Summary
微小サイズのチャネル（<30μm）を持つマイクロ流体デバイスの全体の内部の三次元表面全体に文化内皮細胞単層をに方法が記載されています。この
Abstract
微細加工技術の進歩により、マイクロ·nanoscales 1,2で生物学的および生化学的な実験を実施するための安価で再現性のあるマイクロ流体システムの生産を有効にしている。さらに、マイクロフルイディクスは、具体的にするため、簡単に動的な流体の環境及び生物学的条件3-6を制御する能力を、定量的に血液と血管のプロセスを分析するために使用されています。このように、研究者は最近では血液細胞の変形能、血液細胞の凝集、微小血管の血流、血液細胞血管内皮細胞の相互作用6-13勉強するマイクロ流体システムを使用しています。しかし、これらのマイクロ流体システムのいずれかの培養内皮細胞を含めたり、大きかったしませんでした微小血管の病理学的プロセスに関連するsizescaleより。培養内皮細胞を用いたマイクロ流体プラットフォームを正確に反復する携帯電話、物理的、およびhemodynその微小循環のアミック環境は微小血管を伴う血液疾患の根本的な生物物理学的病態の理解を促進するために必要です。
ここでは、血液疾患で発生する病理学的生物物理学の微小血管の相互作用を研究するために、標準的な内皮細胞培養技術と組み合わせて、シンプルな単一のマスクの微細加工プロセスを用いて、微小血管の in vitroモデルで "endothelialized"を作成する方法を報告します。この "微小血管·オン·チップ"はしっかりと生物学的ならびに生物物理学的条件を制御し、標準的なシリンジポンプと明視野/蛍光顕微鏡を用いて操作された堅牢なアッセイを用いて研究を提供しています。このような微小循環血行状態、内皮細胞の種類、血液細胞の種類（s）と濃度（S）、薬物/阻害濃度等、などのパラメータはすべて容易に制御することができます。このように、私たちのマイクロシステムを提供します定量的に微小血管の流れが原因で、細胞接着、凝集し、変形能は、既存のアッセイでは使用できない機能に変化が損なわれている病気のプロセスを調査する方法。
Protocol
1。内皮マイクロデバイスの作製
- 外側のマスクベンダにマイクロ流体デバイスのコンピュータ支援設計（CAD）図面を提出することによりフォトマスクを作成します。使用されるマスクは、ソーダライムガラス上にクロム層から構成されていた。このケースでは、微小流体チャネル幅は30μmであった。
- 15分間ピラニア（硫酸と過酸化水素の10:1比）ベアシリコンウェーハを洗浄し、30秒間フッ化水素酸に浸漬。約10秒間脱イオン（DI）水で洗い流してください。
- 30μmの高さにウエハ上にスピンコーターを用いて、スピンマイクロケムSU-8 2025レジスト。 SU-8 2025、3000 rpmの回転速度が推奨されます。 SU-8の他の粘度は、この高さを実現しますどのご利用いただけます。 SU-8を使用するための完全な手順は、ご利用いただけますwww.microchem.com
- 95℃のホットプレート上でSU-8でウェハを置きます過剰な溶媒を駆動するために5分。
注意：オーブンはホットプレートとは異なるウェハを乾燥し、推奨されていません。 - ウエハ上に所望の機能の形状でマスクを配置し、紫外光（160 MJ / cm 2に公開 マスクアライナ（カールカールサス、MA-6））365 nmで測定した。このクロスは、フォトレジストをリンクします。
- さらにSU-8の重合を促進するためにさらに5分間95℃でホットプレート上でバックウェハを置きます。
- 非架橋SU-8を削除するには、4分間PGMEA（プロピレングリコールメチルエーテルアセテート）から主に構成されるSU-8 Developerでウェハを浸します。
- 10秒に100％イソプロピルアルコール（IPA）と新しく開発されたウェーハを洗浄します。ウェハは、次いで溶媒が数分間、クリーンドラフト内でウェハから蒸発させることにより加圧された窒素を使用するか、または乾燥させることができる。
- テープのペトリ皿にパターニングSU-8のドライウェハーのエッジは、事前に運動を発散。
- ウェーハの完全なコーティングを確保するためにピペット、ペトリ皿の上部カバー、およびスワールウエハを用いてウェーハにSigmacote 1 mLを適用し、カバーし、すべての溶媒が蒸発するまでウェハを数分間乾燥させて削除します。
2。 PDMS（ポリジメチルシロキサン）の準備
- 10:1の比（W / W）でPDMSポリマーと硬化剤を混合し、真空デシケーターを用いた気泡を除去します。脱PDMSに必要な時間の長さは、使用可能な真空システムの強さによって異なりますが、通常は数分から1時間の範囲である。なし以前に注ぎPDMSと6インチのペトリ皿には、ポリマーの60 mLの全量をお勧めします。
- 、ウエハ上に厚さ約5mmの混合物を注ぐ。また、厚さ約1mmのPDMSの薄いシートを作成するためにフラットボトム皿に注ぐ。 60一晩オーブンで℃で硬化します。
- ナイフやメスを用いて、Cの周りに切り取るPDMSデバイスをuredとウェハからそれを削除します。さらに、デバイスよりも若干大きくPDMSの薄いシートを切った。
- 1.0ミリメートルの穴パンチを使用してPDMSデバイスの入口と出口の穴を作成します。これは、どちらかのピンの副、ハリスユニコア、または同様の装置を用いて達成することができる。
- デバイスの表面とスコッチテープを使用してシートをクリーニングします。
- プラズマクリーナーを使用して、30秒間酸素プラズマにPDMSデバイスの表面とPDMSシートを公開します。酸素プラズマは、物理的に接触結合PDMSの露出面に反応種を作成します。
- 順番に、PBS中のヒト血漿から50μg/ mlのフィブロネクチンで埋め平滑末端ポイント針と注射器に接続されている大規模なチューブの小さな長さ（数センチ）に小さいチューブを接続します。チューブと針が摩擦フィットがチューブの間に作成されるようにサイズ調整されています。小さなPDMSマイクロデバイスの入口にチューブを挿入pplyシリンジに圧力がフィブロネクチン溶液を完全にチャネルを埋めるために、出口ポートに小型の100μLのドロップを作成するには、チャネルがぬれたままいることを確認する。 40から60分間37℃でデバイスをインキュベートします。
- 鈍ポイント針にPBSを充填した新鮮なシリンジを接続します。 PBSでデバイスをリンスするために注射器に圧力を適用します。
3。内皮細胞とマイクロ流体デバイスを播種
- 8パーセントデキストランと内皮細胞増殖培地中でヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の1,000,000細胞/ mLを準備します。 50万〜2,000,000細胞/ mLの範囲が正常に使用されています。セルローディング培地にデキストランの添加は、フィブロネクチンでコーティングされたマイクロ流体システムを入力すると、内皮細胞の移動速度を減少させ、流体の粘度を増加させます。これは、順番に、細胞がマイクロデバイス内に正常に付着し、文化れる可能性が増加します。
- ℃ステップ2.7のように新しいシリンジとチューブをONNECT。しかし、長いチューブ（長さ約1メートル）である。
- このシステムのパフォーマンスを最適化するために、それは全体の灌流システム内の任意のリークや気泡を防ぐために、この時点で非常に重要です。ソリューションやメディアの中の気泡の有無のいずれかのリーク電流は流れを変更し、内皮細胞の正常な播種を防ぐことができます。したがって、チューブのタイトフィッティングは、任意の接続間の漏れをなくすことが不可欠である。細胞は、マイクロデバイスに導入されており、全体の灌流システムは、気泡の導入を避けるために、流体にチューブを接続する前に細胞溶液でプライミングする必要があります前に、注射器、および/またはチューブ内の気泡を除去する必要があります。
- シリンジポンプを用いて、Cおよび5％CO 2、37℃で2時間1.23μL/ minの体積流量でPDMSデバイスに細胞懸濁液を注入する。シリンジポンプにいたとき、最適な結果を達成しました PDMSデバイスと同じ高さ。入口には、インキュベーター内で巻いすることができます長いチューブは、細胞やメディアが適切にデバイスに接触する前に温めていることを保証します。本システムでは、1.23μL/ minの体積流量は、全血を使用してこれらのチャネルで〜1ダイン/ cm 2の壁面せん断応力に対応する最小のマイクロ、で〜1 mm / sの途中速度を概算します。
- 同じシリンジポンプ、長いチューブを使用して、1.23μL/ minの割合で2から8日間新鮮な増殖培地を灌流。成功したデバイスは、内皮細胞の単層は24-48時間以内のデバイスの内側に成長しているでしょう。以前の実験では、コンフルエントな単層が適切にデバイス14を通して細胞間接合部のVE-カドヘリンを発現していることが示されている。
- 実験のためのシステムへの血液や細胞懸濁液を注入します。
4。代表的な結果
その後_content ">このプロトコルを使用して、標準的なリソグラフィの微細加工技術は生理学的に微小血管（ 図1A）のsizescaleを模倣するマイクロ流体チャネルを生成するために必要な金型を作成するために使用されています。最適化された灌流法を用いて、内皮細胞種とconfluently文化細胞播種の24〜48時間以内マイクロ流体システムの全体の内面（ 図1B）は、マイクロ流体システムは、透明であるため、全体のマイクロデバイスは、イメージングとデータ収集のために明視野/蛍光顕微鏡ステージ上に配置することができます。我々のシステムは、その後sickled赤血球と異常な白血球と血管内皮接着の増加剛性が微小血管の閉塞に寄与するような鎌状赤血球症などの生物物理学的特性を、変更を伴う血液疾患を研究するために適用することができます。臨床的に承認された薬、ヒドロキシウレアは、症状が、そのdを改善する微小血管の流れのirect効果は不明である。我々のアッセイは、アカウントセルの剛性と密着性の両方にかかり、ヒドロキシウレアが大幅に鎌状赤血球症（ 図2）の流れを改善することを示しています。
このシステムは理想的な血液細胞は、微小血管系でお互いと内皮細胞と相互作用する任意の血液学的プロセスを研究するために適しているとして、鎌状赤血球症は、微小血管·オン·チップ用のアプリケーションの一例にすぎません。より基本的なアプリケーションは、白血球生物学と他の多くの間造血幹細胞生物学を含めながら、他の臨床的に関連するアプリケーションでは、炎症性疾患、敗血症/肺傷害、血栓microangiopathies、マラリア、がんの転移が含まれています。
図1。）初期PDMSマイクロ流体デバイスを内皮前。ここでは、マイクロデバイスは、ウィットを注入されH食品は、システムのsizescaleと全体のデザインを説明するために着色。 B）明視野顕微鏡は、マイクロ流体システムが完全にここで説明したプロトコルを使用して、細胞播種の48時間以内にendothelializedであることを示している。
図2）。マイクロと微小血管·オン·チップは、ほとんどの鎌状赤血球血管閉塞イベントのサイト、後毛細血管細静脈（30μm）のサイズを概算します。ヒドロキシウレアを受けて鎌状赤血球症患者から、ヒドロキシを受けていない患者から全血は、2つの異なる微小血管系オンチップデバイスを介して流される。 endothelializedマイクロ内の相対的な容易にヒドロキシウレアの流れを受けて鎌状赤血球症患者からのB）全血。 C）同じ血行動態の条件下では、ヒドロキシウレアを受けていない鎌状赤血球症患者から全血は、しかし、microchとはるかに遅い流れを示すannel閉塞。一番下のチャンネルが完全に流れがないと妨害や他のendothelializedマイクロチャネル内の流速は、ヒドロキシウレアの条件よりも有意に低くなっています。すべての3つの画像中のスケールバーは30μmである。
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Discussion
私たちのendothelializedマイクロデバイス·システムは、in vivoの実験ではと組み合わせて使用するときに最も適していると、その還元のアプローチは、人間と動物モデルで観察された血液学的プロセスの生物物理学的メカニズムの解明に役立つことがあります。さらに、我々のシステムには限界がないわけではない。例えば、我々の流体チャネルは、クロスセクションの正方形です。技術的に円形のマイクロチャンネル10,11を作製することができますが、我々は他の研究者が容易に自分の仕事にこのシステムを適用できるようにより簡素化と標準的な製造手順を使用することにしました。さらに、効果的なルーメン "アウトラウンド"培養内皮細胞当然の存在は、システムは、より生理的であることができるようになります。さらに、我々の流体力学モデリングは、我々のシステムの流れ条件は生体内微小血管系でのそれに匹敵することを明らかにした。最後に、最近の研究では、広場で血流を特徴づけるD長方形のマイクロは、それらのジオメトリは、血液レオロジーの実験15に適していることが示されている。
最後に、我々のアッセイは、単独では、微小血管の閉塞につながる明確な細胞の生物物理学的特性を測定するものではありません。このような原子間力顕微鏡、マイクロピペット吸引、光トラッピングなどの手法はよく実験のそれらのタイプの特徴づけられている。代わりに、私たちのマイクロシステムの値が同時にin vitroの系内の単一の 、接着分子の発現、異常な血液細胞血管内皮細胞の相互作用、血球凝集（例えば、血栓症を含む生理的プロセスと生物物理学的特性のアンサンブル内で、要約する能力です別の病気の状態に病的な血管細胞の相互作用に寄与するすべてが）、細胞変形、細胞の大きさ/形状、微小血管のジオメトリ、血行動態、。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
我々は、T.ハント、M.ローゼンブルース、そして彼らのアドバイスや有用な議論のためのラムラボに感謝します。私たちは、ジョージア工科大学の電子工学とナノテクノロジーのためのG.スピナーと研究所からの支援を認める。この仕事のための財政支援は、NIHの助成金K08-HL093360、UCSF REAC賞、NIHのナノメディシン開発センター賞PN2EY018244、アトランタの子供の医療の内皮細胞生物学のためのセンターからの資金によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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