Summary
पूरे में microvascular आकार चैनल (<30 माइक्रोन) के साथ एक microfluidic डिवाइस के भीतर 3D सतह भर में एक endothelial सेल monolayer संस्कृति विधि वर्णित है. यह
Abstract
तकनीक microfabrication अग्रिम में 1,2 और सूक्ष्म nanoscales में जैविक और जैव रासायनिक प्रयोगों का आयोजन करने के लिए सस्ती और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सिस्टम microfluidic के उत्पादन में सक्षम है. इसके अलावा, Microfluidics को भी विशेष रूप से किया गया है करने के लिए मात्रात्मक hematologic और microvascular प्रक्रियाओं का विश्लेषण उनके लिए आसानी से गतिशील fluidic पर्यावरण और जैविक 3-6 शर्तों को नियंत्रित करने की क्षमता की वजह से, इस्तेमाल किया. जैसे, शोधकर्ताओं और अधिक हाल ही में microfluidic प्रणालियों का इस्तेमाल किया है रक्त कोशिका विरूपता, रक्त कोशिका एकत्रीकरण, microvascular रक्त प्रवाह, और रक्त सेल endothelial सेल बातचीत 6-13 का अध्ययन हालांकि, इन microfluidic सिस्टम या तो सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं को शामिल नहीं किया है या बड़े थे. sizescale प्रासंगिक microvascular वैकृत प्रक्रिया की तुलना में. सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं के साथ एक microfluidic मंच कि सही का स्मरण दिलाता है सेलुलर, शारीरिक, और hemodynmicrocirculation के अमोनियाई वातावरण hematologic रोगों कि microvasculature शामिल की अंतर्निहित biophysical pathophysiology के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने की जरूरत है.
यहाँ, हम एक विधि इन विट्रो मॉडल में microvasculature के एक "endothelialized" बनाने के लिए, मानक endothelial सेल संस्कृति तकनीक, वैकृत biophysical microvascular बातचीत कि hematologic रोग में होने का अध्ययन करने के साथ संयोजन के रूप में एक सरल, एकल मुखौटा microfabrication प्रक्रिया का उपयोग कर रिपोर्ट. यह एक मजबूत परख कि कस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैविक के biophysical स्थितियों पर नियंत्रण और एक मानक सिरिंज पंप और brightfield / प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संचालित के साथ शोधकर्ता "microvasculature पर-a-चिप" प्रदान करता है. Microcirculatory hemodynamic शर्तों, endothelial सेल प्रकार, रक्त कोशिका प्रकार (ओं) और एकाग्रता (एस), दवा / निरोधात्मक एकाग्रता आदि, जैसे पैरामीटर सब आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है. जैसे, हमारे माइक्रोसिस्टम प्रदान करता हैमात्रात्मक रोग प्रक्रियाओं जो में microvascular प्रवाह के कोशिका आसंजन, एकत्रीकरण, और विरूपता, एक मौजूदा assays के साथ अनुपलब्ध क्षमता में परिवर्तन के कारण बिगड़ा हुआ है की जांच के लिए विधि.
Protocol
1. Endothelial microdevice का निर्माण
- के बाहर एक मुखौटा विक्रेता के लिए एक कंप्यूटर microfluidic डिवाइस की सहायता ड्राइंग डिजाइन (सीएडी) जमा करके photomask बनाएँ. सोडा नींबू गिलास पर एक क्रोम परत का इस्तेमाल किया मुखौटा बना था. इस मामले में microfluidic चैनल चौड़ाई 30 माइक्रोन था.
- 15 मिनट के लिए साफ पिरान्हा के साथ एक नंगे सिलिकॉन वफ़र (सल्फ्यूरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 10:01 अनुपात) और 30 सेकंड के लिए Hydrofluoric एसिड में डुबकी. विआयनीकृत जल (डी) के साथ लगभग 10 सेकंड के लिए कुल्ला.
- एक स्पिन coater का प्रयोग, स्पिन Microchem SU - 8 +२,०२५ वफ़र पर 30 माइक्रोन की ऊंचाई photoresist. SU - 8 2025 के लिए 3000 rpm के एक स्पिन गति की सिफारिश की है. SU - 8 के अन्य विस्कोसिटी उपलब्ध हैं जो इस ऊंचाई को प्राप्त होगा. SU-8 उपयोग के लिए पूर्ण निर्देश पर उपलब्ध हैं www.microchem.com
- SU - 8 के साथ के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर वफ़र प्लेस5 मिनट से अधिक विलायक ड्राइव करने के लिए.
नोट: एक ओवन वफ़र एक hotplate से अलग होगा और सूखे की सिफारिश नहीं है. - वफ़र अधिक वांछित सुविधा आकार के साथ एक मुखौटा प्लेस, और यूवी प्रकाश (160 2 / MJ सेमी को बेनकाब 365 एनएम पर एक मुखौटा aligner (कार्ल Süss, MA-6) में) मापा. इस पार photoresist के लिंक.
- वफ़र वापस एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए आगे SU - 8 के polymerization में तेजी लाने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर रखें.
- SU-8 डेवलपर में वफ़र, मुख्य रूप से PGMEA (propylene glycol मिथाइल ईथर एसीटेट) के 4 मिनट के लिए गैर पार से जुड़े र-8 हटाने के लिए बना विसर्जित कर दिया.
- 100% isopropyl शराब (आईपीए) के साथ 10 के लिए नव विकसित वफ़र कुल्ला. वफ़र तो दबाव नाइट्रोजन का उपयोग कर सूखे विलायक साफ धूआं हुड में वफ़र से कई मिनट के लिए लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देकर या.
- एक पेट्री डिश में SU - 8 नमूनों के साथ सूखी वफ़र के किनारों के पूर्व करने के लिए टेपआंदोलन वेंट.
- एक विंदुक का उपयोग वफ़र Sigmacote के 1 एमएल लागू करें, पेट्री डिश के ऊपर, और ज़ुल्फ़ वफ़र के साथ कवर करने के लिए वफ़र का पूरा कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए, कवर निकालने के लिए, और वफ़र कई मिनट के लिए सूखी करने के लिए जब तक सभी विलायक हवा हो गया है की अनुमति है.
2. PDMS तैयार (polydimethylsiloxane)
- मिक्स PDMS बहुलक और इलाज एजेंट और एक 10:1 अनुपात (w / w) में हवा बुलबुले एक निर्वात desiccator का उपयोग हटा दें. degas PDMS के लिए आवश्यक समय की लंबाई उपलब्ध निर्वात प्रणाली के बल पर बदलता रहता है, लेकिन आम तौर पर कई मिनट से एक घंटे के लिए जाते हैं. के लिए कोई पहले से डाला PDMS, बहुलक के 60 एमएल की कुल मात्रा के साथ एक छह इंच पेट्री डिश की सिफारिश की है.
- वफ़र पर मिश्रण डालो, लगभग 5 मिमी मोटी. इसके अलावा एक फ्लैट नीचे पकवान पर डाल PDMS की एक पतली शीट बनाने, लगभग 1 मिमी मोटी है. 60 ° एक ओवन में रातोंरात सी में इलाज.
- एक चाकू या स्केलपेल का उपयोग, ग के आसपास बाहर कटौतीPDMS युक्ति ured और वफ़र से निकालें. इसके अतिरिक्त, PDMS की एक पतली शीट में कटौती डिवाइस से थोड़ा बड़ा.
- PDMS डिवाइस में एक 1.0 मिमी छेद पंच का उपयोग Inlet और आउटलेट छेद बनाएँ. यह या तो एक पिन उपाध्यक्ष, विश्वविद्यालय कोर हैरिस, या इसी तरह की डिवाइस का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है.
- डिवाइस की सतहों और स्कॉच टेप का उपयोग कर चादर साफ.
- एक प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करने, PDMS डिवाइस और PDMS ऑक्सीजन प्लाज्मा पत्रक 30 के लिए सतहों बेनकाब. ऑक्सीजन प्लाज्मा PDMS बंधन है जो जब शारीरिक संपर्क में लाया उजागर सतह पर प्रतिक्रियाशील प्रजातियों बनाता है.
- बड़े टयूबिंग की एक छोटी सी (कई सेंटीमीटर) लंबाई, जो बारी में एक सुई कुंद बिंदु के साथ एक सिरिंज के लिए जुड़ा हुआ है 50 / μg मिलीलीटर से पीबीएस में मानव प्लाज्मा से fibronectin से भरा छोटे टयूबिंग कनेक्ट. टयूबिंग और सुई ऐसी है कि एक घर्षण फिट के टयूबिंग के बीच बनाया जाता है आकार के होते हैं. PDMS microdevice के प्रवेश में छोटे टयूबिंग और सम्मिलित करनाA लागू सिरिंज दबाव चैनल को भरने के लिए पूरी तरह से और fibronectin समाधान के साथ एक छोटे से 100 आउटलेट बंदरगाह पर μL ड्रॉप बनाने के लिए, करने के लिए सुनिश्चित करें कि चैनल गीला रहना. 37 ° C पर 40-60 मिनट के लिए युक्ति सेते हैं.
- एक ताजा पीबीएस के कुंद बिंदु सुई के साथ से भरा सिरिंज कनेक्ट. सिरिंज पीबीएस के साथ युक्ति कुल्ला करने के लिए दबाव लागू करें.
3. Endothelial कोशिकाओं के साथ microfluidic युक्ति बोने
- Endothelial वृद्धि मीडिया में 8% dextran के साथ मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) के 1,000,000 कोशिकाओं / एमएल तैयार. 500000 करने के लिए 2,000,000 कोशिकाओं / एमएल के एक रेंज में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. Dextran की सेल लोड हो रहा है मध्यम के लिए इसके अलावा तरल पदार्थ है, जो endothelial कोशिकाओं के वेग कम हो जाती है के रूप में वे fibronectin लेपित microfluidic प्रणाली में प्रवेश का चिपचिपापन बढ़ जाती है. यह, बारी में, संभावना है कि कोशिकाओं का पालन करना और संस्कृति microdevice भीतर होगा सफलतापूर्वक बढ़ जाती है.
- सीनई सिरिंज 2.7 चरण में के रूप में टयूबिंग onnect. लेकिन अब एक टयूबिंग के साथ (लंबाई में लगभग 1 मीटर).
- इस प्रणाली के प्रदर्शन का अनुकूलन करने के लिए, यह इस बिंदु पर महत्वपूर्ण है पूरे छिड़काव प्रणाली में किसी भी लीक या बुलबुले को रोकने, समाधान या मीडिया में बुलबुले की उपस्थिति का कोई रिसाव प्रवाह बदलने के लिए और endothelial कोशिकाओं की सफल बोने को रोकने जाएगा. इसलिए, टयूबिंग की टाइट फिटिंग किसी भी कनेक्शन के बीच रिसाव को खत्म करने के लिए आवश्यक है. सिरिंज और / या टयूबिंग में बुलबुले से पहले कोशिकाओं microdevice में पेश कर रहे हैं और पूरे छिड़काव प्रणाली की microfluidic के लिए टयूबिंग संलग्न हवाई बुलबुले की शुरूआत से बचने के पहले सेल के समाधान के साथ से primed किया जाना चाहिए समाप्त किया जाना चाहिए.
- एक सिरिंज पंप का प्रयोग, PDMS युक्ति में 37 में 1.23 μl / मिनट का बड़ा प्रवाह दर पर सेल निलंबन को बढ़ावा 2 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. इष्टतम परिणाम जब सिरिंज पंप पर था प्राप्त किया गया PDMS युक्ति के रूप में एक ही ऊंचाई. प्रवेश के लिए, अब टयूबिंग, जो इनक्यूबेटर भीतर coiled किया जा सकता है सुनिश्चित करता है कि पर्याप्त रूप से कोशिकाओं और मीडिया डिवाइस के साथ संपर्क में आने से पहले गर्म कर रहे हैं. हमारी प्रणाली में, बड़ा प्रवाह की दर 1.23 μl / मिनट के छोटी microchannels, ~ पूरे रक्त का उपयोग कर उन चैनलों पर 1 डाएन / 2 सेमी. की एक दीवार कतरनी तनाव करने के लिए इसी ~ 1 मिमी / एस के एक मझधार वेग के करीब
- Μl 1.23 / मिनट के अनुपात में 2-8 दिनों के लिए एक ही सिरिंज पंप और लंबे समय टयूबिंग, छिड़कना ताजा वृद्धि मीडिया का उपयोग करना. एक सफल युक्ति endothelial कोशिकाओं की डिवाइस के अंदर पर 24-48 घंटे के भीतर बढ़ रहा है की एक monolayer होगा. पिछले प्रयोगों से पता चला है कि सहधारा monolayers उचित सेल सेल जंक्शनों पर युक्ति भर में 14 VE-cadherin व्यक्त.
- इस प्रणाली में प्रयोग के लिए रक्त या सेल निलंबन इंजेक्षन.
4. प्रतिनिधि परिणाम
"_content> इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, मानक lithographic तकनीक microfabrication microfluidic चैनलों है physiologically (चित्र 1 ए) microvasculature sizescale नकल उत्पादन के लिए जरूरत ढालना बनाने में उपयोग किया जाता है एक अनुकूलित छिड़काव तकनीक का प्रयोग, endothelial कोशिकाओं तो बीज और confluently संस्कृति सेल बोने के 24-48 घंटे के भीतर microfluidic प्रणाली (चित्रा 1 बी) के पूरे अंदरूनी सतह. microfluidic प्रणाली पारदर्शी है, पूरे microdevice / इमेजिंग और डेटा संग्रह के लिए प्रतिदीप्ति खुर्दबीन मंच brightfield पर रखा जा सकता है.फिर हमारा सिस्टम hematologic रोगों है कि सिकल सेल रोग के रूप में biophysical गुण, जिसमें sickled लाल कोशिकाओं और न्यायपालिका ल्युकोसैट और endothelial आसंजन की वृद्धि की कठोरता microvascular रुकावट के लिए योगदान को बदल शामिल अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. एक चिकित्सकीय अनुमोदित दवा, hydroxyurea के, लक्षण, लेकिन अपनी घ amelioratesmicrovascular प्रवाह पर प्रभाव irect अज्ञात है. हमारे परख दोनों सेल कठोरता और आसंजन के खाते में लेता है, और यह दर्शाता है कि hydroxyurea के काफी सिकल सेल रोग (चित्रा 2) में प्रवाह ameliorates.
दरांती सेल रोग microvasculature पर एक चिप के लिए एक आवेदन के केवल एक उदाहरण है, के रूप में इस प्रणाली के आदर्श के लिए किसी भी hematologic प्रक्रिया है जिसमें रक्त कोशिकाओं microvasculature में एक दूसरे को और endothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक अनुप्रयोगों भड़काऊ रोग, पूति / फेफड़ों की चोट, thrombotic microangiopathies को, मलेरिया और कैंसर मेटास्टेसिस में शामिल हैं, जबकि अधिक बुनियादी अनुप्रयोगों ल्युकोसैट जीव विज्ञान और hematopoietic स्टेम कोशिका जीव विज्ञान, कई अन्य लोगों के अलावा शामिल हैं.
चित्रा 1) endothelialization से पहले प्रारंभिक PDMS microfluidic युक्ति. यहाँ, microdevice बुद्धि इंजेक्शन हैघंटे खाद्य प्रणाली के की sizescale और समग्र डिजाइन वर्णन रंग. बी) Brightfield माइक्रोस्कोपी से पता चलता है microfluidic प्रणाली पूरी तरह से सेल बोने के 48 घंटे के भीतर endothelialized है यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग.
चित्रा 2.) Microchannels साथ microvasculature पर एक चिप के बाद केश (30 माइक्रोन) venules, सिकल सेल microvascular प्रतिरोधी घटनाओं की साइट का आकार करीब है. सिकल सेल से प्राप्त रोगियों hydroxyurea और प्राप्त hydroxyurea नहीं रोगियों से दो अलग अलग microvasculature पर-a-चिप उपकरणों के माध्यम से पूरे रक्त प्रवाहित है. बी) सिकल सेल रिश्तेदार आसानी से endothelialized microchannels भीतर hydroxyurea के प्रवाह को प्राप्त रोगियों से पूरे रक्त. सी) एक ही hemodynamic शर्तों के तहत, सिकल सेल रोगियों से प्राप्त hydroxyurea नहीं पूरे रक्त, तथापि, microch साथ अधिक सुस्त प्रवाह प्रदर्शनannel बाधा. नीचे चैनल नहीं प्रवाह के साथ पूरी तरह से बाधित है और अन्य endothelialized microchannels में प्रवाह वेग hydroxyurea के हालत की तुलना में काफी कम कर रहे हैं. सभी तीन छवियों में बड़े पैमाने बार 30 माइक्रोन है.
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Discussion
हमारे endothelialized microdevice प्रणाली सबसे अच्छा है जब, vivo प्रयोगों में साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया अनुकूल है, और अपने न्यूनकारी दृष्टिकोण hematologic प्रक्रियाओं है कि मानव और पशु मॉडल में मनाया जाता है biophysical तंत्र को स्पष्ट में मदद मिल सकती है. इसके अलावा, हमारी प्रणाली की सीमाओं के बिना नहीं है. उदाहरण के लिए, हमारे microfluidic चैनल पार अनुभाग में वर्ग हैं. हालांकि तकनीकी परिपत्र microchannels 10,11 गढ़े जा सकता है, हम एक अधिक सरलीकृत और मानक निर्माण प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए अन्य शोधकर्ताओं ने आसानी से अपने काम करने के लिए इस प्रणाली को लागू करने की अनुमति के लिए चुना. इसके अलावा, बाहर दौर प्रभावी लुमेन "" स्वाभाविक रूप से सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं की उपस्थिति प्रणाली को और अधिक शारीरिक होने के लिए सक्षम करने से. इसके अलावा, हमारे द्रव गतिशील मॉडलिंग से पता चलता है कि हमारी प्रणाली में प्रवाह की स्थिति में vivo में microvasculature में तुलना कर रहे हैं. अंत में, हाल ही में काम वर्ग में रक्त के प्रवाह को निस्र्पकघ आयताकार microchannels दिखाया गया है कि उन के geometries रक्त rheology 15 प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं.
अंत में, हमारे परख करने के लिए अलगाव में मापने के लिए,, अलग सेलुलर biophysical गुण है कि microvascular रोड़ा करने के लिए नेतृत्व करने के लिए इरादा नहीं है. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी, micropipette आकांक्षा, और ऑप्टिकल फँसाने के रूप में तकनीक को अच्छी तरह से किया गया है प्रयोगों के उन प्रकार के लिए विशेषता है. इसके बजाय, हमारे माइक्रोसिस्टम का मूल्य इसकी क्षमता पुनरावृत्ति करना है, एक साथ और इन विट्रो प्रणाली में एक एकल, शारीरिक प्रक्रियाओं और आसंजन अणु अभिव्यक्ति, न्यायपालिका रक्त कोशिका endothelial सेल बातचीत, रक्त कोशिका एकत्रीकरण (जैसे घनास्त्रता सहित biophysical गुण, एक कलाकारों की टुकड़ी के भीतर ), सेल विरूपता, सेल आकार / आकार, microvascular ज्यामिति, और hemodynamics, जो सभी के विभिन्न रोग राज्यों में वैकृत microvascular सेलुलर बातचीत के लिए योगदान.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम टी. हंट, एम. Rosenbluth, और उनकी सलाह और उपयोगी विचार - विमर्श के लिए लैम लैब धन्यवाद. हम जी स्पिनर और इलेक्ट्रॉनिक्स और जॉर्जिया प्रौद्योगिकी संस्थान में नैनो के लिए संस्थान से समर्थन स्वीकार करते हैं. एक NIH K08 - HL093360 अनुदान, UCSF reac पुरस्कार, एक NIH Nanomedicine विकास और केंद्र PN2EY018244 पुरस्कार, और बच्चों के अटलांटा के हेल्थकेयर के Endothelial सेल बायोलॉजी के लिए केंद्र से धन के द्वारा इस कार्य के लिए वित्तीय समर्थन प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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