Summary
方法文化在整个内部的微血管大小通道（<30微米）的微流体装置的三维表面的内皮细胞单层描述。这
Abstract
在微细加工技术的进步使生产价格低廉，可重复的微流体系统进行生物和生化实验，在微，和nanoscales 1,2。此外，微流体也被专门用于定量分析血液和微血管的过程，因为他们有能力轻松地控制流体的动态环境和生物条件3-6。因此，研究人员最近利用微系统研究血细胞变形，血细胞聚集，微血管血流量，血细胞-内皮细胞相互作用6-13。然而，这些微系统并未包括培养的内皮细胞或较大比sizescale微血管的病理过程有关。与内皮细胞的微流体平台，准确地概括蜂窝，物理，和hemodyn微循环的的AMIC环境需要进一步的我们涉及微血管的血液系统疾病的生物物理基础病理生理学的理解。
在这里，我们报告的方法， 在体外微血管模型创建的“内皮化”，用一个简单的，单一的掩膜微细加工工艺标准的内皮细胞培养技术，研究发生在血液病的病理生物物理微血管相互作用结合。这种“微血管上的单芯片”的研究者提供了一个强大的检测，严格控制生物以及生物物理条件和操作使用标准的注射泵和明/荧光显微镜。如微循环血流动力学条件下，内皮细胞型，血细胞类型（S）和浓度（S），药物/抑菌浓度等参数都可以很容易地控制。正因为如此，我们的微提供方法定量调查疾病微血管流量由于改变细胞粘附，聚集和变形，无法与现有的检测能力受损的过程。
Protocol
1。内皮微器件的制备
- 外面罩供应商提交的微流体装置的电脑辅助设计（CAD）绘图，创建一个光罩。使用面膜的钠钙玻璃上镀铬层组成。在这种情况下，微通道宽度为30微米。
- 15分钟的清洁与食人鱼裸硅晶片（10:1比例的硫酸和过氧化氢）和氢氟酸浸泡30秒。与去离子（DI）水冲洗约10秒。
- 使用旋转涂布机，旋转Microchem SU-8 2025到晶圆光阻到30微米的高度。对于SU-8 2025，3000转的转速建议。 SU-8的其他粘度可将达到这个高度。 SU-8使用的完整说明可在www.microchem.com
- SU-8在95℃的烤盘上放置晶圆5分钟，以驱赶过量的溶剂。
注：烤箱将烤盘干的比晶圆不同，不建议。 - 放置在晶圆所需的要素形状的面具，暴露在紫外光（160兆焦耳/厘米2 在365 nm）在光刻（卡尔SUSS，MA-6）。这种交叉连接的光致抗蚀剂。
- 在95℃的烤盘上放置晶圆背面为额外的5分钟，以进一步加快SU-8聚合。
- 沉浸在SU-8开发的晶片，主要成分为4分钟PGMEA（丙二醇甲醚醋酸酯）除去非交联的SU-8。
- 新开发的晶圆100％异丙醇（IPA）冲洗10秒。使用加压氮，然后进行干燥处理的晶圆或使溶剂蒸发干净通风柜晶圆几分钟。
- 磁带到培养皿干晶圆图案的SU-8的边缘预发泄运动。
- 1 mL的Sigmacote中申请使用吸管的晶圆，覆盖培养皿的顶部，和漩涡晶圆，以确保完整的晶圆涂层，清除覆盖，让晶圆干燥几分钟，直到所有的溶剂蒸发。
2。的PDMS（聚二甲基硅氧烷）的制备
- 混合的PDMS聚合物和固化剂，并以10:1的比例（W / W）使用真空干燥器除去气泡。德加的PDMS所需要的时间长短不一可用真空系统的力量，但通常从几分钟到一小时不等。对于一个6英寸的Petri菜没有以前倒的，一个60毫升的聚合物总量的PDMS建议。
- 晶圆的混合物倒入，约5毫米厚。也倒入一个平底的盘创建一个PDMS薄板，约1毫米厚。治愈60°烘箱中过夜。
- 使用刀或手术刀，切出的C左右ured PDMS的设备，并从晶圆中删除它。此外，削减的PDMS薄板，略高于较大的设备。
- 创建在PDMS使用1.0毫米的打孔设备的进口和出口孔。这可以使用一个针副，哈里斯统一的核心，或类似的设备。
- 清洁设备表面和表用透明胶带。
- 使用等离子体吸尘器，暴露表面的PDMS设备和PDMS氧等离子体表为30秒。氧等离子体暴露该债券时，身体接触带来的PDMS表面活性物种。
- 小管连接到一个小的长度（几厘米）的大型油管，而这又是与钝针注射器，充满了50微克/毫升从PBS人体血浆纤维连接蛋白。管子和针头的大小摩擦适合油管之间创建。插入小管中的PDMS微装置的入口和pply压力注射器，以填补渠道完全与纤维连接解决方案，并创建一个小的出气口在100μL下降，确保渠道保持潮湿。在37°C孵育40-60分钟设备。
- 用PBS填充钝点针，连接一个新的注射器。施加压力注射器，用PBS冲洗设备。
3。播种与内皮细胞的微流体装置
- 8％右旋糖酐，准备内皮生长介质中的人脐静脉内皮细胞（内皮细胞）1,000,000细胞/毫升。已成功地应用于50万至200万细胞/ mL范围。除了细胞加载介质葡聚糖增加流体的粘度，从而降低血管内皮细胞的速度，当他们进入纤维连接蛋白涂层的微系统。这反过来，增加细胞将坚持和文化成功地在微装置的可能性。
- Çonnect步骤2.7新的注射器和油管。 （约1米长），但具有较长的油管。
- 要优化这个系统的性能，它在整个灌注系统，以防止任何泄漏或气泡在这一点上是至关重要的，任何解决方案或气泡在媒体上存在的泄漏会改变水流和防止血管内皮细胞的成功播种。因此，紧身的油管是必不可少的，以消除任何连接之间的泄漏。必须消除注射器和/或油管中的气泡，细胞之前推出的微器件和整个灌注系统应与底漆前的油管连接到微避免引入气泡的电池解决方案。
- 使用注射泵，细胞悬液注入的PDMS设备2小时37 1.23μL/ min的体积流量°C和5％CO 2。取得最佳的效果时，注射泵在作为PDMS设备相同的高度。为进气口，较长的油管，可孵化器内的盘绕，确保细胞和媒体的充分接触与设备前热身。在我们的系统中，1.23μL/ min的体积流量接近中游〜1毫米/秒的速度，最小的微，相应的壁面剪切应力的〜1达因/厘米2使用全血在这些渠道。
- 1.23μL/ min的比例为2-8天使用同一注射器泵和长管，灌注新鲜培养基。一个成功的设备将有越来越多在24-48小时内对设备内部的内皮细胞单层。以前的实验表明，适当融合单层整个设备14 VE-cadherin的表达在细胞与细胞路口。
- 血液或细胞悬液注入系统的实验。
4。代表结果
>使用_content“这个协议，标准平版印刷微细加工技术用于创建模具生产所需的微流体通道，生理模仿微血管（ 图1A）sizescale。内皮细胞，然后使用优化灌流技术，种子和confluently文化的整个微系统（ 图1B）细胞接种在24-48小时内表面。由于微系统是透明的，整个微型设备可以放置在明/荧光显微镜成像和数据收集阶段。然后我们的系统可以应用于研究涉及改变生物物理性质，化学性质，如镰状细胞病，镰刀红细胞和异常白细胞和内皮细胞的粘附增加刚性促进微血管阻塞，血液系统疾病。临床上批准的药物，羟基脲改善症状，但其direct微血管流量的影响是未知的。我们的检测需要考虑到这两种细胞的硬度和附着力，并表明，羟基脲显着改善镰状细胞病（ 图2）流动。
镰状细胞病是只有一个为微血管芯片的应用例子，这个系统非常适合研究在对方的微血管和内皮细胞与血细胞相互作用过程中，任何血液。其他临床相关应用包括炎症性疾病，败血症/肺损伤，血栓microangiopathies，疟疾，癌症转移，而更基本的应用，包括白细胞生物学及造血干细胞生物学，等等。
图1 A）最初的PDMS微内皮前的设备。在这里，微器件注入机智Ĥ食品着色，说明sizescale和整体系统的设计。乙）明场显微镜显示，微流体系统内皮细胞接种后48小时内完全使用这里描述的协议。
图2 A）微血管与微一个芯片的毛细血管后静脉（30微米），最镰状细胞微血管阻塞性事件现场的大小相若。镰状细胞贫血患者接受羟基脲和不接受羟基脲的患者全血流经两个不同的微血管上的一个芯片设备。镰状细胞内的内皮化微羟基流动相对容易接收患者的全血）。 c）在相同的血流动力学条件下，镰状细胞贫血患者不接受羟基脲的全血，然而，表现呆滞与microch流量更annel阻塞。底部的通道完全堵塞，无流和其他内皮化微流速有显着比羟基条件较低。在所有三个图像的比例尺为30μm。
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Discussion
最适合我们的内皮化微装置系统结合， 在体内实验中使用时，其还原方法可能有助于阐明在人类和动物模型中观察到的血液进程的物理机制。此外，我们的系统也不是没有限制的。例如，我们的微通道截面是方形。虽然可以制作技术上圆形微10,11，我们选择使用更简单，更标准的制造过程，让其他研究人员，随时这个系统应用到自己的工作。此外，培养内皮细胞自然“轮出”有效流明，使更多的生理系统。此外，我们的流体动力学模拟显示，在我们的系统中水流条件可比在体内的微血管。最后，最近的工作特征血流在广场1三维方型微已经表明，这些几何图形是适合血液流变学实验15。
最后，我们的实验是不打算来衡量，孤立的，不同的细胞生物物理特性，导致微血管闭塞。这些类型的实验，如原子力显微镜，微吸管，和光学诱捕技术已经很好的特点。相反，我们的微价值是其概括的能力，同时在体外系统中的单一，生理过程和生物物理特性的合奏，包括粘附分子表达异常的血细胞-内皮细胞相互作用，血细胞聚集（如血栓），细胞变形，细胞大小/形状，几何微血管，血流动力学，所有这些都有助于微血管病变细胞相互作用在不同的疾病状态。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢T.亨特，M.罗森布鲁斯，和他们的意见和有益的讨论林实验室。我们承认从G.微调，在佐治亚理工学院电子和纳米技术研究所的支持。由NIH资助的系列K08-HL093360 REAC奖，加州大学旧金山分校，美国国立卫生研究院奈米发展中心奖PN2EY018244，从亚特兰大儿童保健内皮细胞生物学中心的资金，为这项工作提供了资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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