluoxetin.

  1. Kroppstemperaturen hålls vid 37 ± 1,5 ° C genom en varm luftvärmesystem (SA Instruments, New York, USA). Tänk på att MR kan påverka temperaturmätning, kontrollera detta med ditt eget system.
  2. Övervaka och registrera djurets andningsfrekvensen med hjälp av en respiratorisk manschett kopplad till tryckgivare (SA Instruments, New York, USA).
  3. Spela invasiv blodtryck med hjälp av en tryckgivare (TSD104A, BIOPAC Systems Corp, USA) och regelbundet ut ettd analysera arteriella blodprover gas (RapidLab, Siemens diagnostisk) via kanyl lårbensartären under avbildning för att övervaka arteriellt pCO 2 och partialtrycket för syre (PO2).
  4. Använda den kanylerade lårbensvenen som den huvudsakliga infusionsslangen för farmakologisk utmaning (fluoxetin (fluoxetinhydroklorid från Sigma-Aldrich, Storbritannien), 5 mg / kg, löst i saltlösning).

Avbildning in vivo

En schematisk representation av fMRI experimentuppställning ges i figur 2.

3. Bildgivande Parametrar

  1. När djuret är placerad inuti scannern och fortsätter att visa stabila fysiologiska responser, kan avbildning börja. I våra studier använde vi en 4,7 T litet djur MRI system (Agilent Technologies) med en cylindrisk kvadratur sändning / mottagning RF spole med 72 mm inre diameter (M2M Imaging Corp, USA). Gör en tre bildplan scout korrekt p Sparaprövade hjärnan i mitten av MRI synfältet och använda lokal shim korrigering (fastmap sekvens) för att förbättra det magnetiska fältet homogeniteten i hjärnan.
  2. För varje djur först skaffa en T2-viktad anatomisk bild volym för registrering och segmentering ändamål. Vi använde en turbo sekvens spinn eko med eko tåglängd = 8; matrix size = 256 x 256, FOV = 50 x 50 mm 2, med interfolierade förvärv av 30 sammanhängande koronala skivor med 1 mm tjocklek, centrerat 8 mm kaudalt till den bakre kanten av luktbulben, genomsnitt = 4, TR / TE = 5112/60 ms.
  3. Se till att djuret dess fysiologiska reaktioner är konstanta innan phMRI sökningen. För tidsserier förvärvet använde vi samma T2-viktade turbo sekvensen spinn eko med eko tåget längd = 16; matrix size = 128 x 128, med interfolierade förvärv av 20 sammanhängande skivor med 1 mm tjocklek centrerad på samma position, TR / TE = 4915/60 ms. Totalt förvärvade vi 32 tidpunkter med encquisition tid 158 sek per tidsserier volym och en total genomsökning tid av 84 min. Den första volymen används som en "dummy scan" att ta itu med T1 mättnads ​​effekter och används inte i dataanalysen. Andra fMRI sekvenser såsom gradient eko eller ekot plan avbildning (EPI) sekvenser kan också användas. Se till att bedöma signalen stabiliteten i din sekvens av val innan start experimentet.
  4. Förvärva ett antal grundläggande volymer före administrering utmaningen medicinering. Vi föreslår minst 10 minuter baslinje förvärvet under stabila förhållanden. Starta infusionen vid exakt samma tidpunkt för alla djur. I vår protokoll började vi administration i början av den 9 volymen (efter ca 21 min baslinje scanning). Efter infusion fortsatte bildtagning ytterligare 60 minuter (32 volymer totalt). Se efter infusionen är lång nog för att visualisera förändringar och nå steady state eller återvinning av signalen, beroende på din forskning questipå och ditt val av läkemedel utmaning.
  5. När bilden förvärvet är klar, ta bort djuret från skannern. Utför en slutlig mätning blodgas för att säkerställa stabilitet blodgasparametrar och för att möjliggöra utvärdering av läkemedels effekter på grundläggande fysiologi.

Databehandling

4. Fysiologiska svar

Förväntade fysiologiska svar på utmaning är beroende av det valda läkemedlet. Nedan är allmänt accepterade baslinjevärden (av vuxna hanråttor) och de förväntade reaktioner på iv infusion på 5 mg / kg fluoxetin ges.

  1. Andningsfrekvens bör vara stabil på 45-75 andetag / minut. Den farmakologiska utmaning av fluoxetin inducerar en kort upphov (15-20%) i andningsfrekvensen.
  2. Blodtrycket bör vara konstant och mellan 100-150 mmHg (BIOPAC Systems Corp, Goweta, USA). Den fluoxetin Utmaningen inducerar en kort men brant minskning med ca 20% av det arteriella blodtrycket.Detta bör återhämta sig inom 5-10 minuter. Detta visas i figur 3.
  3. Blodgaser värden ska vara stabila (åtgärd minst två gånger) och inom följande områden innan du startar phMRI scan: pCO 2, 35-45 mmHg, pOa 2, 80-130 mmHg, pH, 7.35-7.45. Kontrollera alltid dessa värden igen efter skanning för att se om djuret förblev stabil och för att möjliggöra utvärdering av läkemedels effekter på grundläggande fysiologi. Höga PCO2-värden kommer att leda till vasodilatation och därmed undvika att se BOLD signal förändringar.
  4. Se till att djuret är under en kontinuerlig och konstant nivå av anestesi (2 ± 0,25%, högre nivåer kan orsaka depression cerebrovaskulär reaktivitet och lägre otillräckliga narkos och därmed rörelse), innan phMRI skanning och allt, undvika justeringar i anestesi regimen (t.ex.% isofluran och / eller gasflöde) under den funktionella bilden förvärvet som detta kan också påverka BOLD signalen.

Här beskriver vi ett antal steg i förbehandling av MR data för att optimalize data för statistisk analys. Vi nämner de verktyg som används i vårt labb, hur många olika verktyg finns tillgängliga.

5,1 Data beredning

  1. Sätt råa bilder i rätt filformat för MRI-analys programvara som du föredrar att använda (NIfTI1.1 eller Analyze7.5 format för FSL program). Flera gratis filkonverterare program finns tillgängliga online. Beroende på den använda scannern, kan det vara nödvändigt att först konstruera en 3D (anatomiskt scan) eller 4D (phMRI scan) bild av alla olika 2D skivor. Detta kan göras med användning av en program bildbehandling, såsom ImageJ 1.
  2. För att säkerställa kompatibilitet med analys algoritmer designade för användning med humandata (t.ex. FSL program), har voxel storlek multipliceras med en faktor 10 (detta kan också göras med till exempel ImageJ). I vår studie resulterade detta i en voxel storlek av 3,91 x 3,91 x 10 mm 3.
  3. Visuellt kontrollera dina bilder för oegentligheter i orientering, föremål, och rörelse. Var noga med att inte använda skanningar med tydliga artefakter eller överdriven rörelse i dina analyser som de snedvrider dig resultat.
  4. Orientering av alla sökningar ska vara lika mellan de anatomiska och funktionella bilder och i överensstämmelse med den använda referens hjärnan. I vår studie har vi använt stereotaktisk mallen råtthjärna beskrivs av Schwarz 14. Den FSL kommando fslswapdim kan användas för omorientering.

5,2 Rörelse korrigering

  1. För att korrigera för eventuella rörelse artefakter i 4D tidsserien, använde vi rörelsen McFlirt korrigering verktyg (Motion korrigering med hjälp FMRIB linjära Tool Image registrering, en del av FMRIB Software Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT är en intra-modal rörelse korrigering verktyg designed för användning på fMRI tidsserier och baserat på optimering och tekniker registrering används i Flirt, ett helt automatiserat verktyg för linjär (affin) intermodala hjärnan bilden registrering. Kontrollera alltid efteråt om resultatet är tillfredsställande.

5,3 Hjärna segmentering

  1. Ta bort alla icke-hjärnvävnad från en bild av hela huvudet för både 4D tidsserier som 3D anatomiska bilden. För detta använde vi FSL verktyget BET (Brain Utvinning Tool v. 2,1, en ​​del av FMRIB Software Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Standardinställningarna är utvecklade för användning med mänskliga hjärnor och är därför inte idealiska för råtthjärna. Vi använde följande parametrar: fraktionerad intensitetströskel, f = 1,0; vertikal lutning i fraktionerad intensitetströskel, g = 0,1, och huvudet radie (i mm), R = 175 för de flesta djur. Om det behövs kan du optimera dessa värden per individ.

6. Data analysis

Mål för den statistiska analysen av MR uppgifter är att fastställa voxlar som uppvisar ytterligare varians tillskrivas läkemedlet utmaningen på ett statistiskt robust sätt. Olika metodologiska tillvägagångssätt är tillgängliga för detta, även som numerable programvarupaket. Det val du gör är beroende av tillgången av mjukvara och kunskap / erfarenhet på din lab och din speciella frågeställning. Här ger vi ett förslag metod som används i vårt laboratorium.

6,1

  1. Innan analysera MRI data fastställa ett allmänt linjär modell (GLM) som uppgifterna kommer att monteras. Detta kan vara en enkel kvadrat på-off modell (off för pre-drug och för post-drug infusion) eller en specifik modell baserad på data. Vi har använt programmet Stimulera 21 för att fastställa en databaserad GLM modell.
  2. Utför en två-Sample t-test (till exempel i Stimulera) på alla baseline volymer jämfört med alla post-utmaning volymer. Alternativt, lämna oUT den första volymen (er) och volymen under vilken utmaning är given, eftersom de inte får företräda steady-state imaging. Därefter diskriminera alla voxlar med mer än en viss% förändring från utgångsvärdet. Vi använde alla voxlar med mer än 1% förändring.
  3. Därefter genomsnitt tidsförloppet i alla dessa voxlar, som redan ger dig ett intryck av formen av modellen. På detta sätt kan bestämmas om utmaningen 1) har en omedelbar eller fördröjd effekt, 2) om och när effekten når en platå och / eller topp och 3) om eller när effekten avtar igen under tiden loppet av skanna. Exempel visas i figur 4A och 4B.

6,2

Nästa steg är då att statistiskt testa den råa 4D bilden tidsserier av varje djur mot den etablerade förra GLM modell. För detta har vi använt FSL programmet FEAT (fMRI Expert Analysis Tool, v5.98) 17,24. Emellertid är andra fMRI analysverktyg är tillgängble också. Inom analysverktyget, har en första nivå analys som skall inrättas. Detta kräver följande steg:

  1. Se till att använda samma inställningar för varje djur. Du kan välja att radera de första (två) volymer före analys, eftersom steady-state imaging inte kan nås men på den punkten. Ställ TR, det är den tid (i sekunder) mellan starten av varje successiv volym. Eftersom du tittar på effekter som kan pågå hela söktiden, finns det ingen anledning att ställa in en hög eller låg pass filter.
  2. Rumsligt utjämna uppgifter för att minska bullret och förbättra signal-brus (SNR) förhållande. Vi valde en FWHM kärna av 8 mm.
  3. Nu kör önskade GLM modellen på dina data. Detta är din huvudsakliga förklarande variabel (EV), dvs vågformen du testar dina data mot. GLM som var bestämmas baserat på våra egna data kan ses i figur 4C. Det finns också möjlighet att lägga till ytterligare förväxla EVs såsom rörelseparametrar,lågfrekvent brus (scanner avdrift) eller till och med fysiologiska parametrar, såsom blodtryck för att avlägsna allmänna fysiologiska läkemedelsinnehållande effekter.
    Inom FEAT: Använd FILM prewhitening. Lägg till temporal derivat. I Kontraster och F-test på fliken skapa en kontrast. Om du vill konvertera en enstaka EV i en Z-statistik bild som dess kontrast värdet till 1. Detta ger dig alla voxlar där tidsförloppet kan avsevärt förklaras av GLM. Ställa in värdet till -1 kommer att ge negativa aktivering.
  4. Efter att ha genomfört den första statistiskt test måste den resulterande statistiken bild som ska tröskel för att visa vilka voxlar eller grupper av voxlar aktiveras vid en viss signifikansnivå. Flera jämförelser korrigering behövs på grund av det stora antalet i hjärnan testade voxlar. Det FSL Programmet FEAT använder en automatiserad klusterbaserade multipla jämförelser korrigering baserad på GRF (Gauss Random Field) teori 25.
  5. Slutligen bör uppgifterna rumsligt normaliserad till en referensbild, så att utföra grupp statistik. Först registrera de funktionella data till djuren hjärnan extraherade anatomiska bilder och sedan till referensbild. Vi använde den stereotaktiska mallen råtthjärna beskrivs av Schwarz 14 som referens hjärna.
  6. Efter detta kan den första nivå analysera alla djur kombineras i högre nivå (grupp) statistiska analyser. Detta är mycket beroende av din egen studie design och frågeställningar.

6,3

Efter detta kan den första nivå analysera alla djur kombineras i högre nivå (grupp) statistiska analyser. Detta är mycket beroende av din egen studie design och frågeställningar.

6,4

Fysiologiska responser läkemedel kan kopplas eller korrelerad till MR-signalen, om så önskas. Se även avsnitt 6.2.3 om att lägga förväxla EV-talet.

7. Representativa resultat

ove_content "> När utmanande drogen (5 mg / kg iv fluoxetin) kommer in i kärlsystemet, bör en tydlig fysiologisk reaktion synas i andningsfrekvensen (upp) och blodtryck (ner). Dessa svar normaliseras i genomsnitt inom 5-10 min . I figur 3 denna blodtrycksfall är klart synlig.

Den genomsnittliga Signalen tidsförloppet bör visa en relativt stabil baslinje och en tydlig effekt av utmaningen. Företrädesvis bör det inte finnas någon utmaning-oberoende driften i signalen. Ett representativt exempel på en genomsnittlig signal tidsförloppet kan ses i fig. 5A. Artefakter, såsom andning depression / misslyckande eller förändringar i anestesi är ofta syns tydligt i signalen. Andningsdepression kommer att negativt påverka signalen i hela hjärnan. Detta kan ses i fig. 5B.

Efter första nivån analys är aktiveringen mönstret väntas i huvudsak vara positiv och locaTed i vissa regioner endast (dvs. kortikala områden, hippocampus, hypotalamus och thalamus, se figur 6A). Om hela hjärnan är inaktiverad, är detta ofta ett tecken på för djupt bedövning och / eller syrebrist under skanning. Ett exempel på detta kan ses i Figur 6B.

Figur 1
Figur 1. Läge för placering av kanylerna i den femorala artären och venen.

Figur 2
Figur 2 Schematisk framställning av MRI installationen,. All utrustning måste vara icke-ferromagnetiska och är ansluten till ett modulsystem som gör det möjligt gated förvärvet av bilder undvika störningar från rörelse på grund av andning och / eller hjärta slå. Kroppstemperatur regleras även genom en värmningsmodul att övervaka och styra djuret temperatur under avbildning. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Representativa exempel på blodtrycksdata. Det finns en tydlig minskning i blodtryck synlig direkt efter starten av infusionen (röd bar). Normala värden uppnås igen inom 10 minuter. efter utmaningen administration.

Figur 4
Figur 4. A) Förväntad aktivering mönstret med hjälp av MRI-analys programmet Stimulera (röd är positivt aktivering är blå negativt aktivering). B) Genomsnittlig tidsförloppet för alla aktiverade voxlar (≥ 1% förändring från utgångsvärdet) i alla djur. C) Exempel på den resulterande GLM-modellen i FSL / FEAT. Click här för att visa en större bild.

Figur 5
Figur 5.

  1. Exempel på positiv aktivering. Tidsförloppet i de aktiverade voxlar (röd) följer ungefär form GLM-modellen. Infusion av läkemedlet började runt tidpunkten 8.
  2. Exempel på negativa aktivering i hela hjärnan efter alltför djup anestesi. Tidsförloppet i negativt aktiverade voxlar (blå) visar en allmän nedgång i signal och ingen effekt av utmaningen är synlig.

Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6
Figur 6.

  1. Förväntad aktivering mönstret efter första nivån analys. Aktivering av kluster av voxlar (röd till yellow), endast i specifika områden i hjärnan.
  2. Exempel på "onda" aktivering mönster. Hela hjärnan negativ aktivering (blå) i samma djur som i figur 5B.

Discussion

5-HT phMRI är en lovande verktyg för att utvärdera neurotransmittorfunktion i djur in vivo. Det visualiserar hjärnan svar på en 5-HT utmaning med funktionell MR. MRT har den stora fördelen att ha en hög spatial upplösning och att inte behöva injektionen av kontrast-medel eller radio-märkta molekyler på så sätt undvika den upprepad exponering för joniserande strålning. Denna teknik är tillämpbar i både människa och djur ämnen och därför mycket lämplig för translationell forskning av neurotransmittor system och psykiska störningar. Dess tillämpning är naturligtvis inte begränsad till 5-HT vägen och har redan använts i stor utsträckning för att bedöma effekterna av dopaminerga läkemedel i både djur 5,15 och människor 22.

Icke desto mindre är phMRI i små djur utmanande, som redan påpekats i översiktsartiklar av Martin och Sibson 11 och Steward 20. En av dessa utmaningar är att upprätthålla of stabila fysiologiska parametrar under bilden förvärvet. De flesta anestetika kan förändra kardiovaskulär funktion och eftersom phMRI är kritiskt beroende av kardiovaskulära / hemodynamiska parametrar är det viktigt att se till att alla hemodynamiska förändringar enbart tillskrivas den givna läkemedlet utmaningen. Det är därför oerhört viktigt att PCO2 nivåer vara konstant under baslinjen förvärvet. Mekanisk ventilation kan bidra till att säkerställa fysiologiska stabilitet och används ofta i denna typ av experiment. Vi valde dock att använda gratis-andning djuren att lämna möjligheten öppen att genomföra longitudinella studier i framtiden. Istället kontrolleras vi omfattande (och förändrad) andningsfrekvens och blodvärden gas för att säkerställa fysiologisk stabilitet inom de normala intervallen före start av den funktionella skanna och på så sätt att bevara en stabil vaskulär reaktivitet och därmed T2 * / T2 signal. Litteratur om effekterna av narkosmedel på cerebrala hemodynamiken och metabolism är riklig 20 och utanför ramen för detta manuskript. Vi valde att använda gas-anestesi med ± 2% isofluran i detta specifika protokoll, eftersom med inhalationsanestetika, kan djupet av anestesi vara snabbt och enkelt styras. Detta är viktigt i vår inställning att säkerställa normala stabila PCO2 nivåer före start av bilden förvärvet. Isofluran är den vanligaste inhalationsmedel narkos idag och möjliggör snabb induktion och återhämtning, vilket är viktigt för longitudinella studier. Det ger också minimal kardiovaskulär och respiratorisk depression och inducerar en god avslappning av muskler.

För det andra är den intravenösa administrationen av den utmanande läkemedlet mer komplicerad i små djur än hos människor. Operationen som behövs för kanylering av den femorala artär och ven kräver välutbildad och erfaren personal. På grund av dessa ingrepp är det just nu främst i terminal förfaranden. Emellertid kan icke-invasiv övervakning av blod homeostas och svansveninjektion användas för longitudinella studier 23.

Dessutom finns det några mer generella begränsningar tekniken, som inte är specifika för djur phMRI. Dessutom, såsom påpekats av Martin och Sibson 11 är en potentiell förväxla av alla fMRI studier att det antas att de förändringar i hjärnans aktivitet som framkallas av utmaningen återspegla förändringar i neuronal aktivitet snarare än perifera systemiska effekter. Särskilt i djupare hjärnstrukturer fortfarande en relativt dålig förståelse för neurovaskulära koppling (förhållandet mellan neuronala aktivitet förändringar och hemodynamiska förändringar). Studier av den typ som utförs av Logothetis 10 för att bestämma neurovaskulära koppling i cortex har ännu inte utförts på andra delar av hjärnan. Det är därför okänt vad en ökning med fet stil signalen i viktiga strukturer, striatum eller amygdala är telling oss om neuronal aktivitet. Det bästa vi kan säga just nu är att hjärnan regionen reagerar på den givna utmaningen och att beroende på behandling och / eller villkor, kan vi övervaka stora förändringar i hjärnan reaktivitet. Detta kan till stor del kontrolleras genom att titta på både MR data och fysiologiska reaktioner. Det allmänna mönstret för hjärnans aktivering bör vara region specifik och begränsad till områden med, i detta fall, en hög 5-HT innervation, och inte så mycket en allmän vaskulär svar. Dessutom är en annan tidsprofil mellan vaskulära och hemodynamiska förändringar förväntas. De blodtrycksförändringarna återgår till det ursprungliga värden inom några minuter, är effekten av läkemedlet på BOLD aktivering i fallet med fluoxetin synlig fram till slutet av bilden förvärvet och svarar mot de känner farmakokinetiska egenskaperna hos detta läkemedel. Slutligen bör de fysiologiska svaren från samtliga djur vara lika för att göra inter-individuell jämförelser. Nonetheless är det känt att en neurogen reglering av den lokala blodflödet av 5-HT finns 4. Därför kan det inte uteslutas att de lokala ändringarna i FET-signalen kan hänföra till vaskulära förändringar på grund av frisättning av 5-HT vid den närhet av kärl. Även om dessa effekter inte är associerade med lokal neuronal aktivering och kan således betraktas som falska positiva resultat, är det också ett index på den totala specifika funktionen hos 5-HT-systemet (se även 3).

Kritiska steg i denna teknik är därför att övervaka fysiologiska reaktioner omfattande och att se till att de fysiologiska villkoren för djuret är stabila före och under bilden förvärvet. Också scanner betingelser bör vara så stabil som möjligt och exakt desamma för varje djur. Signal stabiliteten i din sekvens ska kontrolleras och bekräftas innan start experimentet. Dessutom, se till att alltid ha tillräckligt stor statistisk styrka, även med små föremål Groups. För en trevlig recension om experimentella överväganden av animaliskt phMRI i allmänhet, se Steward 20 och för ett ytterligare exempel på en experimentell protokoll för farmakologisk fMRI hos råttor och möss, se Ferrari 5.

Eventuella ändringar av teknik som beskrivs här är många. Man skulle:

  1. använda en annan läkemedel för 5-HT utmaning, t.ex. en annan SSRI eller 5-HT-receptor (ANT) agonister 16,13,18,7 eller ens en dubbel utmaning för att avslöja underliggande mekanismer läkemedelsverkan 6,19;
  2. använda en annan experimentuppställning, såsom en annan anestesi regim, mekanisk ventilation, blod-pool kontrastmedel i stället av djärva 15, longitudinella studier (djur måste hållas vid liv, så ingen invasivt blodtryck / blodgas mätning och / eller mekanisk ventilation är möjligt), eller till och med kombinationer med andra (invasiv) metoder såsom inspelning av nervaktivitet med MR-kompatibel electrodes 10 eller PET / SPECT-studier 4;
  3. använder olika MRI metoder för dataanalys, såsom 'p-block "-metoden för McKie 12 eller funktionell anslutning analys 15.

Vilka val du gör i den experimentella uppställningen är starkt beroende av möjligheterna av och / eller erfarenhet inom din lab och vilken typ av frågeställning du skulle vilja svara.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete finansieras av Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) (Veni nr. 916.86.125), tilldelas L. Reneman. Den finansiär hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Det finns inga intressekonflikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott Laboratories No B506 Mix with medical air
Medical air BOC Healthcare
Heating pad Harvard Apparatus 507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Silk ligature Harvard Apparatus 2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631
PE-50 Cannula Scientific Laboratory Supplies LTD Portex Tubing PE 0.58x0.96mm 0.58 ID 0.96 OD mm
Heparin sodium Leo Laboratories Heparin sodium 1000IU/ml 15 U/ml
Vetbond Tissue Adhesive 3M MVetbond Tissue Adhesive
Monitoring system SA Instruments http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system Monitors respiration and temperature
Pressure transducer Biopac Systems, Inc. BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW Monitors blood pressure
RapidLab blood gas analyzer Siemens AG RAPIDLab 248/348 Systems
4.7T animal scanner Agilent Technologies 4.7T frequency 199.845 MHz
MR compatible stereotactic bed m2m Imaging Corp Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Coil m2m Imaging Corp Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Fluoxetine Hydrochloride Sigma-Aldrich F-132 5mg/kg in saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  2. Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
  3. Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
  4. Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
  5. Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
  6. Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
  7. Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
  8. Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
  9. Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
  10. Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
  11. Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
  12. McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
  13. Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
  14. Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
  15. Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
  16. Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
  17. Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
  18. Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
  19. Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
  20. Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
  21. Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
  22. Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
  23. Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
  24. Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. OUP. (2001).
Användning av farmakologisk-utmaning fMRI i Pre-klinisk forskning: Ansökan till 5-HT-systemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).More

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter