Summary
Un método para la cultura de una monocapa de células endoteliales en toda la superficie interior en 3D de un dispositivo de microfluidos con microvascular del tamaño de los canales (<30 micras) se describe. Este
Abstract
Los avances en técnicas de microfabricación han permitido la producción de sistemas de microfluidos de bajo costo y reproducible para la realización de experimentos biológicos y bioquímicos en el 1,2 micro y nanoscales. Además, también se han microfluídica se utilizan específicamente para analizar cuantitativamente los procesos hematológicos y microvascular, debido a su capacidad de controlar fácilmente el entorno dinámico fluídico y condiciones biológicas 3-6. Como tal, los investigadores han utilizado más recientemente sistemas de microfluidos para estudiar la deformabilidad de las células sanguíneas, la agregación de células de sangre, el flujo sanguíneo microvascular, y la sangre endoteliales interacciones célula-célula 6-13. Sin embargo, estos sistemas de microfluidos o bien no incluyen células endoteliales cultivadas o eran más grandes que la correspondiente a la sizescale microvasculares procesos patológicos. Una plataforma de microfluidos con cultivos de células endoteliales, que recapitula la precisión celular, físico, y hemodynel medio ambiente amic de la microcirculación que se necesita para avanzar en nuestra comprensión de la fisiopatología subyacente biofísica de enfermedades hematológicas que involucran la microvasculatura.
Aquí se presenta un método para crear una "endotelizado" modelo in vitro de la microvasculatura, utilizando un proceso sencillo, solo la máscara de microfabricación en conjunción con las técnicas de cultivo de células endoteliales, para estudiar las interacciones patológicas microvasculares biofísicos que se producen en la enfermedad hematológica. Este "microvasculatura-en-un-chip" proporciona al investigador un sólido ensayo que se controla estrictamente biológica, así como las condiciones biofísicas y se maneja mediante una bomba de jeringa estándar y claro / microscopía de fluorescencia. Parámetros tales como las condiciones hemodinámicas microcirculación, el tipo de células endoteliales, el tipo de células sanguíneas (s) y la concentración (s), droga / concentración inhibitoria etc, todos pueden ser fácilmente controlado. Como tal, nuestro microsistema ofreceun método para investigar cuantitativamente los procesos de enfermedad en la que se altera el flujo microvascular, debido a alteraciones en la adhesión celular, la agregación y la deformabilidad, la capacidad disponible con los ensayos existentes.
Protocol
1. La fabricación de la Microdevice endotelial
- Crear una fotomáscara mediante la presentación de un equipo de diseño asistido (CAD) de dibujo del dispositivo de microfluidos a un vendedor de la máscara exterior. La máscara utilizada estaba compuesta de una capa de cromo sobre vidrio de sosa y cal. En este caso la anchura del canal de microfluidos fue de 30 micras.
- Limpiar una oblea de silicio al descubierto con piraña (10:1 relación de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno) durante 15 minutos y sumergir en ácido fluorhídrico durante 30 segundos. Enjuague con agua desionizada (DI) de agua durante aproximadamente 10 segundos.
- Usando una revestidora de giro, giro Microchem SU-8 2025 fotorresistente sobre la oblea a una altura de 30 micras. Por SU-8 2025, una velocidad de centrifugado de 3000 rpm se recomienda. Las otras viscosidades de SU-8 están disponibles, que alcanzará esta altura. Las instrucciones completas para el uso de SU-8 están disponibles en www.microchem.com
- Colocar la oblea con SU-8 sobre una placa caliente a 95 ° C durante5 minutos para eliminar el exceso de solvente.
Nota: Un horno se seque la oblea diferente a una zona de cocción y no es recomendable. - Coloque una máscara con la forma característica deseada sobre la oblea, y exponer a la luz UV (160 mJ / cm 2 medido a 365 nm) en un alineador de máscara (Karl Suss, MA-6). Esta cruz une el fotoresist.
- Colocar la oblea de nuevo en una placa caliente a 95 ° C durante 5 minutos adicionales para acelerar aún más la polimerización de SU-8.
- Sumergir la oblea en SU-8 Desarrollador, compuesto principalmente de PGMEA (propileno glicol metil éter acetato) durante 4 minutos para eliminar la no reticulado SU-8.
- Enjuague la oblea de nuevo desarrollo con 100% de alcohol isopropílico (IPA) durante 10 s. La oblea se puede secar con nitrógeno a presión o al permitir que el disolvente se evapore de la oblea en una campana de humos limpia durante varios minutos.
- Cinta de los bordes de la oblea en seco con estampado SU-8 en una placa de Petri para preventilar el movimiento.
- Aplicar 1 ml de Sigmacote a la oblea usando una pipeta, cubrir con la parte superior de la placa de Petri, y la oblea remolino para asegurar el revestimiento completo de la oblea, quitar la tapa, y permitir que la oblea que se seque durante varios minutos hasta que todo el disolvente se ha evaporado.
2. PDMS (polidimetilsiloxano) Preparación
- Mezcla PDMS polímero y el agente de curado en una proporción 10:1 (w / w) y eliminar las burbujas de aire utilizando un desecador de vacío. La longitud de tiempo necesario para desgasificar el PDMS varía en la fuerza del sistema de vacío disponible, pero normalmente oscila entre varios minutos a una hora. Para un plato de petri seis pulgadas sin previamente vertió PDMS, un volumen total de 60 ml de polímero se recomienda.
- Verter la mezcla sobre la oblea, aproximadamente 5 mm de espesor. También se vierte en un plato de fondo plano para crear una lámina delgada de PDMS, aproximadamente 1 mm de espesor. Curación a 60 ° C en un horno durante la noche.
- Con un cuchillo o un bisturí, cortar alrededor de la cured dispositivo de PDMS y sacarlo de la oblea. Además, cortar una hoja delgada de PDMS ligeramente mayor que el dispositivo.
- Crear orificios de entrada y salida en el dispositivo de PDMS utilizando un perforador 1,0 mm. Esto puede lograrse utilizando un tornillo de banco pasador, dispositivo de Harris Uni-Core, o similar.
- Limpie las superficies del dispositivo y la lámina con cinta adhesiva.
- El uso de un limpiador de plasma, exponer las superficies del dispositivo PDMS y PDMS hoja de plasma de oxígeno durante 30 s. El plasma de oxígeno crea especies reactivas en la superficie expuesta del PDMS que enlace cuando se pone en contacto físico.
- Conectar más pequeño tubo a una pequeña longitud (varios centímetros) de tubo grande, que a su vez está conectado a una jeringa con una aguja roma de punto, lleno de 50 mg / ml de fibronectina de plasma humano en PBS. El tubo y la aguja están dimensionados de tal manera que un ajuste de fricción se crea entre la tubería. Insertar más pequeño tubo en la entrada de PDMS y una microdispositivoplique presión a la jeringa para llenar los canales completamente con la solución de fibronectina y para crear una pequeña gota 100 l en el puerto de salida, para asegurar que los canales de permanecer húmedo. Incubar el dispositivo a 37 ° C durante 40-60 minutos.
- Conecte una jeringa llena con PBS fresco a la aguja de punta roma. Aplicar presión a la jeringa para enjuagar el dispositivo con PBS.
3. Sembrando el dispositivo de microfluidos con las células endoteliales
- Preparar 1.000.000 células / ml de células humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) en medios de crecimiento endoteliales con 8% de dextrano. Una gama de 500.000 a 2.000.000 células por mL ha sido utilizado con éxito. La adición de dextrano al medio de carga de células aumenta la viscosidad del fluido, lo que disminuye la velocidad de las células endoteliales al entrar en el sistema de microfluidos fibronectina recubierto. Esto, a su vez, aumenta la probabilidad de que las células se adhiere y la cultura con éxito dentro de la microdispositivo.
- Conecte la nueva jeringa y el tubo como en el paso 2.7. pero con un tubo más largo (aproximadamente 1 metro de longitud).
- Para optimizar el rendimiento de este sistema, es crítico en este punto para evitar cualquier fuga o burbujas en el sistema de perfusión entero; cualquier fuga de la solución o la presencia de burbujas en los medios va a cambiar el flujo y evitar la siembra con éxito de células endoteliales. Por lo tanto, ajustada de la tubería es esencial para eliminar las fugas entre las conexiones. Las burbujas en la jeringa y / o el tubo debe ser eliminada antes de células se introducen en el microdispositivo y el sistema de perfusión completa debe ser cebado con la solución de células antes de conectar el tubo a la microfluidos para evitar la introducción de burbujas de aire.
- Utilizando una bomba de jeringa, infundir suspensión de células en el dispositivo de PDMS en velocidad de flujo volumétrico de 1,23 l / min durante 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Los resultados óptimos se logran cuando la bomba de jeringa estaba en el misma altura que el dispositivo de PDMS. Para la entrada, el tubo más largo, que puede ser enrollada dentro de la incubadora, asegura que las células y los medios están adecuadamente calentado antes de entrar en contacto con el dispositivo. En nuestro sistema, la velocidad de flujo volumétrico de 1,23 l / min se aproxima a una velocidad medio de la corriente de ~ 1 mm / s en los más pequeños microcanales, correspondientes a una tensión de cizallamiento de ~ 1 dinas / cm 2 en aquellos canales que utilizan la sangre entera.
- Usando la bomba misma jeringa y el tubo largo, perfunden medio de crecimiento fresco durante 2-8 días a razón de 1,23 l / min. Un dispositivo exitoso tendrá una monocapa de células endoteliales que crecen en el interior del dispositivo dentro de 24-48 horas. Experimentos previos han demostrado que monocapas confluentes adecuadamente expresar VE-cadherina en las uniones célula-célula a través del dispositivo 14.
- Inyectar sangre o suspensión de células en el sistema para la experimentación.
4. Los resultados representativos
_content "> El uso de este protocolo, las técnicas estándar de microfabricación litográficas se utilizan para crear el molde necesario para producir los canales de microfluidos que fisiológicamente imitan la sizescale de la microvasculatura (Figura 1A). Utilizando una técnica de perfusión optimizado, las células endoteliales a continuación, las semillas y la cultura confluentemente toda la superficie interna del sistema de microfluidos el plazo de 24-48 horas de la siembra de células (fig. 1B). A medida que el sistema de microfluidos es transparente, el microdispositivo se puede colocar todo en un campo claro / platina del microscopio de fluorescencia para la imagen y la recopilación de datos.Nuestro sistema puede ser aplicado al estudio de enfermedades hematológicas que impliquen alteración de las propiedades biofísicas, como la enfermedad de células falciformes, en la que el aumento de la rigidez de los glóbulos rojos falciformes y la adhesión de leucocitos y células endoteliales aberrante contribuyen a la obstrucción microvascular. Un medicamento clínicamente aprobada, la hidroxiurea, alivia los síntomas, pero su direct efecto sobre el flujo microvascular es desconocido. Nuestro ensayo tiene en cuenta tanto la rigidez y la adhesión celular, y demuestra que la hidroxiurea aminora significativamente el flujo en la enfermedad de células falciformes (Figura 2).
Enfermedad de células falciformes es sólo un ejemplo de una aplicación para la microvasculatura-en-un-chip, ya que este sistema es ideal para estudiar cualquier proceso hematológico en el que las células sanguíneas interactuar con cada uno y otras células endoteliales en la microvasculatura. Otras aplicaciones clínicamente relevantes incluyen los trastornos inflamatorios, lesiones sepsis / pulmón, microangiopatías trombóticas, la malaria y la metástasis del cáncer, mientras que las aplicaciones más básicas incluyen la biología de leucocitos y la biología de células madre hematopoyéticas, entre muchos otros.
Figura 1. A) el primer dispositivo de microfluidos PDMS antes de endotelización. Aquí, el microdispositivo se inyecta ingenioh colorante de alimentos para ilustrar el diseño sizescale y en general del sistema. B) la microscopía de campo claro se muestra el sistema de microfluidos es completamente endotelizado plazo de 48 horas de la siembra de células utilizando el protocolo descrito aquí.
Figura 2. A) La microvasculatura-en-un-chip con microcanales se aproxima al tamaño de post-capilares vénulas (30 micras), el sitio de la mayoría de los eventos de células falciformes obstructivas microvasculares. La sangre entera de pacientes con anemia drepanocítica que recibieron hidroxiurea y de pacientes que no recibieron hidroxiurea se hace fluir a través de dos diferentes microvasculatura-en-un-chip de los dispositivos. B) Toda la sangre de pacientes con anemia de células falciformes que recibieron los flujos de hidroxiurea con relativa facilidad dentro de los microcanales endotelizado. C) En las condiciones hemodinámicas mismos, toda la sangre de pacientes con anemia drepanocítica que no recibieron hidroxiurea, sin embargo, muestra un flujo mucho más lento con microchannel obstrucción. El canal inferior está completamente obstruido sin flujo y las velocidades de flujo en los microcanales endotelizado otros son significativamente menores que en la condición hidroxiurea. La barra de escala en las tres imágenes es de 30 micras.
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Discussion
Nuestro sistema microdispositivo endotelizado es el más adecuado cuando se utiliza en conjunción con los experimentos in vivo, y su enfoque reduccionista puede ayudar a aclarar los mecanismos biofísicos de los procesos hematológicos que se observan en los seres humanos y modelos animales. Además, nuestro sistema no está exento de limitaciones. Por ejemplo, nuestros canales de microfluidos son cuadrados en sección transversal. Aunque técnicamente microcanales circulares se pueden fabricar 10,11, se optó por utilizar un procedimiento de fabricación más simple y estándar para permitir a otros investigadores a aplicar fácilmente este sistema para su propio trabajo. Además, la presencia de las células endoteliales cultivadas naturalmente "redondea" el lumen eficaz, permitiendo que el sistema sea más fisiológico. Además, nuestro modelo dinámico fluido revelan que las condiciones de flujo en nuestro sistema son comparables a la de la microvasculatura in vivo. Por último, el reciente trabajo que caracteriza el flujo de sangre en la plaza de und microcanales rectangulares ha demostrado que las geometrías son adecuados para los experimentos de reología de sangre 15.
Por último, nuestro análisis no se pretende medir, de forma aislada, distintas propiedades celulares de Biofísica que llevan a la oclusión microvascular. Las técnicas como la microscopía de fuerza atómica, la aspiración micropipeta, y la captura óptica han sido bien caracterizadas para esos tipos de experimentos. En cambio, el valor de nuestro microsistema es su capacidad para recapitular, al mismo tiempo y dentro de un único sistema in vitro, un conjunto de procesos fisiológicos y las propiedades biofísicas, incluyendo la expresión de moléculas de adhesión, sanguíneos aberrantes endoteliales las interacciones célula-célula, la agregación de células de la sangre (por ejemplo la trombosis ), deformabilidad celular, tamaño de la celda / forma, la geometría microvascular, y la hemodinámica, todo lo cual contribuye a las interacciones patológicas microvasculares celulares en estados de enfermedad diferentes.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a T. Hunt, M. Rosenbluth, y el Laboratorio de Lam por sus consejos y discusiones útiles. Queremos agradecer el apoyo de G. Spinner y el Instituto de Electrónica y Nanotecnología en el Instituto de Tecnología de Georgia. El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por una subvención del NIH K08-HL093360, premio UCSF REAC, un Centro de Desarrollo de Nanomedicina NIH Premio PN2EY018244, y la financiación del Centro para la Biología de las células endoteliales de la Salud de los Niños de Atlanta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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