Summary
Метод культуре эндотелиальных монослоя клетки по всему внутреннему 3D поверхность микрофлюидных устройство с микрососудистой размеров каналов (<30 мкм) описывается. Это
Abstract
Достижения в области микротехнологий методы позволили производство недорогой и воспроизводимый микрожидкостных систем для проведения биологических и биохимических экспериментов на микро-и наномасштабах 1,2. Кроме того, микрофлюидики также были специально использованы для количественного анализа гематологических и микрососудистых процессов, из-за их способности легко управлять динамическим жидкостный окружающей среды и биологических условий 3-6. Таким образом, исследователи в последнее время использовали микрожидкостных систем для изучения клеток крови деформируемость, агрегация клеток крови, микрососудистых кровообращения, крови и клеточных взаимодействий эндотелиальных клеток 6-13. Тем не менее, эти микрожидкостных систем либо не включать в эндотелиальные клетки или были большими чем sizescale отношение к микрососудистых патологических процессов. Микрофлюидных платформы в эндотелиальные клетки, который точно повторяет сотовый, физические и hemodynАМИК среды микроциркуляции необходимо для более глубокого понимания основных биофизических патофизиологии гематологических заболеваний, которые связаны с микрососудов.
Здесь мы сообщаем о методе создания "endothelialized" в пробирке модель микрососудов, с помощью простого, единого процесса микротехнологий маски в сочетании со стандартными эндотелиальных клеток культуры методов для изучения патологических биофизического взаимодействия микрососудистых, которые происходят в гематологических заболеваний. Это "микрососудов-на-чипе» предоставляет исследователю надежный тест, который жестко контролирует биологические, а также биофизических условий и управляется с помощью стандартного насоса шприца и светлого / флуоресцентной микроскопии. Такие параметры, как микроциркуляторного условиях гемодинамики, эндотелиальной типа клеток, клеток крови, тип (ы) и концентрации (ы), наркотиков / ингибирующая концентрация и т.д., могут быть легко контролируется. Таким образом, наша микросистема обеспечиваетМетод количественно исследовать болезнь процессов, в которых микрососудистых потока нарушается в связи с изменениями в клеточной адгезии, агрегации и деформируемости, возможность недоступна с существующими методами.
Protocol
1. Изготовление эндотелиальных микроустройство
- Создание фотошаблонов, представив помощью компьютера проектирования (САПР) чертеж микрофлюидных устройство к внешнему поставщику маску. Маска, используемая состоит из слоя хрома на стекле соды извести. В этом случае микрофлюидных ширина канала составляет 30 мкм.
- Очистите голой кремниевой пластины с пираньями (10:1 серной кислоты и перекиси водорода) в течение 15 минут и окунуться в плавиковой кислоте в течение 30 секунд. Промойте деионизированной (DI) воде в течение примерно 10 секунд.
- Использование спина для нанесения покрытий, спина Microchem SU-8 2025 фоторезиста на пластине на высоте 30 мкм. Для СУ-8 2025 года, скорость вращения 3000 оборотов в минуту рекомендуется. Другие вязкости SU-8 доступны, который достигнет этой высоты. Полные инструкции по SU-8 использования доступны на www.microchem.com
- Поместите пластину с СУ-8 на плите при температуре 95 ° С в течение5 минут, чтобы отогнать излишки растворителя.
Примечание: печь сухой пластины иначе, чем плитке и не рекомендуется. - Поместите маску с нужной функции формы в лепешку, и подвергать ультрафиолетовому излучению (160 мДж / см 2 измеряется при 365 нм) в маске выравниватель (Karl Суссе, МА-6). Этот крест связывает фоторезиста.
- Поместите пластину обратно на плите при температуре 95 ° С в течение еще 5 минут, для дальнейшего ускорения полимеризации SU-8.
- Опустите пластину в СУ-8 для разработчиков, состоит в основном из PGMEA (пропиленгликоль метиловый эфир уксусной кислоты) в течение 4 минут, чтобы удалить, не сшитый SU-8.
- Промойте недавно разработанной пластины со 100% изопропиловый спирт (IPA) в течение 10 с. Пластины могут быть высушены под давлением азота или путем предоставления растворитель испаряется из подложки в чистом вытяжного шкафа в течение нескольких минут.
- Лента края сухие пластины с узором SU-8 в чашку Петри с предварительновыход движения.
- Нанести 1 мл Sigmacote к пластине с помощью пипетки, накрыть верхней части чашки Петри, и вихрь пластины, чтобы обеспечить полное покрытие пластин, снимите крышку и дайте пластине высохнуть в течение нескольких минут, пока весь растворитель испарился.
2. PDMS (Полидиметилсилоксан) подготовка
- Mix PDMS полимера и отвердителя в соотношении 10:1 (в / в) и удалить пузырьки воздуха с помощью вакуумного эксикаторе. Время, необходимое для дегазации PDMS меняется в силу имеющейся вакуумной системы, но обычно составляет от нескольких минут до одного часа. За шесть дюймов чашку Петри с ранее не налил PDMS, общим объемом 60 мл полимеров рекомендуется.
- Вылейте смесь на пластину, около 5 мм. Кроме того, залейте на плоское блюдо нижней создать тонкий слой PDMS, около 1 мм. Лечение при 60 ° С в печи на ночь.
- С помощью ножа или скальпеля, вырезать вокруг сизмерял PDMS устройств и удалить его из пластины. Кроме того, вырезать тонкий слой PDMS немного больше, чем устройства.
- Создать входе и выходе отверстия в устройстве PDMS помощью 1,0 мм дырокол. Это может быть сделано либо с помощью контактных вице-Харриса Uni-Core, или аналогичное устройство.
- Очистить поверхность устройства и листа с помощью скотча.
- Использование плазмы чище, подвергать поверхности устройства PDMS и PDMS лист кислородной плазмы в течение 30 сек. Кислородной плазмы создает реактивный вид на внешней поверхности которого PDMS связь, когда принес в физический контакт.
- Подключите меньший трубы на небольшой длине (несколько сантиметров) больших труб, которые в свою очередь подключен к шприца с тупой иглой точки, наполненный 50 мкг / мл фибронектина из плазмы крови человека в PBS. Трубы и иглы размера, что трения нужным создается между труб. Вставьте меньший трубы на входе и PDMS микроустройствоpply давления на шприц для заполнения каналов полностью с фибронектина решение и создать небольшой 100 мкл каплю на выходной порт, чтобы убедиться, что каналы остаются влажными. Инкубируйте устройство при температуре 37 ° С в течение 40-60 мин.
- Подключить новый шприц с PBS с тупой иглой точки. Надавите на шприц для полоскания устройства с PBS.
3. Посев микрофлюидных устройств с эндотелиальных клеток
- Подготовить 1000000 кл / мл пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) в эндотелиальных СМИ рост с 8% декстран. Диапазон от 500000 до 2000000 кл / мл была успешно использована. Добавление декстрана в среду загрузки клетка увеличивается вязкость жидкости, что снижает скорость эндотелиальных клеток, когда они входят, покрытой фибронектином микрофлюидных системы. Это, в свою очередь, увеличивает вероятность того, что клетки будут придерживаться и культуры успешно в микроустройство.
- Connect новый шприц и трубку, как в шаге 2.7. но с более длинной трубки (около 1 метра в длину).
- Для оптимизации производительности этой системы, очень важно в этот момент, чтобы предотвратить утечку или пузырьков во всей системе перфузии, любая утечка раствора или наличие пузырьков в средствах массовой информации изменится поток и не допустить успешного посева эндотелиальных клеток. Таким образом, обтягивающие из трубы имеет важное значение для устранения утечки между любыми соединениями. Пузыри в шприц и / или трубы должны быть устранены до клетки вводятся в микроустройство и всей системы перфузии следует загрунтовать с клеткой решение перед установкой труб в микрофлюидных, чтобы избежать введения пузырьков воздуха.
- С помощью шприца, настаивать клеточной суспензии в устройстве PDMS при объемном расходе 1,23 мкл / мин в течение 2 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2. Оптимальные результаты достигаются при шприцевой насос был в же высоте, что устройство PDMS. Для входа, тем больше труб, которые могут быть свернутой в инкубаторе, гарантирует, что клетки и средства массовой информации адекватно нагревается до вступления в контакт с устройством. В нашей системе объемного расхода 1,23 мкл / мин приближается к переправе скоростью ~ 1 мм / с в мельчайших микроканалов, соответствующее напряжение трения на стенке ~ 1 дин / см 2 при тех каналов с использованием цельной крови.
- Используя тот же шприц насос и длинный трубопровод, заливать свежей питательной среды в течение 2-8 дней при соотношении 1,23 мкл / мин. Успешное устройство будет иметь монослоя эндотелиальных клеток, растущих на внутренней стороне устройства в течение 24-48 часов. Предыдущие эксперименты показали, что сливной монослоев надлежащим выразить VE-кадгерина в межклеточных развязки по всей территории устройства 14.
- Вводите крови или суспензии клеток в системе для экспериментов.
4. Представитель Результаты
_content "> С помощью этого протокола, стандартных литографических методов микротехнологий используются для создания форм, необходимых для производства микрофлюидных каналов, которые физиологически имитировать sizescale микроциркуляторного русла (рис. 1А). Используя оптимизированный метод перфузии, эндотелиальные клетки, затем семена и confluently культуры всей внутренней поверхности микроканалов системы в течение 24-48 часов клетки посева (рис. 1б). Как микрофлюидных система прозрачна, все микроустройство могут быть размещены на светлое / флуоресценции столик микроскопа для визуализации и сбора данных.Наша система может быть использована для исследования гематологических заболеваний, которые включают изменены биофизических свойств, таких как серповидно-клеточная анемия, в которой увеличена жесткость sickled эритроцитов и лейкоцитов аберрантных и эндотелиальной адгезии способствуют микрососудистой обструкции. Клинически одобренных лекарств, гидроксимочевины, улучшает симптомы, но его гirect влияние на микрососудистых поток неизвестно. Наш анализ учитывает как жесткость клеток и адгезии, и демонстрирует, что значительно улучшает гидроксимочевины потока в серповидно-клеточная анемия (рис. 2).
Серповидноклеточная болезнь является лишь одним примером приложения для микрососудов-на-чипе, так как эта система идеально подходит для изучения любого гематологических процесс, при котором клетки крови взаимодействуют друг с другом и эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла. Другие клинически значимые приложения включают воспалительные заболевания, сепсис / повреждения легких, тромботических микроангиопатий, малярия, рак и метастазы в то время как более основные области применения включают лейкоцитов биологии и биологии гемопоэтических стволовых клеток, и многие другие.
Рисунок 1.) Начальная PDMS микрофлюидных устройство перед эндотелизации. Здесь микроустройство вводится остроумиеч пищевой краситель, чтобы проиллюстрировать sizescale и общий дизайн системы. B) Светлое микроскопия показывает микрофлюидных система полностью endothelialized в течение 48 часов клетки посева с использованием протокола описаны здесь.
Рисунок 2.) Микрососудов-на-чипе с микроканалов приближается к размеру после капиллярной венулы (30 мкм), на месте самой серповидно-клеточная микрососудистых событий громоздкими. Цельная кровь с серпом пациентов клетки получают гидроксимочевины и от пациентов, не получающих гидроксимочевины течет через две различные микрососудов-на-чипе устройства. Б) цельная кровь с серпом пациентов клетки получают гидроксимочевины потоков с относительной легкостью в endothelialized микроканалов. С) при тех же условиях гемодинамики, цельной крови пациентов с серповидно-клетки не получают гидроксимочевины, однако, обладает гораздо более вялый поток с microchAnnel обструкции. В итоге канал полностью не засоренных потока и скоростей потока в другой endothelialized микроканалов значительно ниже, чем в состоянии гидроксимочевины. Линейка во всех трех изображений составляет 30 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша система endothelialized микроустройство лучше всего подходит при использовании в сочетании с экспериментами в естественных условиях, и его редукционистской подход может помочь выяснить биофизических механизмов гематологические процессы, которые наблюдаются у людей и животных. Кроме того, наша система не без ограничений. Например, наши микрофлюидных каналов площади поперечного сечения. Хотя технически круговой микроканалы могут быть изготовлены 10,11, мы решили использовать более простой и стандартной процедуры изготовления, чтобы позволить другим исследователям легко применять эту систему в своей работе. Кроме того, наличие культурных эндотелиальные клетки естественным образом "завершает" эффективный просвет, что позволяет системе быть более физиологическим. Кроме того, наши гидродинамического моделирования показывают, что поток условий в нашей системе сопоставимы, что в естественных условиях микрососудов. Наконец, последняя работа характеризующих кровоток в квадратныхг прямоугольных микроканалов показали, что эти геометрии подходят для экспериментов реологические свойства крови 15.
Наконец, наш тест не предназначен для измерения, в изоляции, различные сотовые биофизические свойства, что приводит к окклюзии микрососудов. Такие методы, как атомно-силовая микроскопия, микропипетки стремление и оптического захвата были также характерны для этих типов экспериментов. Вместо этого, значение нашей микросистемы является ее способность резюмировать, одновременно и в рамках одной системы в пробирке, ансамбль физиологических процессов и биофизических свойств, в том числе молекулы адгезии выражения, аберрантных клеток крови, эндотелиальных взаимодействий клетки, агрегация клеток крови (например, тромбоз ), ячейка деформируемость, размер ячейки / форма, микрососудистых геометрии и гемодинамики, которые способствуют патологические микрососудистых межклеточных взаимодействий в различных болезненных состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Т. Хант, М. Розенблат, и лаборатория Лам за их советы и полезные обсуждения. Мы отмечаем поддержку Г. Spinner и Института электроники и нанотехнологий в Технологическом институте Джорджии. Финансовую поддержку для этой работы был предоставлен грант NIH K08-HL093360, UCSF REAC награду, развития наномедицины Центра NIH премии PN2EY018244, и финансирование из центра эндотелиальной клеточной биологии здравоохранения Детский Атланте.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
