Summary
שיטת לתרבות monolayer תא האנדותל לאורך כל פני השטח הפנימי של המכשיר 3D microfluidic עם כלי הדם בגודל הערוצים (<30 מיקרומטר) מתואר. זה
Abstract
ההתקדמות טכניקות microfabrication אפשרו את הייצור של מערכות microfluidic זולים לשעתקו לעריכת ניסויים ביולוגיים ביוכימיים ב 1,2 מיקרו nanoscales. בנוסף, מיקרופלואידיקה יש גם שימש במיוחד כדי לנתח באופן כמותי תהליכים המטולוגיות ואת כלי הדם, בגלל היכולת שלהם לשלוט בקלות על הסביבה fluidic דינמית תנאים ביולוגיים 3-6. לפיכך, החוקרים השתמשו ולאחרונה מערכות microfluidic ללמוד deformability תא דם, תא צבירה הדם, זרימת הדם כלי הדם, ודם תא האנדותל אינטראקציות סלולריים 6-13. עם זאת, מערכות אלו microfluidic גם לא כלל לתאי אנדותל בתרבית או היו גדולים יותר רלוונטי sizescale תהליכים פתולוגיים כלי הדם. פלטפורמת microfluidic עם לתאי אנדותל בתרבית במדויק משחזר את הסלולרי, פיזית, hemodynבסביבה של amic microcirculation נדרש כדי לקדם את ההבנה שלנו של פתופיזיולוגיה biophysical הבסיסית של מחלות המטולוגיות הקשורות microvasculature.
כאן אנו מדווחים על שיטה ליצור "endothelialized" במודל חוץ גופית של microvasculature, תוך שימוש פשוט, תהליך אחד microfabrication המסכה יחד עם טכניקות סטנדרטיות אנדותל התרבות תאים, ללמוד פתולוגיים אינטראקציות כלי הדם Biophysical המתרחשים במחלות המטולוגיות. זה "microvasculature על שבב" מספק חוקר assay חזקים כי שולט היטב ביולוגית, כמו גם התנאים Biophysical ומתופעל באמצעות משאבת מזרק סטנדרטי brightfield / מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרמטרים כגון המודינמים תנאי microcirculatory, סוג תא האנדותל, תא דם מסוג (ים) וריכוז (ים), תרופות מעכבות / ריכוז וכו ', יכולים להיות לשלוט בקלות. ככזה, microsystem שלנו מספקשיטה כמותית לחקור תהליכי מחלה שבה זרימת כלי הדם נפגעת בשל שינויים הידבקות התא, צבירה, לבין deformability, יכולת זמינה עם מבחני הקיימים.
Protocol
1. ייצור של Microdevice האנדותל
- צור photomask ידי הגשת עיצוב בסיוע מחשב (CAD) ציור של המכשיר microfluidic לספק המסכה בחוץ. מסכת שימוש הורכבה שכבת כרום על כוס לימון סודה. במקרה זה רוחב הערוץ microfluidic היה 30 מיקרומטר.
- ניקוי פרוסות סיליקון חשוף עם Piranha (10:01 היחס בין חומצה גופרתית מי חמצן) במשך 15 דקות, טובלים בחומצה הידרופלואורית למשך 30 שניות. לשטוף עם מים (DI) deionized במשך כ 10 שניות.
- באמצעות coater ספין, ספין Microchem SU-8 2025 photoresist על גבי פרוסות לגובה של 30 מיקרומטר. עבור SU-8 2025, מהירות סיבוב של 3000 סל"ד מומלץ. Viscosities אחרים של SU-8 זמינים אשר להשיג גובה. הוראות מפורטות לשימוש SU-8 זמינים www.microchem.com
- מניחים את פרוסות עם SU-8 על פלטה חשמלית ב 95 מעלות5 דקות נסיעה משם ממס עודף.
הערה: התנור ייבש רקיק שונה מאשר פלטה חשמלית ולא מומלץ. - מניחים מסכה עם הצורה התכונה הרצויה על פרוסות סיליקון, ולחשוף לאור UV (160 mJ / 2 ס"מ נמדד ב 365 ננומטר) aligner המסכה (קרל זיס, MA-6). צלב זה מקשר photoresist.
- מניחים את פרוסות לאחור על פלטה חשמלית על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות כדי להמשיך להאיץ את פילמור של SU-8.
- לטבול את פרוסות סיליקון של 8-SU מפתח, המורכבת בעיקר למשך 4 דקות של PGMEA (פרופילן גליקול האתר מתיל אצטט) כדי להסיר את אי - צולבים SU-8.
- שוטפים את פרוסות פיתח עם אלכוהול איזופרופיל 100% (IPA) במשך 10 שניות. רקיק יכול מכן יש לייבש בעזרת חנקן דחוס או על ידי מתן ממס להתאדות מן רקיק במנדף נקי במשך כמה דקות.
- קלטת את הקצוות של רקיק יבש עם בדוגמת SU-8 לתוך צלחת פטרי מראשלפרוק התנועה.
- החל 1 מ"ל של Sigmacote על פרוסות סיליקון בעזרת פיפטה, מכסים עם החלק העליון של צלחת פטרי, ו רקיק מערבולת כדי להבטיח ציפוי מלא של פרוסות סיליקון, להסיר מכסה, ולאפשר רקיק לייבוש למשך מספר דקות עד אשר ממיס את כל מתאדה.
2. PDMS (polydimethylsiloxane) הכנה
- מערבבים PDMS פולימר סוכן ריפוי ביחס 10:01 (w / w) ולהסיר בועות אוויר באמצעות תא ייבוש ואקום. משך הזמן הדרוש כדי דגה PDMS משתנה על סמך מערכת ואקום זמין, אך בדרך כלל נע בין כמה דקות לשעה אחת. במשך 6 אינץ צלחת פטרי ללא PDMS שפכו קודם לכן, בהיקף כולל של 60 מ"ל של הפולימר מומלץ.
- יוצקים את התערובת על גבי פרוסות סיליקון, כ 5 מ"מ עובי. גם לשפוך לצלחת קרקעית שטוחה כדי ליצור שכבה דקה של PDMS, כ 1 מ"מ עובי. קיור ב 60 ° C בתנור למשך הלילה.
- בעזרת סכין או אזמל, בנוי סביב גured מכשיר PDMS ולהסירו פרוסות סיליקון. בנוסף, חותכים שכבה דקה של PDMS מעט גדול יותר למכשיר.
- צור כניסת ו לשקע חורים המכשיר PDMS באמצעות אגרוף חור 1.0 מ"מ. ניתן לעשות שימוש גם סגן PIN, המכשיר האריס Uni-Core, או דומה.
- נקו את המשטחים של המכשיר ואת גיליון באמצעות נייר דבק.
- באמצעות שואב פלזמה, לחשוף את פני השטח של המכשיר PDMS והסדין PDMS כדי פלזמה חמצן במשך 30 שניות. פלזמה חמצן יוצר מינים תגובתי על פני השטח החשוף של PDMS אשר בונד כשבאה במגע פיזי.
- חיבור צינור קטן יותר לאורך קטנה (כמה סנטימטרים) של צינורות גדול, אשר בתורו מחובר מזרק עם מחט בוטה נקודות, מלא fibronectin מיקרוגרם / מ"ל 50 מפלסמה אנושית PBS. צינור ומחט הם בגודל כזה מתאים החיכוך שנוצר בין צינורות. הכנס צינור קטן מפרצון של PDMS microdevice וpply לחץ המזרק כדי למלא את ערוצי לחלוטין עם הפתרון fibronectin וליצור טיפה קטנה 100 μL בנמל המוצא, על מנת להבטיח כי הערוצים להישאר רטוב. דגירה את המכשיר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40-60 דקות.
- חבר מזרק חדש מלא PBS לעקוץ את נקודת בוטה. תפעילו לחץ על המזרק כדי לשטוף את המכשיר עם PBS.
3. זריעת המכשיר microfluidic עם לתאי אנדותל
- הכן 1,000,000 תאים למ"ל של תאים אנושיים וריד הטבור אנדותל (HUVECs) בתקשורת הצמיחה אנדותל dextran עם 8%. מגוון של 500,000 עד 2,000,000 תאים למ"ל שימש בהצלחה. תוספת של dextran עד בינוני טוען התא מגביר את הצמיגות של הנוזל, אשר מקטין את מהירות לתאי אנדותל עם כניסתם למערכת fibronectin מצופה microfluidic. זה, בתורו, מעלה את הסבירות כי התאים תדבק ותרבות בהצלחה בתוך microdevice.
- גonnect את המזרק צינורות חדשים כמו בשלב 2.7. אבל עם צינור ארוך יותר (כ -1 מטר אורך).
- כדי למטב את הביצועים של מערכת זו, חשוב בשלב זה למנוע דליפות או בועות במערכת זלוף כולו, כל דליפה של פתרון או נוכחות של בועות בתקשורת ישנה זרימה ולמנוע זריעת מוצלח של בתאי האנדותל. לכן, צמוד של צינורות הוא חיוני כדי למנוע זליגה בין קשרים כלשהם. בועות במזרק ו / או צינורות צריך לנטרל לפני תאים הציג microdevice ומערכת זלוף כולו צריך להיות דרוך עם פתרון התא לפני חיבור צינור microfluidic כדי למנוע את כניסתה של בועות אוויר.
- באמצעות משאבת מזרק, להחדיר ההשעיה התא למכשיר PDMS בקצב זרימה נפחית של μl 1.23 / דקה במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תוצאות מיטביות הושגו כאשר משאבת מזרק היה הגובה בו המכשיר PDMS. עבור כניסה, צינורות ארוכים יותר, אשר יכול להיות מפותל בתוך אינקובטור, מבטיחה כי התאים ומדיה מתחממים כראוי לפני לבוא במגע עם המכשיר. במערכת שלנו, קצב זרימה נפחית של μl 1.23 / דקה בקירוב מהירות הזרם של מ"מ 1 ~ / s ב microchannels הקטנים ביותר, המתאימים ללחץ הקיר גזירה של ~ 1 דיין / 2 ס"מ באותם ערוצים באמצעות דם מלא.
- באמצעות משאבת מזרק אותו צינור ארוך, perfuse התקשורת צמיחה חדשים עבור 2-8 ימים ביחס של μl 1.23 / דקה. מכשיר מוצלח יהיה monolayer של בתאי האנדותל גידול בצד הפנימי של המכשיר תוך 24-48 שעות. ניסויים קודמים הראו כי monolayers confluent כראוי להביע VE-cadherin על תאים תאים צמתים ברחבי המכשיר 14.
- להזרים דם או ההשעיה התא אל תוך מערכת ניסויים.
4. נציג תוצאות
_content "> שימוש בפרוטוקול זה, תקן טכניקות microfabrication ליתוגרפיות משמשות כדי ליצור את התבנית הדרוש כדי להפיק את הערוצים microfluidic כי מבחינה פיזיולוגית לחקות sizescale של microvasculature (איור 1 א). שימוש בטכניקה זלוף אופטימיזציה, לתאי אנדותל ואז הזרע confluently תרבות השטח הפנימי של כל מערכת microfluidic תוך 24-48 שעות של זריעת תאים (1B איור). כמו מערכת microfluidic הוא שקוף, microdevice כולו ניתן להציב על brightfield / הבמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי הדמיה ואיסוף נתונים.המערכת שלנו אז יכול להיות מיושם במחלות המטולוגיות ללמוד הכרוכות שינו תכונות Biophysical, כגון מחלת אנמיה חרמשית, בהם קשיחות מוגברת של תאים אדומים sickled ואדהזיה ליקוציט ו האנדותל סוטה לתרום חסימת כלי הדם. התרופה מאושרת מבחינה קלינית, hydroxyurea, מקילה את תסמיני אלא ד שלהirect השפעה על זרימת כלי הדם אינו ידוע. Assay שלנו לוקח בחשבון גם קשיחות תא הידבקות, שהראה כי hydroxyurea מקילה באופן משמעותי את זרימת מחלת אנמיה חרמשית (איור 2).
מחלת אנמיה חרמשית היא רק דוגמה אחת בקשה microvasculature על שבב, כמו מערכת זו הוא אידיאלי ללמוד כל תהליך המטולוגית שבה כדוריות הדם לתקשר אחד עם תאים אחרים אנדותל ב microvasculature. יישומים רלוונטיות קלינית אחרות כוללות מחלות דלקתיות, אלח דם / ריאות, פגיעה microangiopathies טרומבוטיים, מלריה, גרורות סרטן בעוד יישומים בסיסיים נוספים כוללים ביולוגיה ליקוציט וביולוגיה hematopoietic בתאי גזע, בין רבים אחרים.
איור 1.) את המכשיר הראשון PDMS microfluidic לפני endothelialization. כאן, microdevice מוזרק שנינותH צבעי המאכל כדי להמחיש עיצוב sizescale הכוללת של המערכת. ב) מיקרוסקופיה brightfield מציגה את מערכת microfluidic הוא endothelialized לחלוטין בתוך 48 שעות זריעת תאים באמצעות פרוטוקול המתואר כאן.
איור 2.) Microvasculature על שבב עם microchannels אומדן של גודל שלאחר נימי venules (30 מיקרומטר), אתר של רוב האירועים מגל סלולריים כלי הדם חסימתית. הדם כולו בחולי אנמיה חרמשית שקיבלו hydroxyurea ו מחולים שלא קיבלו hydroxyurea הוא זרם דרך שני microvasculature-on-a-chip מכשירים שונים. ב) הדם כולו בחולי אנמיה חרמשית שקיבלו hydroxyurea זורם בקלות יחסית בתוך microchannels endothelialized. ג) בתנאים המודינמים אותם, כולו דם בחולי אנמיה חרמשית לא מקבלים hydroxyurea, לעומת זאת, מציגה תזרים הרבה יותר איטית עם microchannel החסימה. ערוץ התחתונה חסום לחלוטין עם הזרם ולא ואת מהירויות הזרימה את microchannels endothelialized אחרים נמוכים משמעותית מאשר במצב hydroxyurea. בר בקנה מידה בכל שלושת התמונות הוא 30 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת microdevice endothelialized שלנו הוא המתאים ביותר בעת שימוש בשילוב עם בניסויים vivo, ואת הגישה הרדוקציוניסטית שלה עשוי לעזור להבהיר את המנגנונים Biophysical של תהליכים המטולוגיות כי הם נצפו בבני אדם ומודלים של בעלי חיים. יתר על כן, המערכת שלנו אינה ללא מגבלות. למשל, ערוצי microfluidic שלנו מרובע בחתך. למרות microchannels עגולים מבחינה טכנית יכול להיות מפוברק 10,11, אנו שבחר להשתמש בהליך ייצור פשוטה יותר סטנדרטית כדי לאפשר לחוקרים אחרים כדי קושי ליישם את שיטת העבודה שלהם. בנוסף, נוכחות לתאי אנדותל בתרבית באופן טבעי "סיבובים" לומן יעיל, המאפשר למערכת להיות פיזיולוגי יותר. יתר על כן, מודלים דינמיים הנוזלים שלנו עולה כי תנאי הזרימה במערכת שלנו דומים לזה של in vivo microvasculature. לבסוף, העבודה האחרונה המאפיינת את זרימת הדם בכיכרד microchannels מלבניים הראו כי הגיאומטריות האלה מתאימים rheology ניסויים דם 15.
לבסוף, assay שלנו לא נועד למדוד, בבידוד, מאפיינים ברורים Biophysical הסלולר המובילות חסימת כלי הדם. טכניקות כגון מיקרוסקופ כוח אטומי, השאיפה micropipette, ועל השמנה אופטי אופיינו גם לאותם סוגים של ניסויים. במקום זאת, את הערך של microsystem שלנו הוא ביכולתה לשחזר, בעת ובעונה אחת בתוך אחת במערכת חוץ גופית, אנסמבל של תהליכים פיזיולוגיים ומאפיינים Biophysical, כולל הביטוי הידבקות מולקולה, סוטה תא האנדותל בדם אינטראקציות התא, התא הצטברות הדם (כגון פקקת ), deformability התא, גודל התא / צורה, גיאומטריה כלי הדם, ופרמטרים המודינמיים, כל אלה תורמים פתולוגיים אינטראקציות כלי הדם הסלולר במדינות מחלות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים ט האנט, מ 'רוזנבליט, ואת מעבדת לאם על עצתם דיונים מועילים. אנו מכירים את התמיכה של ג 'ספינר המכון אלקטרוניקה ננוטכנולוגיה במכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה. תמיכה כספית עבור עבודה זו ניתן על ידי מענק NIH-K08 HL093360, הפרס REAC קליפורניה בסן פרנסיסקו, פיתוח Nanomedicine NIH מרכז פרס PN2EY018244, ומימון מהמרכז לביולוגיה תא האנדותל של בריאות לילדים של אטלנטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
